Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur gleichzeitigen Erfassung von Co lokalisierte Elektroenzephalographie (EEG) und Multi-laminar lokales Feld bei einem anästhesierten Ratte. Eine Grat-Bohrung im Schädel für das Einfügen von einer Mikroelektrode erweist sich vernachlässigbar Verzerrung des EEG Signals zu produzieren.
Abstract
Obwohl Elektroenzephalographie (EEG) häufig als nicht-invasive Technik zur Erfassung von neuronalen Aktivitäten des Gehirns verwendet wird, ist unser Verständnis von der Neurogenese des EEG noch sehr begrenzt. Lokales Feld Potentiale (drängendere) über eine Multi-laminar Mikroelektrode aufgezeichnet bieten eine detailliertere Darstellung der gleichzeitigen neuronale Aktivität in verschiedenen kortikalen Schichten in der Großhirnrinde, aber die Technik ist invasiv. Kombination von EEG- und LFP-Messungen in einem präklinischen Modell stark Verständnis der neuronalen Mechanismen in der Generation der EEG-Signale, erleichtern und verbessern die Ableitung eines realistischeren und biologisch korrekt mathematischen Modells des EEG. Ein einfaches Verfahren für den Erwerb der gleichzeitigen und Co lokalisierte EEG und Multi-laminar LFP-Signale in den narkotisierten Nager wird hier vorgestellt. Außerdem untersuchten wir, ob EEG-Signale eines Bohrlochs gebohrt in den Schädel für das Einfügen von einer Mikroelektrode erheblich betroffen waren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bohrlochs einen vernachlässigbaren Einfluss auf EEG-Ableitungen hat.
Introduction
Es ist allgemein anerkannt, dass drängendere erfasst in erster Linie über Mikroelektroden die gewichtete Summe der synchronisierten exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Aktivitäten von lokalen pyramidale neuronalen Populationen1,2,3 widerspiegeln , 4. unsere neuere Forschungen gezeigt, dass das Profil des LFP-Signals in Komponenten von Hemmung und Erregung5,6getrennt werden könnte. Jedoch wie LFP normalerweise über ein invasives Verfahren gemessen wird, ist es nicht geeignet für die meisten Studien des menschlichen Gehirns.
EEG ist auf der anderen Seite eine nicht-invasive Technik zur Messung der elektrischen Aktivität des Gehirns. Es ist ein Diagnosewerkzeug für bestimmte Arten von neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie sowie als Recherche-Tool in menschliche kognitive Studien verbreitet. Trotz seiner Popularität ist eine große Einschränkung des EEG die Unfähigkeit, seine zeitliche Profile genau in Bezug auf die zugrunde liegende neuronale Signale7,8,9zu interpretieren.
Zunehmend werden mathematische Modelle des EEG entwickelt Verständnis vom Gehirn Funktion10,11,12,13,14,15. Die meisten bestehenden EEG-Modelle sind basierend auf passende Domain Frequenzeigenschaften des Modells vorhergesagt Ausgabe auf die EEG-Daten-Bandbreite während der spontanen Aktivität entwickelt, und sehr wenige EEG Modelle erzeugen realistische sensorische evozierte Potentiale. In diesem Zusammenhang bieten gleichzeitige Aufnahmen von EEG und LFP wichtige Erkenntnisse und Einschränkungen, für genauere mathematische Modelle des EEG zu entwickeln.
Um dieses Bedarfs für gleichzeitige Aufnahmen den neuronalen Ursprung des EEG weiter zu erkunden, entwickelten wir eine Methode um EEG und Multi-laminar LFP-Signale gleichzeitig im Neocortex der narkotisierten Ratte zu erfassen. Die Einrichtung ist ähnlich wie bei früheren gleichzeitige EEG/LFP-Studien in Primaten16,17. Wir untersucht die Wirkung eines Bohrlochs gebohrt in den Schädel auf EEG-Ableitungen, die rund um das Loch durch einen bilateralen EEG-Ableitungen (d. h., eine Halbkugel mit einem Grat Loch, die andere Hemisphäre intakt) in Ermangelung von sensorischen Vergleich die Stimulation. Unsere Ergebnisse zeigen, dass gleichzeitige EEG/LFP-Aufnahmen einfach und effektiv mit wenig EEG Signalverzerrung aus dem Grat Loch in den Schädel durchgeführt werden können.
Protocol
Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit geltenden britischen Home Office (Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act, 1986) und genehmigt von der Ethikkommission der Forschung an der University of Reading, UK.
(1) tierische Vorbereitung
Hinweis: Weibliche Lister Hooded Ratten wurden für alle Experimente verwendet. Dies ist ein Verfahren nicht überleben.
- Nehmen Sie die Ratte Gewicht im Labormaßstab.
- Die Ratte in eine Kammer mit 5 % Isofluran und ein Sauerstoff-Durchfluss von 1 L/min zu betäuben.
- Legen Sie die Ratte auf einer stereotaktischen Halter mit einem Papiertuch unter seinem Körper und mit seinen Zähnen ruht über die Snack-Bar... Das Papiertuch erleichtert das Einfügen von einem Wärmekissen (siehe Punkt 2.3) und während des Experiments Exkremente von der Ratte zu fangen.
