Summary
Denne protokol beskriver en simpel metode til samtidige optagelse af co lokaliserede electroencefalografi (EEG) og multi-laminar lokale felt potentiale i en bedøvede rotte. En burr hul boret i kraniet for indsættelse af en mikroelektrode er vist sig at producere ubetydelig forvrængning af EEG-signalet.
Abstract
Selvom electroencefalografi (EEG) er udbredt som en non-invasiv teknik til at optage neurale aktiviteter i hjernen, er vores forståelse af neurogenese af EEG stadig meget begrænset. Lokale felt potentialer (LFPs) registreres via en multi-laminar mikroelektrode kan give en mere detaljeret redegørelse for samtidige neurale aktivitet på tværs af forskellige kortikale lag i neocortex, men teknikken er invasive. Kombinere EEG og LFP målinger i en præ-klinisk model kan væsentligt forbedre forståelsen af de neurale mekanismer, der er involveret i generation af EEG-signaler, og lette afledning af en mere realistisk og biologisk præcise matematiske model af EEG. En enkel procedure for at erhverve samtidige og co lokaliserede EEG og multi-laminar LFP signaler i den bedøvede gnaver præsenteres her. Vi undersøgte også, om EEG-signaler var påvirket væsentligt af en burr hul boret i kraniet for indsættelse af en mikroelektrode. Vores resultater tyder på, at burr hul har en ubetydelig indvirkning på EEG optagelser.
Introduction
Det er generelt accepteret, at LFPs optaget via microelectrodes primært afspejler den vægtede sum af synkroniserede excitatoriske og hæmmende synaptic aktiviteter pyramideformet neurale lokalbefolkningerne1,2,3 , 4. vores nyere forskning påvist, at profilen af LFP signal kunne opdeles i dele af excitation og hæmning5,6. Men LFP er normalt målt via en invasiv procedure, det er ikke egnet til de fleste undersøgelser af den menneskelige hjerne.
På den anden side er EEG en non-invasiv teknik til måling af den elektriske aktivitet i hjernen. Det er almindeligt anvendt som en diagnostisk redskab for visse former for neurologiske sygdomme som epilepsi, og som et analyseværktøj i menneskelige kognitive undersøgelser. På trods af sin popularitet er en stor begrænsning af EEG manglende evne til at fortolke dens tidsmæssige profiler netop med hensyn til de underliggende neurale signaler7,8,9.
I stigende grad er matematiske modeller af EEG udviklet til at forbedre forståelsen af hjernens funktion10,11,12,13,14,15. De fleste af de eksisterende EEG modeller er udviklet på grundlag af passende frekvens domæne Karakteristik af modellen forudsagde output til EEG data spektrum i løbet af spontan aktivitet, og meget få EEG modeller kan generere realistiske sensory evoked potentials. I denne forbindelse vil samtidige optagelser af EEG og LFP give vigtig indsigt og begrænsninger for at udvikle mere præcise matematiske modeller af EEG.
For at imødegå dette behov for samtidige optagelser til at udforske de neurale oprindelsen af EEG, udviklede vi en metode for at registrere samtidig EEG og multi-laminar LFP signaler i neocortex af den bedøvede rotte. Opsætningen er lig tidligere samtidige EEG/LFP undersøgelser udført i primater16,17. Vi yderligere undersøgt effekten af et burr hul boret i kraniet på EEG optagelser omkring hullet, ved at sammenligne bilaterale EEG optagelser (dvs.en halvkugle med en burr hul, den anden halvkugle intakt) i mangel af sensoriske stimulation. Vores resultater viser, at samtidige EEG/LFP optagelser kan udføres enkelt og effektivt, med lille EEG signalforvrængning fra burr hul i kraniet.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i henhold til de britiske Home Office forordninger (dyr (videnskabelige procedurer) Act, 1986) og godkendt af en videnskabsetisk komité på University of Reading, UK.
1. animalsk forberedelse
Bemærk: Kvindelige Lister hætteklædte rotter blev brugt til alle eksperimenter. Dette er en ikke-overlevelse procedure.
- Optage rottens vægt på laboratorie plan.
- Bedøver rotte i et kammer med 5% isofluran og en ilt strømningshastigheden af 1 L/min.
- Placere rotten et stereotaxisk holderen med et stykke køkkenrulle under sin krop og med sine tænder, hvilende via bid bar til... Papir håndklæde vil lette indsættelsen af en varme-pad (Se trin 2.3) og fange alle ekskrementer fra rotten under eksperimentet.
- Administrere isofluran løbende via en hård plast næsen kegle monteret på den næse klemme til rotte adapter i en koncentration på 3% med en ilt flow af 0,5 L/min. Connect kegle til et lille dyr isofluran bedøvelsesmiddel system.
2. kirurgisk Procedure
- Indsæt et Termostatstyret varme pad nedenunder et stykke køkkenrulle, hvorpå rotten hviler, sikre rat's hoved med to øre barer og overvåge kropstemperaturen ved hjælp af en rektal termometer.