- Isofluran kontinuierlich über eine Hartplastik Bugnase montiert auf der Nase-Klemme für Ratte-Adapter in einer Konzentration von 3 % mit einer Sauerstoff-Durchfluss von 0,5 L/min. Connect Kegel mit einem kleinen Tier Isoflurane Narkose System zu verwalten.
2. chirurgische Verfahren
- Einfügen Sie einer thermostatischen Heizkissen unter das Papiertuch, auf dem die Ratte ruht, sichern Sie die Ratte Kopf mit zwei Ohr-Bars und überwachen Sie die Körpertemperatur mit einem rektalen Thermometer zu.
- Die Ratte in den Kopf zu rasieren.
- Gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen gegen Hornhaut trocknen.
- Vor der Belichtung des Schädels, Lidocain Tropfen auf die Kopfhaut und massieren Sie es sanft in die Haut.
- Machen Sie einen Mittellinie Schnitt von ca. 2-3 cm auf der Kopfhaut mit einem Skalpell auf die Oberfläche des Schädels aussetzen.
- Trennen Sie vorsichtig die Temporalis Muskel Contra-seitliche Whisker-Pad aus dem Schädel mit einer Jacquette Scaler und ein paar gezackt und gebogene sezierenden Zange stimuliert werden. Reinigen Sie den Schädel mit Wattestäbchen nach Bedarf.
- Mit einem geflochtenen Seide, nicht resorbierbaren Naht den getrennten Muskel an der Kopfhaut mit einem festen Knoten zu binden und binden Sie dann die Naht an der stereotaktischen Rahmen18fest.
- Verwenden stereotaktischen Koordinaten Auffinden Fass Kortex, kaudalen, Bregma 2,5 mm und 6 mm lateral Mittellinie19. Zeichnen Sie einen Punkt an der Stelle des somatosensorischen Kortex mit einem Bleistift oder Marker.
-
Bohren Sie ein Grat Loch an der markierten Stelle mit einem zahnärztlichen Bohrer. Den Schädel verhindern eine Überhitzung während des Bohrens, gelten Sie sterile Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid) für Arbeitsbereich jedes 10-15 s. Der Bohrvorgang besteht aus folgenden 3 Schritten:
- Bohren Sie ein Loch mit < 2 mm Durchmesser in den Schädel mit einem Bohrer #4 (0,055 im Durchmesser). Achten Sie darauf, nicht in die Dura bohren.
- Verdünnen Sie den Boden des Loches, Transluzenz mit einem Bohrer #1/4 (0,019 im Durchmesser).
- Verwenden Sie eine 27 G Nadel um zu durchbohren die Dura um die Einfügung einer Mikroelektrode zu ermöglichen.
- Übertragen Sie die Ratte, gesichert auf einem stereotaktischen Rahmen, um einen Faradayschen Käfig montiert auf einer Vibration Isolation Workstation.
- Befestigen Sie eine Oximeter Sensors Klemme angeschlossen, ein Pulsoximeter Steuergerät an die Ratte Hinterpfote, die folgenden physiologischen Parameter kontinuierlich zu überwachen: Herzfrequenz, Atemfrequenz, arterielle Sauerstoffsättigung, Puls Ausdehnung und Atem Ausdehnung. Diese Parameter wurden kontinuierlich auf einem PC-Monitor, was die physiologischen Zustand und Narkosetiefe der Ratte angezeigt.
- Ersetzen die Hartplastik Bugnase für Isoflurane Verwaltung und die Nase-Klemme für Ratte-Adapter mit einer Microflex Verschnaufpause, ausgestattet mit einem transparenten weichen Nase Kegel ist geändert (Abbildung 1A), um einfach Whisker Stimulation auf der einen Seite die Whisker lassen Pad ohne Isofluran-Verwaltung.
- Fügen Sie zwei anregende Edelstahl-Elektroden am Whisker-Pad durch die Aussparung auf der Bugnase ausgesetzt.
- Schließen Sie die stimulierenden Elektroden an eine isolierte aktuelle Stimulator.
- Heben Sie die Haut von der Mittellinie des Halses mit Zange und machen eine 1 ~ 2 cm Schnitt mit der Schere bereit für die Platzierung von Referenzelektroden. Achten Sie darauf, nicht um das Muskelgewebe zu schneiden.
3. Co-lokalisierte EEG/LFP-Setup
- Reinigen und Trocknen des Schädels, die Umgebung des Bohrlochs mit einem Wattestäbchen.
- Legen Sie die EEG-Leitpaste vorsichtig auf einer flachen Seite einer EEG-Spinne-Elektrode. Lassen Sie ein kleines Loch frei von der EEG-Paste auf die Spinne Elektrode zu eine Multi-laminar Mikroelektrode das Loch passieren, ohne Kontakt mit der Paste und die Spinne Elektrode zu ermöglichen. Dies verhindert, dass elektrischen Kontakt zwischen der EEG-Elektrode und der Mikroelektrode.
- Richten Sie die Spinne Elektrode zum Grat Loch in den Schädel, mit der EEG-Paste mit Blick auf den Schädel.
- Drücken Sie vorsichtig die Spinne-Elektrode auf den Schädel, festen Kontakt mit dem Totenkopf über die EEG-Paste. Entfernen Sie Paste verdeckt des Bohrlochs mit einer Nadel auf eine Spritze.
- Entfernen Sie übermäßige EEG-Paste über die Peripherie der Spider Elektrode, so dass der Kontakt zwischen der Spinne-Elektrode und der Schädel auf die Größe der Elektrode (Abbildung 1 b) räumlich beschränkt ist.
Abbildung 1: allgemeine Setup für die gleichzeitige Aufnahme von EEG/LFP. (A) die Einrichtung besteht aus einer modifizierten Bugnase für Mühelosigkeit der Whisker Pad Stimulation Isoflurane Narkose, zwei anregende Elektroden in die Whisker eingefügt pad, eine Spinne Elektrode positioniert auf den Schädel über dem Fass Kortex Contra-Lateral, die stimulierenden Elektroden, einer Multi-Channel-Mikroelektrode eingefügt in die Rinde der Lauf durch die Spider Elektrode und Referenzelektroden in einen Schnitt sich die Ratte in den Nacken gelegt. (B) ein Blick durch das Mikroskop der Spider Elektrode sicher positioniert auf den Schädel durch EEG-Paste. Die Mikroelektrode wird in eine Grat-Bohrung in den Schädel unter der Spider Elektrode eingefügt. Die Kopfhaut wird durch chirurgische Thread (Naht) gebunden, der stereotaktischen Rahmen zurückgehalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Schmieren Sie EEG-Paste auf die Bezugselektrode für das EEG zu, und legen Sie es sicher innerhalb des Schnittes sich die Ratte in den Nacken.
- Schließen Sie die EEG-Elektroden an den Vorverstärker über eine passive Signal Splitter für niederohmige Signale (Abbildung 2). Sicherstellen Sie, dass die Impedanz der Spider Elektrode unter 5 kΩ ist. Wenn es nicht ist, gedrückt, überprüfen, dass die EEG-Paste in gutem Kontakt mit dem Totenkopf ist und die Elektrode fest um die EEG-Paste. Fügen Sie mehr EEG-Paste, falls erforderlich.
- Montieren Sie einen Mikromanipulator Arm auf der stereotaktischen Rahmen. Ein 16-Kanal akute Headstage sicher an der Mikromanipulator Arm befestigen schließen Sie eine linearen 16-Kanal-Mikroelektrode (100 µm-Abstand, Fläche von jeder Seite 177 µm2 an).
- Schmieren Sie EEG-Paste auf die Referenzelektroden für EEG und Mikroelektrode zu, dann legen Sie sie sicher in die Inzision (Abbildung 1A).
- Einstellen Sie den Winkel des Arms Mikromanipulator so, dass der Mikroelektrode senkrecht zur kortikalen Oberfläche ist. Dieser Winkel ist in der Regel zwischen 25-35 ° c.
- Absenken der Mikroelektrode unter dem Mikroskop Mikromanipulator Drehknöpfe, so dass die Spitze der Mikroelektrode sich an die kleine Öffnung am unteren Ende des Bohrlochs richtet bis die oberste Elektrode nur die kortikale Oberfläche dringt. Vorsicht ist geboten, um zu vermeiden, zwingt der Mikroelektrode auf die Oberfläche der Dura, da die Elektrode brechen würde.
- Paar der 16-Kanal-Mikroelektrode, einen Vorverstärker verbunden eine Dateneinheit Erwerb über ein Glasfaserkabel (Abbildung 2).
- Schalten der Vorverstärker, der Daten-Aufnahmeeinheit und der Computer an das Gerät angeschlossen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Stimulator".
- Fügen Sie der Mikroelektrode normalerweise an die kortikalen Oberfläche durch langsames Drehen des z-Achse-Knopfes der Mikromanipulator bis zu einer Tiefe von 1.500 µm-20.
- Mikro-stellen Sie die Tiefe durch die Anwendung eines Zuges des Stimulus Whisker-Pad und Beobachtung der 16-Kanal evozierten LFP auf einem PC-Monitor mit Hilfe der Software die Aufnahmeeinheit Daten auf dem PC installiert. Drehen Sie vorsichtig den z-Knopf auf dem Mikromanipulator, bis die höchste Amplitude des evozierten LFP auf Kanal 7 auftritt (wie dies deckt sich mit Schicht IV im Kortex).
Hinweis: Ipsi-Lateral EEG Elektrode Setup: für einige Versuche, eine zweite Spinne-Elektrode wurde darauf gelegt, der Ipsi-lateralen Seite der intakten Schädel über dem Fass Kortex. Dieses Setup erlaubt bilateralen EEG Aufnahme in den Ruhezustand zu untersuchen, die Wirkung des Bohrlochs auf das EEG-Signal.
Hinweis: Das chirurgische Vorgehen zum Einrichten der EEG-Elektrode ist identisch mit oben beschrieben, außer dass bei Schritt 2.6, Temporalis Muskel auf jeder Seite des Kopfes war sorgfältig getrennt vom Schädel, wieder vernäht und sicher an die entsprechende Seite gebunden der stereotaktischen Rahmen.
Hinweis: Das gleichzeitige EEG/LFP-Setup ist auch identisch mit oben beschrieben, mit einem zusätzlichen Schritt, dass eine zweite Spinne-Elektrode ist mit der EEG-Paste geladen, dann fest an den Schädel über Ipsi-Lateral Fass Kortex drückte.