- Barbere toppen af rottens hoved.
- Anvende oftalmologiske salve på øjnene at forhindre hornhinde tørring.
- Før udsætter kraniet, anvende lidocain dråber til hovedbunden og masseres den forsigtigt ind i huden.
- Gøre en midterlinjen indsnit i ca 2-3 cm på hovedbunden ved hjælp af en skalpel til at eksponere overfladen af kraniet.
- Forsigtigt adskille temporalis musklen contra-lateral til bakkenbart puden til at blive stimuleret fra kraniet ved hjælp af en Jacquette Scaler og et par af savtakket og buede dissekere pincet. Ren kraniet med bomuld svaberprøver når det er nødvendigt.
- Ved hjælp af en flettet silke, ikke-resorberbare sutur, binde adskilt musklen til hovedbunden med en stram knude og derefter binde sutur sikkert til stereotaxisk ramme18.
- Brug stereotaxisk koordinater til at finde den tønde cortex, 2,5 mm caudale til bregma og 6 lateral mm til midterlinjen19. Tegne en prik på placeringen af somatosensoriske cortex ved hjælp af en blyant eller en markør.
-
Bore et burr hul på den markerede placering ved hjælp af en dental boremaskine. For at forhindre kraniet fra overophedning under boring, anvendes sterilt saltvand (natriumklorid 0,9%) til arbejdsområdet hver 10-15 s. Boring processen indebærer følgende 3 trin:
- Bor et hul af diameter < 2 mm ind i kraniet ved hjælp af et borehoved #4 (0.055 i diameter). Passe på ikke for at bore i dura.
- Tynde i bunden af hullet til gennemskinnelighed ved hjælp af et borehoved #1/4 (0.019 i diameter).
- Brug en 27 G nål til at gennembore dura for at tillade indsættelse af et mikroelektrode.
- Overføre rotte, sikret på et stereotaxisk ramme, at et Faraday bur monteret på toppen af en vibration isolation arbejdsstation.
- Vedhæfte en oximeter sensor klemme tilsluttet en oximeter styreenheden til rottens bagben pote løbende overvåge følgende fysiologiske parametre: puls, åndedræt sats, arterielle iltmætning, puls udspilning og ånde udspilning. Disse parametre var vises løbende på en computerskærm, afspejler de fysiologiske tilstand og anæstesi dybde af rotten.
- Erstatte hård plast næsen kegle for isofluran administration og næse klemme til rotte adapter med en microflex pause monteret med en gennemsigtig bløde næsen kegle, som er ændret (figur 1A) for at tillade let bakkenbart stimulation til den ene side af knurhår pad uden at kompromittere isofluran administration.
- Indsæt to rustfrit stål stimulerende elektroder til bakkenbart pad udsat af cut-out på næsen kegle.
- Stimulerende elektroderne tilsluttes en isoleret nuværende stimulator.
- Løft huden af midterlinjen af halsen med pincet og gøre en 1 ~ 2 cm snit med saks klar til placering af referenceelektroder. Passe på ikke for at skære i muskelvævet.
3. co lokaliserede EEG/LFP Setup
- Rens og tør kraniet omkring burr hullet ved hjælp af en vatpind.
- Omhyggeligt placere den ledende EEG pasta på den ene flade side af en EEG spider elektrode. Efterlade en lille hul klar EEG pasta på edderkop elektroden til at tillade en multi-laminar mikroelektrode til at passere gennem hullet uden at kontakte pasta og spider elektrode. Dette forhindrer elektrisk kontakt mellem EEG elektrode og mikroelektrode.
- Tilslutter spider elektrode til burr hul i kraniet, EEG pastaen mod kraniet.
- Omhyggeligt tryk spider elektrode på kraniet, gør fast kontakt med kraniet via EEG pasta. Fjerne alle pasta tilsløre burr hullet ved hjælp af en nål på en sprøjte.
- Fjerne overdreven EEG pasta ud i periferien af spider elektrode, så kontakt mellem spider elektrode og kraniet er rumligt begrænset til størrelsen af elektrode (figur 1B).
Figur 1: generel opsætning for samtidige EEG/LFP optagelse. (A) setup består af et modificeret næsen kegle for at lette bakkenbart pad stimulation under isofluran anæstesi, to stimulerende elektroder indsat i bakkenbart pad, en spider elektrode placeret på kraniet ovenfor tønde cortex contra-lateral til de stimulerende elektroder, en multi-kanal mikroelektrode indsat i den tønde cortex via spider elektrode og referenceelektroder placeret inde et snit på bagsiden af rottens hals. (B) en vis gennem mikroskop af spider elektrode sikkert placeret på kraniet af EEG pasta. Mikroelektrode er indsat i et burr hul boret i kraniet under spider elektrode. Hovedbunden bliver holdt tilbage af kirurgisk tråd (sutur) bundet til stereotaxisk rammen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Smøre EEG indsætte på referenceelektrode til EEG og placere det sikkert inde i snit på bagsiden af rottens hals.