Abbildung 2: Ein Signal-Ablaufdiagramm. Die Ratte ist in einen Faradayschen Käfig platziert. Die stimulierenden Elektroden erhalten Befehle aus der Stimulator Box gesteuert durch Erwerb Dateneinheit durch seine Software auf einem PC installiert. Die neuronalen Signal von der Mikroelektrode aufgezeichnet wird auf einen Vorverstärker der Faraday-Käfig übertragen. Die neuronalen Signal aufgezeichnet von der EEG-Sonde wird an den Vorverstärker durch einen Signal-Splitter übertragen. Der Vorverstärker ist mit der Aufnahmeeinheit Daten außerhalb der Faraday-Käfig über ein Glasfaserkabel verbunden. Die neuronalen Daten werden dann auf einem lokalen Laufwerk auf dem PC gespeichert, während sie auch auf einem PC-Monitor angezeigt werden können. Eine mobile kleine Tier Isofluran-System verwaltet Isofluran von außerhalb der Faraday-Käfig. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
4. elektrische Stimulation und neuronale Aufnahmen
Hinweis: Die Sampling-Frequenz für alle neuronalen Daten ist 24,41 kHz mit 16-Bit-Auflösung. Ein Prozess besteht aus eine einzelne elektrische Stimulation zu Beginn der Studie. Jeder Test dauert 10 s, die auch die inter-Stimulus-Intervall (ISI). Jeder Reiz ist ein quadratischer Stromimpuls von 1,2 mA dauerhafte 0,3 ms für bilaterale Experimente, um die Wirkung des Bohrlochs, kontinuierliche Ruhezustand 250 untersuchen s werden ebenfalls aufgezeichnet.
- Öffnen Sie die Recording-Software auf dem Computer im Einsatz.
- Laden Sie die richtige Schaltung für das Experiment, indem Sie "Projekt laden..." aus dem Dropdown-Menü "OpenProject". Ein neues Fenster ("WorkBench") erscheint (Abbildung 3).
Abbildung 3. Eine Anzeige der GUI-Software für die Daten-Übernahme-Einheit Es ermöglicht die entsprechende Schaltung hochgeladen werden, Stimulationsparameter eingestellt werden und Daten erfasst und visualisiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Erstellen Sie ein neues Verzeichnis (genannt einen "Tank" von der Software), um neuronale Aufnahmen zu speichern.
- Klicken Sie auf "Datei" aus dem oberen Bereich des Fensters, und wählen Sie "Daten-Task-Management". Es erscheint ein neues Fenster ("Tank Management").
- Im Fenster "Tankmanagement" Drücken der rechten Taste der Maus, um ein Menü anzuzeigen. Wählen Sie 'Erstellen neuer Tank'. Ein weiteres neues Fenster ("erstellen Sie Daten-Tank") erscheint.
- Wählen Sie im Fenster "Daten-Tank erstellen" den Pfad, wo Sie planen, ein neues Datenverzeichnis zu erstellen, und geben Sie den Namen des neuen Verzeichnisses. Dann drücken Sie "OK". Dieses Fenster verschwindet.
- Das neue Verzeichnis erscheinen im Fenster "Tankmanagement" sondern in grau. Registrieren Sie dieses Verzeichnis mit der rechten Maustaste darauf, und wählen Sie "Registrieren Tank" aus dem Dropdown-Menü. Ein roter Stern und ein grüner Pfeil erscheint links neben dem neuen Verzeichnis Namen die jetzt in schwarz (Abbildung 4).
- Abmelden Sie alle bisherigen Verzeichnisse nicht in Gebrauch indem mit der rechten Maustaste im Fenster "Tank Management" und "Tank-Liste aktualisieren" im Dropdown-Menü.
- Klicken Sie auf "OK" um das Fenster "Tank-Verwaltung" zu verlassen.
Abbildung 4: Anzeige der Software GUI zeigt ein Datenverzeichnis der eingetragenen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Registrieren Sie das neue Verzeichnis in "Geltungsbereich" neuralen Signale während Tests angezeigt.
- Klicken Sie auf das Symbol "Rahmen" im Fenster "OpenProject". Es erscheint ein neues Fenster ("Scope").
- Rechtsklick der Maus im Fenster "Rahmen" und "Tank-Liste aktualisieren" im Dropdown-Menü auswählen. Das neue Verzeichnis Name wird in grau angezeigt.
- Klicken Sie auf das neue Verzeichnis. Ein roter Stern und ein grüner Pfeil erscheint links neben dem neuen Verzeichnis Namen die jetzt in schwarz.
- Einrichten der experimentellen Parameter für die Datenerfassung im Fenster "WorkBench" durch einen Klick auf "Setup" aus dem oberen Bereich des Fensters. Ein neues Fenster wird angezeigt. Wählen Sie "Schleife zu fegen", legen Sie die Länge des Versuchs und die Anzahl der Versuche aufgezeichnet werden.
- Überprüfen Sie, dass der Stimulator-Box eingeschaltet ist.
- Drücken Sie die "Record" Taste im Fenster "WorkBench". Ein neues Fenster wird angezeigt. Geben Sie den Namen der Datendatei, die Sie wollen sparen für die experimentelle laufen aber nicht schlagen die return-Taste zu diesem Zeitpunkt als EEG Aufnahme Parameter müssen eingerichtet werden.