- EEG elektroderne tilsluttes forforstærker via en passiv signal splitter for lav impedans signaler (figur 2). Sørg for impedans af spider elektrode er under 5 kΩ. Hvis det ikke, tjek at EEG pasta er i god kontakt med kraniet og elektroden er fast trykket EEG paste. Tilføje flere EEG pasta, hvis det er nødvendigt.
- Montere en micromanipulator arm på stereotaxisk rammen. Tilslut en lineær 16-kanals mikroelektrode (100 µm afstand, område for hver site 177 µm2) til en 16-kanals akut headstage klipses sikkert fast på micromanipulator arm.
- Smøre EEG indsætte på referenceelektroder for EEG og mikroelektrode, derefter sikkert placere dem inde i snit (figur 1A).
- Justere vinklen på micromanipulator arm, så mikroelektrode er vinkelret på den kortikale overflade. Denne vinkel er normalt mellem 25-35 °.
- Lavere mikroelektrode under et mikroskop ved at dreje micromanipulator drejeknapper, således at spidsen af mikroelektrode er rettet mod den lille åbning i bunden af burr hullet, indtil den øverste elektrode bare trænger den kortikale overflade. Skal sørges for at undgå at tvinge mikroelektrode på overfladen af dura, som dette ville bryde elektroden.
- Par 16-kanals mikroelektrode til en forforstærker forbundet med en data erhvervelse enhed via en fiberoptiske kabel (figur 2).
- Tænd forforstærker, data erhvervelse enhed og computeren er tilsluttet enheden. Tænd for boksen stimulator.
- Indsæt mikroelektrode normalt til den kortikale overflade ved langsomt at dreje på z-aksen knop af micromanipulator i en dybde af 1.500 µm20.
- Mikro-justere dybden ved at anvende et tog af stimulus til bakkenbart pad og observere 16-kanals evoked LFP på en PC skærm ved hjælp af software data erhvervelse enhed installeret på pc'en. Forsigtigt slå z-aksen knop på micromanipulator, indtil den højeste amplitude af den evoked LFP opstår omkring kanal 7 (som det falder sammen med lag IV i cortex).
Bemærk: Ipsi-lateral EEG elektrode setup: For nogle eksperimenter, en anden spider elektrode blev placeret i ipsi-laterale side af intakt kraniet ovenfor tønde cortex. Denne opsætning tilladt bilaterale EEG registrering i løbet af hvilende tilstand at undersøge effekten af burr hul på EEG-signalet.
Bemærk: Den kirurgiske procedure til at konfigurere EEG elektrode er identisk med som beskrevet ovenfor, medmindre der under trin 2.6, temporalis musklen på hver side af hovedet var nøje adskilt fra kraniet, sutureres tilbage og bundet sikkert til den tilsvarende side af stereotaxisk rammen.
Bemærk: Den samtidige EEG/LFP setup er også identisk med som beskrevet ovenfor, med et ekstra skridt, en anden spider elektrode er indlæst med EEG pasta, så presset fast til kraniet ovenfor ipsi-lateral tønde cortex.
Figur 2. Et signal flowdiagram. Rotten placeres inde i et Faraday bur. De stimulerende elektroder modtage kommandoer fra boksen stimulator kontrolleres af Data erhvervelse enhed gennem sin software installeret på en PC. Det neurale signal registreres af mikroelektrode overføres til en forforstærker inde Faraday bur. Det neurale signal registreres af EEG sonden overføres til forforstærker gennem et signal splitter. Pre-forstærker er forbundet til Data erhvervelse enhed udenfor Faraday bur via en fiberoptiske kabler. De neurale data lagres derefter på et lokalt drev på pc'en, mens de kan også vises på en computerskærm. En mobil små dyr isofluran systemet administrerer isofluran fra uden for Faraday bur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. elektrisk Stimulation og neurale optagelser
Bemærk: Samplingfrekvensen for alle neurale data er 24.41 kHz med 16-bit opløsning. En prøve består af en enkelt elektrisk stimulation i begyndelsen af retssagen. Hver retssagen varer 10 s, hvilket er også Inter stimulus interval (ISI). Hver stimulus er en firkantet nuværende puls af 1.2 mA varig 0.3 ms. For bilaterale eksperimenter til at studere effekten af burr hul, kontinuerlig hviletilstand 250 s er også indspillet.
- Åbn den optagelse software på computeren i brug.
- Indlæse den korrekte kredsløb for eksperimentet ved at vælge "Indlæs projekt..." i rullemenuen for 'OpenProject'. Vises et nye vindue ('WorkBench') (figur 3).
Figur 3. En udstilling af software GUI for Data erhvervelse Unit. Det giver mulighed for passende kredsløb skal uploades, stimulation parametre skal angives, og data der skal registreres og visualiseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Opret en ny mappe (kaldet en "Tank" af software) for at gemme neurale optagelser.
- Klik på 'Filer' fra toppen af vinduet, og vælg "Data opgave forvaltning". Vises et nye vindue ('Tank Management").
- Tryk på den højre knap på musen for at få vist en menu i vinduet "Tank forvaltning". Vælg Opret' ny Tank'. Et andet nyt vindue ('Opret Data Tank') vises.
- I vinduet 'Opret Data Tank' Vælg den sti, hvor du planlægger at oprette en ny mappe til data og indtaste navnet på den nye mappe. Tryk derefter på 'OK'. Dette vindue forsvinder.
- Den nye mappe vises i vinduet "Tank forvaltning", men i grå. Registrere denne mappe ved at højreklikke på det, og vælg 'Registrer Tank' fra dropdown menuen. En rød stjerne og en grøn pil vises til venstre for den nye mappes navn, som nu er i sort (figur 4).
- Afmelde enhver tidligere mapper ikke er i brug ved at højreklikke i vinduet 'Tank Management' og vælge 'Opdater Tank liste' i dropdown-menuen.
- Klik på 'OK' for at afslutte vinduet "Tank forvaltning".
Figur 4: en visning af software GUI viser en registreret datamappen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Registrere den nye mappe i 'Scope' til at vise neurale signaler under eksperimentet.
- Klik på ikonet 'Scope' i vinduet 'OpenProject'. Vises et nye vindue (» anvendelsesområde «»).
- Højre klik med musen i vinduet 'Scope' og vælge 'Opdater Tank liste' i dropdown-menuen. Den nye mappe navnet vises med gråt.
- Klik på den nye mappe. En rød stjerne og en grøn pil vises til venstre for den nye mappes navn, som nu er i sort.
- Angiv de eksperimentelle parametre for dataopsamling i vinduet 'WorkBench' ved at klikke på 'Setup' fra toppen af vinduet. Et nyt vindue vises. Vælg 'Feje loop', indstille længden af retssagen og antallet af forsøg skal registreres.
- Kontroller, at feltet Stimulator er tændt.
- Tryk på ' Indspil ' i vinduet 'WorkBench'. Et nyt vindue vises. Angiv navnet på den datafil, du vil gemme for den eksperimentelle køre men ikke ramt knappen Retur på dette stadium, som EEG optagelse parametre skal sættes op.
-
Konfigurere parametrene EEG optagelse ved hjælp af grafiske bruger Interface (GUI) på Pre-forstærker. Touch skærm (overalt) forforstærker til at vågne op på skærmen. Vælg Lås op for at låse skærmen (figur 5).
- Tryk på ikonet venstre i ' 2: EEG' panel. En ny display vises.
- Tryk på 'Kobling' og vælg 'AC'.
- Tryk på 'Ref Mode' og vælg 'Lokale'.
- Tryk på 'Samp Rate' og vælg ' 25 KHz'.
- Tryk på 'OK' at vende tilbage til den oprindelige visning.
Figur 5: The GUI på forforstærker. Det giver mulighed for EEG optagelse parametre (f.eks., sampling hyppighed og refererer til præference) skal angives. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Kontrollere impedans af EEG-sonderne ved at trykke på den midterste ikon i ' 2: EEG' panel. Hvis for højt, tilføje flere EEG pasta til sonden. Tryk på 'OK' at vende tilbage til den oprindelige visning.
- Vent 20 s til at undgå at optage den indledende udsving af EEG optagelser.
- Gå tilbage til PC skærm (efter de 20 s ventetid) og tryk på 'Return'-tasten på tastaturet. EEG og LFP signaler vil blive optaget.
5. dataanalyse
-
Forbehandle evoked LFP og EEG signalerne på en prøveversion af prøveversion grundlag ved hjælp af følgende trin.
- Skift tilbage de neurale data i tiden af 20 prøver (svarende til 0,82 ms). Dette er forsinkelsen produceret af kredsløb bruges til at indsamle neurale data i TDT, selv. Ved at flytte data, er tidspunkt nul justeret til udbrud af stimulus.
- Fjerne stimulus artefakt ved at erstatte de neurale data fra 0 til 1 ms med en lige linje, der forbinder data peger på 0 ms med datapunktet på 1 ms.
- Nul-betyder hvert forsøg ved at trække den gennemsnitlige værdi af de neurale signal 200 ms før stimulus debut.
- Low-pass filter data under 800 Hz bruger en 4th ordre Butterworth IIR type filter i begge retninger til at undgå at indføre nogen tidsmæssig skift i dataene.