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Richten Sie die EEG-Aufnahme-Parameter über die grafische Benutzeroberfläche (GUI) auf den Vorverstärker. Berühren Sie den Bildschirm (irgendwo) des Vorverstärkers, um den Bildschirm aufzuwecken. Wählen Sie "Entsperren" entsperren die Anzeige (Abbildung 5).
- Drücken Sie das linke Icon in der 2: EEG "Panel. Ein neues Display erscheint.
- Drücken Sie die "Kupplung" und wählen Sie 'AC'.
- Drücken Sie "Ref-Modus" und wählen Sie "Local".
- Drücken Sie "Samp Rate" und wählen Sie 25 KHz ".
- Drücken Sie "OK", um die ursprüngliche Anzeige zurückzukehren.
Abbildung 5: die GUI auf dem Vorverstärker. EEG-Aufzeichnung Parameter (z.B., Sampling-Frequenz und verweisenden wünschen) eingestellt werden können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Überprüfen Sie die Impedanz des EEG Wortanzahl durch Drücken das mittlere Symbol in die 2: EEG "Panel. Wenn zu hoch, fügen Sie mehr EEG-Paste auf die Sonde. Drücken Sie "OK", um die ursprüngliche Anzeige zurückzukehren.
- Warten Sie 20 s zu vermeiden, Aufnahme der ersten Fluktuation der EEG-Ableitungen.
- Gehen Sie zurück an den PC Monitor (nach 20 s Wartezeit) und drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur. Das EEG und die LFP-Signale werden aufgezeichnet.
(5) Datenanalyse
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Vorverarbeitung der evozierten LFP und EEG Signale auf einer Studie von Testversion Basis anhand der folgenden Schritte.
- Verschieben Sie wieder die neuronalen Daten in der Zeit von 20 Proben (entspricht 0,82 ms). Dies ist die Verzögerung durch die Schaltung verwendet, um neuronale Datenerfassung TDT selbst produziert. Durch die Verlagerung der Daten, wird die Stunde Null-Punkt auf den Ausbruch des Reizes ausgerichtet.
- Entfernen Sie das Reiz-Artefakt ersetzt die neuronalen Daten von 0 bis 1 ms mit einer geraden Linie verbinden die Daten zeigen bei 0 ms mit den jeweiligen Datenpunkt auf 1 ms.
- Null-Mittelwert jeder Prüfung durch Subtraktion den Mittelwert von Nervensignalen 200 ms vor Reiz auftreten.
- Tiefpass-Filtern der Daten unterhalb von 800 Hz mit einer 4te Ordnung Butterworth IIR Art Filter in beide Richtungen um zu vermeiden, Einführung einer zeitlichen Verschiebung in den Daten.
- Richten Sie die Multi-laminar Daten über Tiere. Für jedes Tier LFP Daten, gelten die Inverse aktuelle Quelle Dichte (Spline iCSD, Quelle Radius R = 0,5 mm) Analyse21 mit einem Gauß-Filter (λ = 50 µm), um die Schicht zu lokalisieren sinken IV1, die durch die größte negative Spitze an einer kortikalen auftretenden gegeben ist Tiefe unter der pial Oberfläche innerhalb der ersten 15 ms Impuls auftreten. Der CSD und die entsprechenden LFP Daten werden dann entsprechend ihrer Spüle Standorten über Tiere ausgerichtet. Das gemeinsame Waschbecken befindet sich in Schicht IV, ~ 600 µm unterhalb der pial Oberfläche.
- Nach dem ausrichten verwenden Sie 2, 7 und 12 der neu ausgerichteten LFP als Vertreter der neuronalen Antworten von den Supragranular, körnig, und Infragranular Schichten, bzw. im Fass Kortex.
- Berechnen Sie der Mittelwert LFP und EEG hervorgerufen durch Mittelung der vorverarbeiteten Daten über 100 Versuche.
- Um die Wirkung des Bohrlochs auf das EEG zu untersuchen, signalisiert Down-Probe das EEG 1.000 Hz und berechnen die spektrale Leistungsdichte (PSD) für die Contra-laterale (mit einem Loch im Schädel) und Ipsi-Lateral (intakt Schädel) Spider Elektrode Aufnahmen über einen Zeitraum von 250 s der Ruhezustand. PSD errechnet von 0,1-100 Hz in Matlab mit Hilfe der Funktion "Pmtm" basiert auf der multitaper-Methode-22.
- Teilen Sie den Frequenzbereich in den folgenden bekannten Frequenzbändern: Delta (δ): 0,1-4 Hz, (Theta): 4-8 Hz, Alpha (α): 8-13 Hz, Beta (β): 13-31 Hz, Gamma (γ): 31-100 Hz. berechnen Sie die durchschnittliche PSD innerhalb jedes Band.
- Innerhalb jedes Frequenzband berechnen Sie normalisierten Differenz in PSD, Perr, zwischen der Contra- und das Ipsi-Lateral-EEG unter Verwendung der Gleichung:
wo Pc und Pich Durchschnitt PSD der Contra - und Ipsi-seitlichen EEG, bzw. im Frequenzband von Interesse sind. - Innerhalb jedes Frequenzband führen Sie einen One-Sample t-Test, um die Hypothese zu testen, gibt es keinen signifikanten Unterschied (bei Signifikanzniveau 0,05) zwischen der PSD das EEG-Signal aus den beiden Hemisphären aufgenommen.