- Justere den multi-laminar data på tværs af dyr. For hvert dyr LFP data, gælder inverse aktuelle kilde tæthed (spline iCSD, kilde radius R = 0,5 mm) analyse21 med en Gaussisk filter (λ = 50 µm) til at finde lag IV synke1, som er givet af den største negative peak, som opstår i en kortikale dybde under pial overfladen inden for de første 15 ms stimulus symptomdebut. CSD, og den tilsvarende LFP, data justeres derefter efter deres vasken placeringer på tværs af dyr. Fælles vasken ligger i lag IV, ~ 600 µm under pial overfladen.
- Efter justering, brug kanaler 2, 7 og 12 i den omlagt LFP som repræsentanter for neurale svar af supragranular, kornede, og infragranular lag, henholdsvis i den tønde cortex.
- Beregne middelværdien fremkaldte LFP og EEG fra et gennemsnit på forhånd behandlede data over 100 forsøg.
- For at undersøge effekten af burr hul på EEG, signaler ned-prøve EEG til 1.000 Hz, og Beregn spektral effekttæthed (PSD) contra-lateral (med et hul i kraniet) og ipsi-lateral (intakt kraniet) spider elektrode optagelser en 250 s periode i hviletilstand. PSD er beregnet ud fra 0,1-100 Hz i Matlab ved hjælp af funktionen 'pmtm', som er baseret på multitaper metode22.
- Opdele frekvensområdet i de følgende velkendte frekvensbånd: Delta (δ): 0,1-4 Hz, Theta (): 4-8 Hz, Alpha (α): 8-13 Hz, Beta (β): 13-31 Hz, Gamma (γ): 31-100 Hz. beregning af den gennemsnitlige PSD i hvert bånd.
- Inden for hvert frekvensbånd, Beregn normaliserede forskellen i PSD, Perr, mellem contra- og ipsi-lateral EEG ved hjælp af ligningen:
hvor Pc og P,jeg er gennemsnitlige PSD af contra - og ipsi-lateralt EEG, henholdsvis i frekvensbåndet af interesse. - Inden for hvert frekvensbånd, skal du udføre en one-prøve t-test for at teste den hypotese, at der er ingen signifikant forskel (på 0,05 signifikansniveau) mellem PSD af EEG-signalet registreres fra de to hjernehalvdele.
Representative Results
Data fra 4 rotter var et gennemsnit for at opnå mean time serie, hvor det er relevant. Amplituden af EEG evoked response, også kendt som hændelsen relateret potentiale (ERP), er normalt meget mindre end LFP. Figur 6 viser de gennemsnitlige ERP og LFP i supragranular, kornede, og infragranular lag af tønde cortex, henholdsvis. Fejl bandet i hver Mark er den tilsvarende standardafvigelse. Det kan ses, at ERP er ca 10 gange mindre end den evoked LFP.
Figur 6: betyde (n = 4) neurale signaler af ERP, supragranular, kornede, og infragranular LFP. Skygge angiver standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Sammenligninger af den tidsmæssige dynamics ERP og LFP er vist i figur 7. Direkte superposition af ERP og supragranular LFP i figur 7A illustrerer rækkefølgen af amplitude forskelle mellem disse to typer af neurale signaler. Hvis du vil sammenligne den tidsmæssige dynamics, er både ERP og LFP normaliseret med hensyn til deres negative peak amplitude. Figur 7B og 7 C viser de normaliserede ERP overlejret med den normaliserede supragranular LFP og normaliserede kornede LFP, henholdsvis.
Det kan ses fra figur 7B , toppene af P1 og N1 for ERP er mere forsinket end de tilsvarende toppene af LFP i supragranular lag. Men de tidsmæssige profiler af disse to neurale signaler er ens, med P1 forud N1. På den anden side den tidsmæssige profil af ERP er markant forskellig fra den kornede (lag IV af tønde cortex) LFP (figur 7C). De er vigtigere ikke spejlbilleder af hinanden, med kornede LFP domineret af en enkelt negativ peak (afspejler en stor vask i kortikale lag IV), der henviser til, at ERP bestod primært af to toppe med modsatte polaritet.
Figur 7: sammenligning af den tidsmæssige dynamics ERP og LFP. (A) ERP (solid line) overlejret med supragranular LFP (stiplet linje). Skygge angiver standardafvigelsen. (B) normaliseret ERP (solid line) overlejret med normaliserede supragranular LFP (stiplet linje). (C) normaliseret ERP (solid line) overlejret med normaliseret kornede LFP (stiplet linje). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
ERP signal blev målt via en edderkop elektrode placeret på kraniet med en burr hul boret ind i det. For at undersøge effekten af hullet på EEG optagelser, var en anden spider elektrode placeret på intakt kraniet ovenfor ipsi-lateral tønde cortex. Omhu at sikre, at impedances af to spider elektroderne var sammenlignes i størrelsesorden ved at justere mængden af EEG pasta bruges. Data fra fire rotter (der var ikke de samme rotter bruges ovenfor) er præsenteret her.
Figur 8 viser de samtidige hvilende tilstand EEG optagelser fra begge elektroderne på en rotte, med 100 s data vises i figur 8A, og dataene i den rektangulær ramme (20 s) er udvidet i fig. 8B. De to EEG-signaler varierer i vid udstrækning Co, inden for lignende række amplitude. Figur 9 viser PSD af fire rats, med den øverste række ved hjælp af en lineær skala på frekvens akse, og den nederste række ved hjælp af en logaritmisk skala på frekvens-aksen til at give en udvidet visning i de lavere frekvenser. Fra figur 9synes der ikke at være konsekvent bias i PSD på tværs af fag. Dette blev bekræftet ved at udføre en t-stikprøvetest på de normaliserede forskelle i gennemsnit PSD i de fem frekvensbånd, vist i figur 10. Ingen af de normaliserede PSD forskelle i disse frekvensbånd var signifikant forskellig fra nul (p = 0,32, 0,46, 0,85, 0,69 og 0,97, henholdsvis).
Figur 8: bilaterale EEG optagelser. (A) kraniet EEG registrering i hviletilstand med burr hul i kraniet (sort) og en samtidig EEG optagelse på den modsatte halvkugle med kraniet intakt (grå). (B) udvidet visning af bølgeformer inden for den rektangulær ramme i (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Power spektrale tæthed (PSD) af contra-(blå) og ipsi-lateral (rød) EEG. Hver kolonne viser PSD til en rotte. De top paneler bruge lineær frekvens skala, mens panelerne bunden brug logaritmisk frekvens skala til at tillade PSD i det nederste frekvensområde til visualiseres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: gruppere analyse. Normaliseret forskellen mellem contra- og ipsi-lateral PSD med fem frekvensbåndene: Delta, Theta, alfa, Beta og Gamma. Hver søjle viser de gennemsnitlige normaliseret forskelle inden for frekvensbåndet, med standard fejl vises som fejllinje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har beskrevet en eksperimentel procedure for samtidige optagelse af co lokaliserede EEG og LFP signaler om en isofluran bedøvede rotte i svar til bakkenbart pad stimulation. En mikroelektrode blev indsat i neocortex gennem en åbning i EEG spider elektrode, som var afstemt med et burr hul boret i kraniet. Elektroden blev fastgjort til kraniet af en ledende og selvklæbende EEG indsætte23. Næsen kegle bruges til administration af isofluran blev ændret således at stimulere elektroder kunne indsættes i bakkenbart pad med lethed.
EEG pastaen var effektiv til montering spider elektrode sikkert til kraniet, men samtidig give fremragende elektriske ledningsevne i hele den eksperimenterende dag uden behov for yderligere anvendelse af pasta. Det erstattet uønsket brug af lim til at lave i periferien af spider elektrode til kraniet, som lim er ikke-ledende og kan øge impedans af elektroden, hvis det kører mellem kraniet og elektrode. EEG pasta har en række fordele i forhold til EEG gel, som er vanskeligt at form omkring burr hul og kan tørre ud under eksperimentet, hvilket resulterer i dårlig EEG-signaler.
Da rotten var placeret inde et Faraday bur, var elektrisk støj på grund af miljøet meget svækkede. Men nogle gange de neurale signal var stadig ganske støjende. I de fleste tilfælde, dette var forårsaget af referenceelektrode ikke sikkert placeret og derfor skulle være re justerede eller flere EEG pasta bruges. Et andet fælles problem var, at den evoked LFP var små i amplitude. Dette kan skyldes mikroelektrode ikke placeret i midten af regionen kortikale aktiveres ved at stimulere elektroder. I stedet for at genindsætte mikroelektrode, som kunne forårsage mere skade på de lokale neuroner, vi normalt justeret placeringen af de stimulerende elektroder i bakkenbart pad indtil en rimelig amplitude af LFP (> 3 mV) kunne observeres.
En af begrænsningerne i teknikken er den dårlig rumlige opløsning af spider elektrode, som har en diameter på 6 mm. Det er store sammenlignet med størrelsen af rottens kraniet. Spider elektrode bruges her er desværre den mindste tilgængelige for køb. Det vil være ønskeligt at reducere diameteren af spider elektrode til 2-4 mm, dermed øge EEG optagelser, hvilket gør sammenligningen mellem EEG-signalet og supragranular rumlige specificitet LFP signal mindre flertydig.