Representative Results
Daten von 4 Ratten wurden gemittelt, um meine Zeitreihen gegebenenfalls zu erhalten. Die Amplitude der evozierten EEG-Reaktion, auch bekannt als das Ereignis im Zusammenhang mit Potenzial (ERP), ist in der Regel viel kleiner als die von der LFP. Abbildung 6 zeigt die durchschnittliche ERP und LFP in Supragranular, körnig, und Infragranular Schichten des Cortex Fass bzw.. Die Fehler-Band in jeder Parzelle ist der entsprechende Standardfehler. Es ist ersichtlich, dass ERP ca. 10 Mal kleiner als die evozierten LFP ist.
Abbildung 6: bedeuten (n = 4) neuronale Signale von ERP, Supragranular, körnig, und Infragranular LFP. Schatten zeigt Standardfehler. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Vergleiche die zeitliche Dynamik des ERP- und LFP sind in Abbildung 7gezeigt. Direkte Überlagerung von ERP- und Supragranular LFP in Abbildung 7A zeigt die Reihenfolge der Amplitude Unterschiede zwischen diesen beiden Arten der neuralen Signale. Um die zeitliche Dynamik zu vergleichen, sind ERP- und LFP in Bezug auf ihre negativen Höhepunkt Amplitude normiert. Abbildung 7 b und 7 C zeigen, dass die normalisierten ERP die normalisierte Supragranular LFP und normalisierte granulare LFP, bzw. überlagert.
Es ist aus Abbildung 7 b erkennbar, dass die Gipfel der P1 und N1 für ERP als die entsprechenden Gipfel der LFP in der Supragranular Schicht mehr verzögerte sind. Die zeitliche Profile dieser zwei neuronale Signale sind jedoch ähnlich, mit P1 N1 vor. Auf der anderen Seite, dem zeitlichen Verlauf des ERP unterscheidet sich deutlich von derjenigen der (Körnerschicht IV des Fasses Kortex) LFP (Abbildung 7). Vor allem sind sie keine Spiegelbilder von einander, mit körnigen LFP dominiert durch einen einzigen negativen Spitzenwert (widerspiegelt eine große Waschbecken im kortikalen Schicht IV), während ERP in erster Linie aus zwei Spitzen mit entgegengesetzter Polarität bestand.
Abbildung 7: Vergleich der zeitlichen Dynamik des ERP- und LFP. (A) ERP (durchgezogene Linie) mit Supragranular LFP (gestrichelte Linie) überlagert. Schatten zeigt Standardfehler. (B) normalisiert ERP (durchgezogene Linie) überlagert mit normalisierten Supragranular LFP (gestrichelte Linie). (C) normalisiert ERP (durchgezogene Linie) überlagert mit normalisierten granulare LFP (gestrichelte Linie). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Das ERP-Signal wurde über eine Spinne Elektrode platziert auf den Schädel mit einem Grat Bohrung hinein gemessen. Um die Wirkung des Lochs auf EEG-Ableitungen zu untersuchen, wurde eine weitere Spinne Elektrode auf den intakten Schädel oben Ipsi-Lateral Barrel Cortex platziert. Darauf wurde geachtet, um sicherzustellen, dass die Impedanzen der beiden Spider Elektroden in der Größenordnung vergleichbar waren, durch Anpassung der Höhe der EEG-Paste verwendet. Daten aus vier Ratten (die nicht die gleichen Ratten verwendet wurden oben) werden hier vorgestellt.
Abbildung 8 zeigt die gleichzeitige ruhenden Zustand EEG-Ableitungen von beiden Elektroden eine Ratte mit 100 s in Abbildung 8Aangezeigten Daten und die Daten in den rechteckigen Rahmen (20 s) sind in Abbildung 8 berweitert. Die zwei EEG-Signale variieren Co weitgehend ähnliche Reichweite der Amplitude. Abbildung 9 zeigt die PSD der vier Ratten, mit der oberen Zeile mit einer linearen Skala auf der Frequenzachse und die untere Zeile mit einer logarithmischen Skala auf der Frequenzachse um eine erweiterte Ansicht im unteren Frequenzbereich zu bieten. Aus Abbildung 9scheinen es nicht zu konsistenten Bias in der PSD über Themen. Dies wurde bestätigt durch eine Probe t-Tests auf die normalisierten Unterschiede in der gemittelten PSD in den fünf Frequenzbändern in Abbildung 10dargestellt. Keiner der normalisierten PSD Unterschiede in dieser Frequenzbänder unterschieden sich signifikant von Null (p = 0,32, 0,46 0,85, 0,69 und 0,97, beziehungsweise).