Flere kritiske trin i protokollen har brug for særlig opmærksomhed. Først er indsættelsen af mikroelektrode gennem burr hul. Som dura er ellers intakt, præcisionen af indsættelse er afgørende. En mindre modstand i spidsen af elektroden betyder normalt, at elektroden ikke er placeret korrekt. Det skal være rejst, position justeres, og igen indsat. Andet er placeringen af næsen kegle på rotten. Det skal ikke være for løs, som isofluran vil flygte fra kegle. Det må også ikke være for stramt, da dette kan hindre næsebor af rotte og forårsage åndedrætsbesvær. Særlig opmærksomhed er også forpligtet til at sikre, at amplituden af EEG-optagelse er meget mindre (normalt 5-10 gange mindre) end LFP top kanals optagelse. Hvis de er ens, er det en indikation, EEG sonden er kommet i direkte eller indirekte kontakt med mikroelektrode. En indirekte kontakt er normalt gennem den cerebrale spinalvæske (CSF), der undertiden fylder hullet boret i kraniet. Ledningsevne af CSF er typisk 100 gange så kraniet24,25. Således, hvis CSF inde i burr hul er tilstrækkelig høj, kan det gøre kontakt med spider elektrode. For at undgå dette, skal hullet rengøres ofte med super absorberende bomuld svampe såsom absorption spears.
Effekten af et burr hul (diameter < 2 mm) i kraniet på EEG optagelse omkring hullet blev studeret ved at placere en anden spider elektrode på intakt kraniet på toppen ipsi-lateral tønde cortex, således at bilaterale EEG optagelser kan sammenlignes. Resultaterne vist i figur 9 og figur 10, foreslår virkningen at være ubetydelige på 0,05 niveau af betydning. Andre faktorer, der påvirker amplituden af EEG omfatter, hvor godt EEG pastaen var i kontakt med kraniet, hvordan fast elektroden blev trykket til pasta og den rumlige udstrækning af EEG pasta på kraniet.
Det er også værd at bemærke, at protokollen beskrevet her indspillede kraniet EEG, som er forskellig fra hovedbunden EEG anvendes i human EEG undersøgelser. Hovedbunden fungerer ligesom et resistor eller et low-pass filter, som vil reducere signal-støj-forholdet af EEG registrering yderligere.
Endelig, sammenligning af den tidsmæssige dynamics af ERP og af den evoked LFP på tværs af kortikale lag tyder på, at somatosensoriske evoked potentiale bedre afspejler LFP i de supragranular lag af cortex end i den kornede og infragranular lag. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere arbejde6, viser, at det første segment (P1) af ERP er relateret til den retur aktuelle som følge af tilstrømningen af den excitatoriske synaptic nuværende indtræder i den granulerende lag, mens de efterfølgende falde) N1) i ERP kan være relateret til den forsinkede ankomst af thalamic afferente til kortikale lag II/III og/eller feedforward signaler fra dybere kortikale lag. Afslutningsvis kan samtidige optagelser af EEG/LFP øge forståelsen af neurale tilblivelsen af EEG, og lette matematisk modellering af EEG med hensyn til neurale signaler på tværs af kortikale lag.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Andrew Cripps samt enhedens BioResource på University of Reading. Denne forskning er finansieret af BBSRC (giver nummer: BB/K010123/1). Data i forbindelse med dette arbejde er frit tilgængelig fra Y.Z. (ying.zheng@reading.ac.uk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female Lister Hood rats | Charles Rivers | ||
| Spider electrode | Unimed Electrode Supplies Ltd | SCS24-426 | |
| EEG paste: Ten20 | Unimed Electrode Supplies Ltd | 10-20-S | |
| Stereotaxic holder with dual micromanipulator arms: Dual Manipulator Stereotaxic Frame with 18° Ear Bars | WPI (World Precision Instruments) | 502603 | |
| Isoflurane | National Vet Services Limited | 50878 | |
| Hard plastic nose cone: Anasthesia Gas Mask for Rat | WPI | 502054 | |
| Small animal isoflurane anaesthetic system | WPI | EZ-B800A | |
| Thermostatic heating pad: Rat Blanket System 230V | Harvard Apparatus UK | 50-7221-F | |
| Ophthalmic ointment: Optixcare eye lube | Viovet | 203865 | |
| Lidocaine Hydrochloride (Injection 2%) | Larkmead Vets | ||
| Jacquette Scaler #1SSE, 18cm, Hollow | WPI | 503421 | |
| Serrated and curved dissecting forceps | WPI | 15915 | |
| Braided silk, non-absorbable suture: Mersilk Suture W502H | National Vet Services Limited | 153746 | |
| Dental drill: BONE MICRO DRILL SYST 230 VAC | Harvard Apparatus UK | 72-4860 | |
| Sterile Saline: Sodium chloride 0.9% | Animalcare Ltd | 14K26BT | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #4 | Harvard Apparatus UK | 72-4958 | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #1/4 | Harvard Apparatus UK | 72-4962 | |
| Faraday cage | Newport Corporation | VIS-FDC-3600 | |
| Vibration isolation workstation: Vision IsoStation | Newport Corporation | M-VIS3660-RG4-325A | |
| Oximeter Control Unit and sensor: MouseOxPlus, Starr Life Sciences Corp. | WPI | O15001 | |
| Transparent soft nose cone: Microflex Non-Rebreathing Unit with a Rat Nosecone | WPI | EZ-103A | |
| Stainless steel stimulating electrodes | PlasticsOne | E363/1/SPC | |
| Isolated current stimulator | Made in House | ||
| 16-channel micro-electrode, 100 μm spacing, area of each site 177 μm2 | NeuroNexus | A1x16-10mm-100-177-A16 | |
| 16-channel acute headstage | Tucker David Technologies Inc., TDT | RA16AC-Z | |
| Pre-Amplifier: Z-Series 64-Channel Neuro-Digitizing Preamp | TDT | PZ5-64 | |
| Passive signal splitter: 32-Channel Splitter Box for PZ5 | TDT | S-BOX_PZ5 | |
| Data acquisition unit: RZ2 BioAmp Processor. Z-Series 4-DSP ultra high performance processor | TDT | RZ2-4 | |
| Software for Neurophysiology: OpenEX | TDT | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Absorption spears | Fine Sicence Tools | 18105-01 |
References
- Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiol Rev. 65 (1), 37-100 (1985).