Abbildung 8: bilateralen EEG-Ableitungen. (A) Schädel EEG Aufnahme während der Ruhezustand mit einem Grat-Loch in den Schädel (schwarz) und eine simultane EEG-Aufzeichnung auf der gegenüberliegenden Hemisphäre mit intakten Schädel (grau). (B) erweiterte Anzeigen der Wellenformen innerhalb des rechteckigen Rahmens in (A). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: spektrale Leistungsdichte (PSD) die Contra-(blau) und das EEG Ipsi-Lateral (rot). Jede Spalte zeigt die PSD für eine Ratte. Die oberen Platten verwenden lineare Frequenzskala, während die unteren Verkleidungen logarithmischen Frequenzskala verwenden, damit die PSD im unteren Frequenzbereich visualisiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10: Gruppe Analyse. Unterschied zwischen der Contra- und Ipsi-Lateral PSD mit fünf Frequenzbänder normalisiert: Delta, Theta, Alpha, Beta und Gamma. Jeder Balken zeigt die mittlere normalisierte Unterschiede innerhalb des Frequenzbandes mit der Standardfehler der Fehlerbalken dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Wir haben ein experimentelles Verfahren zur gleichzeitigen Erfassung von Co lokalisierte EEG und LFP-Signale ein Isofluran narkotisierten Ratte in Reaktion auf die Whisker Pad Stimulation beschrieben. Eine Mikroelektrode wurde in der Großhirnrinde durch eine Öffnung in der EEG-Spinne-Elektrode eingefügt, die mit einem Grat-Loch in den Schädel gebohrt ausgerichtet war. Die Elektrode wurde an den Schädel durch eine leitfähige gesichert und Klebstoff EEG einfügen23. Die Bugnase für die Verwaltung von Isofluran verwendet wurde geändert, so dass stimulierende Elektroden in die Whisker-Pad mit Leichtigkeit eingesetzt werden könnte.
Die EEG-Paste war effektiv bei der Montage der Spider Elektrode fest mit dem Schädel und bietet hervorragende elektrischen Leitfähigkeit experimentelle tagsüber ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Anwendung der Paste. Es ersetzt die unerwünschte Verwendung von Leim, die Peripherie der Spider Elektrode an den Schädel zu beheben, wie Kleber nicht leitend ist und die Impedanz der Elektrode zu erhöhen kann, wenn es zwischen dem Schädel und der Elektrode läuft. EEG-Paste hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber EEG-Gel, das ist schwierig, Form um des Bohrlochs und im Experiment, was zu schlechten EEG-Signale austrocknen kann.
Da die Ratte in einem Faraday-Käfig platziert wurde, war elektrisches Rauschen aufgrund der Umgebung stark gedämpft. Allerdings war der neuronalen Signal manchmal immer noch ziemlich laut. In den meisten Fällen war dies durch die Bezugselektrode nicht richtig positioniert und musste daher neu eingestellt werden oder mehr EEG verursacht Paste verwendet. Ein weiteres häufiges Problem war, dass die evozierte LFP kleine Amplitude. Dies könnte aufgrund der Mikroelektrode nicht in der Mitte der kortikalen Region aktiviert durch die stimulierenden Elektroden positioniert sein. Statt neu einfügen der Mikroelektrode, die mehr die lokalen Nervenzellen schädigen könnte, haben wir in der Regel die Position der stimulierenden Elektroden in die Whisker-Pad bis eine vernünftige Amplitude von der LFP angepasst (> 3 mV) konnten beobachtet werden.
Eine der Beschränkungen der Technik ist die schlechte räumliche Auflösung von der Spinne-Elektrode, die einen Durchmesser von 6 mm hat. Verglichen mit der Größe des Schädels die Ratte ist groß. Leider ist die Spinne Elektrode verwendet hier den kleinsten zur Verfügung zu erwerben. Es werden wünschenswert, den Durchmesser der Spider Elektrode auf 2-4 mm zu reduzieren, wodurch sich die räumlichen Besonderheiten der EEG-Ableitungen, der Vergleich zwischen das EEG-Signal und die Supragranular LFP signal weniger zweideutig.
Mehrere wichtige Schritte im Protokoll bedürfen besonderer Aufmerksamkeit. Die erste ist die Einfügung der Mikroelektrode durch des Bohrlochs. Wie die Dura ansonsten intakt ist, ist die Genauigkeit der Einfügung entscheidend. Ein leichter Widerstand an der Spitze der Elektrode bedeutet normalerweise, dass die Elektrode nicht korrekt positioniert ist. Es muss angehoben werden, Lage angepasst und wieder eingefügt. Die zweite ist die Position des Kegels Nase auf die Ratte. Es darf nicht zu locker, wie Isoflurane aus dem Konus entweicht. Es muss auch nicht zu eng sein, da dies die Nasenlöcher der Ratte behindern und Atembeschwerden verursachen. Besondere Aufmerksamkeit ist auch erforderlich, um sicherzustellen, dass die Amplitude der EEG-Aufzeichnung viel kleiner ist (in der Regel 5 bis 10 Mal kleiner) als die LFP-Top-Channel-Aufnahme. Wenn sie ähnlich sind, ist es ein Hinweis darauf, dass die EEG-Sonde in direktem oder indirektem Kontakt mit der Mikroelektrode getreten ist. Ein indirekten Kontakt wird in der Regel durch die zerebralen spinalen Flüssigkeit (CSF), die manchmal das Loch füllt in den Schädel gebohrt. Die Leitfähigkeit des CSF ist in der Regel 100 Mal, dass der Schädel24,25. Daher, wenn das Niveau der CSF innerhalb des Bohrlochs hoch genug ist, kann es machen Kontakt mit der Spinne-Elektrode. Um dies zu vermeiden, sollte das Loch mit super saugfähige Baumwolle Schwämme wie Absorption Spears häufig gereinigt werden.
Die Wirkung eines Bohrlochs (Durchmesser < 2 mm) in den Schädel auf das EEG Aufnahmen rund um das Loch wurde untersucht, indem eine andere Spinne-Elektrode auf der intakten Schädel auf Ipsi-Lateral Barrel Cortex damit bilateralen EEG-Ableitungen verglichen werden könnte. Die Ergebnisse in Abbildung 9 und Abbildung 10, schlagen die Wirkung auf das Signifikanzniveau 0,05 unbedeutend sein. Andere Faktoren, die die Amplitude des EEG gehören wie auch die EEG-Paste war in Kontakt mit den Schädel, wie fest die Elektrode, die Paste gedrückt wurde und die räumliche Ausdehnung der EEG-Paste auf dem Schädel.
Es lohnt sich auch zu beachten, dass das Protokoll hier beschriebenen Schädel EEG aufgezeichnet die unterscheidet sich von Scalp EEG in menschlichen EEG-Studien verwendet. Die Kopfhaut wirkt wie ein Widerstand oder ein Tiefpass-Filter, der das Signal-Rausch-Verhältnis des EEG Aufnahme weiter reduzieren wird.
Zu guter Letzt die zeitliche Dynamik des ERP und derjenigen der evozierten LFP über die kortikalen Schichten im Vergleich zufolge somatosensiblen evozierten Potentiale besser widerspiegelt die LFP in der Supragranular Schicht der Rinde als in das Granulat und Infragranular Schichten. Dies ist in Übereinstimmung mit unserer früheren Arbeit6, zeigen, dass das erste Segment (P1) des ERP-im Zusammenhang mit der Rückkehr aktuelle infolge des Zuflusses der erregenden synaptischen aktuelle auftretenden in der Körnerschicht während der anschließenden abnimmt) N1) in ERP kann auf die verspätete Ankunft der Thalamische afferenten zu kortikalen Schichten II/III und/oder Feedforward Signale aus tieferen kortikalen Schichten bezogen werden. Zusammenfassend, gleichzeitige Aufnahmen des EEG/LFP Verständnis der neuronalen Genese des EEG, erleichtern und verbessern die mathematische Modellierung des EEG in Bezug auf neuronale Signale über die kortikalen Schichten.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten danken Andrew Cripps und BioResource Einheit an der University of Reading. Diese Forschung wurde finanziert durch die BBSRC (Anzahl zu gewähren: BB/K010123/1). Daten im Zusammenhang mit diesem Werk ist frei von Y.Z (ying.zheng@reading.ac.uk) verfügbar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female Lister Hood rats | Charles Rivers | ||
| Spider electrode | Unimed Electrode Supplies Ltd | SCS24-426 | |
| EEG paste: Ten20 | Unimed Electrode Supplies Ltd | 10-20-S | |
| Stereotaxic holder with dual micromanipulator arms: Dual Manipulator Stereotaxic Frame with 18° Ear Bars | WPI (World Precision Instruments) | 502603 | |
| Isoflurane | National Vet Services Limited | 50878 | |
| Hard plastic nose cone: Anasthesia Gas Mask for Rat | WPI | 502054 | |
| Small animal isoflurane anaesthetic system | WPI | EZ-B800A | |
| Thermostatic heating pad: Rat Blanket System 230V | Harvard Apparatus UK | 50-7221-F | |
| Ophthalmic ointment: Optixcare eye lube | Viovet | 203865 | |
| Lidocaine Hydrochloride (Injection 2%) | Larkmead Vets | ||
| Jacquette Scaler #1SSE, 18cm, Hollow | WPI | 503421 | |
| Serrated and curved dissecting forceps | WPI | 15915 | |
| Braided silk, non-absorbable suture: Mersilk Suture W502H | National Vet Services Limited | 153746 | |
| Dental drill: BONE MICRO DRILL SYST 230 VAC | Harvard Apparatus UK | 72-4860 | |
| Sterile Saline: Sodium chloride 0.9% | Animalcare Ltd | 14K26BT | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #4 | Harvard Apparatus UK | 72-4958 | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #1/4 | Harvard Apparatus UK | 72-4962 | |
| Faraday cage | Newport Corporation | VIS-FDC-3600 | |
| Vibration isolation workstation: Vision IsoStation | Newport Corporation | M-VIS3660-RG4-325A | |
| Oximeter Control Unit and sensor: MouseOxPlus, Starr Life Sciences Corp. | WPI | O15001 | |
| Transparent soft nose cone: Microflex Non-Rebreathing Unit with a Rat Nosecone | WPI | EZ-103A | |
| Stainless steel stimulating electrodes | PlasticsOne | E363/1/SPC | |
| Isolated current stimulator | Made in House | ||
| 16-channel micro-electrode, 100 μm spacing, area of each site 177 μm2 | NeuroNexus | A1x16-10mm-100-177-A16 | |
| 16-channel acute headstage | Tucker David Technologies Inc., TDT | RA16AC-Z | |
| Pre-Amplifier: Z-Series 64-Channel Neuro-Digitizing Preamp | TDT | PZ5-64 | |
| Passive signal splitter: 32-Channel Splitter Box for PZ5 | TDT | S-BOX_PZ5 | |
| Data acquisition unit: RZ2 BioAmp Processor. Z-Series 4-DSP ultra high performance processor | TDT | RZ2-4 | |
| Software for Neurophysiology: OpenEX | TDT | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Absorption spears | Fine Sicence Tools | 18105-01 |
References
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