- Logothetis, N. K. The Underpinnings of the BOLD Functional Magnetic Resonance Imaging Signal. J Neurosci. 23 (10), 3963-3971 (2003).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Zheng, Y., et al. Balanced excitation and inhibition: Model based analysis of local field potentials. Neuroimage. 63 (1), 81-94 (2012).
- Bruyns-Haylett, M., et al. The neurogenesis of P1 and N1: A concurrent EEG/LFP study. Neuroimage. 146, 575-588 (2017).
- Nunez, P. L. Electric Fields of the Brain: The Neurophysics of EEG. , Oxford University Press. (1981).
- Jackson, A. F., Bolger, D. J. The neurophysiological bases of EEG and EEG measurement: A review for the rest of us. Psychophysiology. 51 (11), 1061-1071 (2014).
- Cohen, M. X. Where Does EEG Come From and What Does It Mean? Trends Neurosci. 40 (4), 208-218 (2017).
- Bojak, I., Oostendorp, T., Reid, A., Kötter, R. Connecting Mean Field Models of Neural Activity to EEG and fMRI Data. Brain Topogr. 23 (2), 139-149 (2010).
- Coombes, S. Large-scale neural dynamics: Simple and complex. Neuroimage. 52 (3), 731-739 (2010).
- Deco, G., Jirsa, V. K., Robinson, P. A., Breakspear, M., Friston, K. J. The dynamic brain: from spiking neurons to neural-masses and cortical fields. PLoS Comput. Biol. 4 (8), e1000092 (2008).
- Pinotsis, D. A., Friston, K. J. Neural fields, spectral responses and lateral connections. Neuroimage. 55 (1), 39-48 (2011).
- Riera, J. J., et al. Pitfalls in the dipolar model for the neocortical EEG sources. J Neurophysiol. 108 (4), 956-975 (2012).
- Valdes, P. A., Jimenez, J. C., Riera, J., Biscay, R., Ozaki, T. Nonlinear EEG analysis based on a neural mass model. Biol Cybern. 81 (5), 415-424 (1999).
- Musall, S., von Pföstl, V., Rauch, A., Logothetis, N. K., Whittingstall, K. Effects of Neural Synchrony on Surface EEG. Cereb Cortex. 24 (4), 1045-1053 (2014).
- Snyder, A. C., Morais, M. J., Willis, C. M., Smith, M. A. Global network influences on local functional connectivity. Nat Neurosci. 18 (5), 736-743 (2015).
- Mayhew, J., et al. Spectroscopic analysis of neural activity in brain: Increased oxygen consumption following activation of barrel cortex. Neuroimage. 12 (6), 664-675 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Academic Press. (2005).
- Martindale, J., et al. The hemodynamic impulse response to a single neural event. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (5), 546-555 (2003).
- Pettersen, K. H., Devor, A., Ulbert, I., Dale, A. M., Einevoll, G. T. Current-source density estimation based on inversion of electrostatic forward solution: Effects of finite extent of neuronal activity and conductivity discontinuities. J Neurosci Methods. 154 (1-2), 116-133 (2006).
- Thomson, D. J., et al. Multitaper analysis of nonstationary and nonlinear time series data. Nonlinear and Nonstationary Signal Processing. Fitzgerald, W. J., et al. , 317-394 (2000).
- Bae, J., Deshmukh, A., Song, Y., Riera, J. Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (100), e52700 (2015).
- Baumann, S. B., Wozny, D. R., Kelly, S. K., Meno, F. M. The electrical conductivity of human cerebrospinal fluid at body temperature. IEEE Trans Biomed Eng. 44 (3), 220-223 (1997).
- Wendel, K., et al. The Influence of Age and Skull Conductivity on Surface and Subdermal Bipolar EEG Leads. Computational Intelligence and Neuroscience. 2010, (2010).
- Flemming, L., et al. Evaluation of the distortion of EEG signals caused by a hole in the skull mimicking the fontanel in the skull of human neonates. Clin Neurophysiol. 116 (5), 1141-1152 (2005).
