Ved hjælp af Dot analyse til at analysere Migration af celle ark

Summary

Celle migration er afgørende for udvikling, væv vedligeholdelse og reparation og tumordannelse, og er reguleret af vækstfaktorer, kemokiner og cytokiner. Denne protokol beskriver dot assay, en to-dimensionelle, uhindret migration assay at vurdere den vandrende Fænotypen af vedlagte, sammenhængende celle ark som svar på microenvironmental stikord.

Abstract

Selv om komplekse organismer vises statisk, er deres væv under en løbende omsætning. Som celler alder, flytte die, og er erstattet af nye celler, celler inden for væv i et stramt orkestreret måde. Under tumor udvikling, denne balance forstyrres, og tumorceller forlade epitel af oprindelse til at invadere den lokale mikromiljø, til at rejse til fjerne steder og i sidste ende udgør metastatisk tumorer på fjerne steder. Dot-analysen er en enkel, to-dimensionelle uhindret migration assay, til at vurdere den netto bevægelse celle ark ind i en celle-området og analysere parametre i celle migration ved hjælp af time-lapse billeddannelse. Her, dot assay er påvist ved hjælp af en human invasive, lunge kolonidannende breast cancer cellelinie, MCF10CA1a, til at analysere de celler vandrende svar til epidermal vækst faktor (EGF), som er kendt for at øge malignt potentiale af brystkræftceller og at ændre den vandrende Fænotypen af celler.

Introduction

Migration assays er almindeligt anvendt til at evaluere den invasive og metastatisk potentiale af tumor celler i vitro. Mest almindeligt, bruges sår eller Skrab analysen til at vurdere migration af epitel ark ind i en celle markeret område^1,2,3. For at udføre de scratch assay, celler er belagt i en éncellelag og en “scratch” eller celle-området er lavet med en pipette spids. Scratch analysen er nem at sætte med almindeligt tilgængelige vævskultur forsyninger og kan udføres i flere godt plader, giver mulighed for behandling af flere prøver. Men som scratch celler er fysisk fjernet fra éncellelag og ofte undergår celledød. Derudover er ekstracellulære matrix knyttet til pladen ofte beskadiget under en aflysning proces. Ligeledes brugen af silicium indsætter (f.eks Ibidi kamre⁴) eller af stencils^5,6,7 kan føre til mekanisk afbrydelse af cellerne og delvis fjernelse af matrix proteiner anvendes til overfladebehandling af plader. En anden ulempe ved assays overvågning lukning af sår eller rifter er deres begrænsede tidsforløb, som celle migration kan kun analyseres, indtil bunden er lukket.

Ved udførelsen af dot assay, er celler forgyldt som en cirkulær koloni på en overtrukket eller Ubestrøget plade⁸. Begrundelsen for denne plating strategi er at opnå celle ark med definerede kanter, der kan overføre eller invadere i de omkringliggende områder, celle-fri uden at forstyrre kulturen af fjernelse af celler eller skær. Det overordnede mål med dot assay er at observere migration af celle ark som målt ved kanten forskydning eller koloni diameter, samt at udføre time-lapse imaging for at analysere den vandrende Fænotypen af celler i højere spatio-temporal opløsning.

Celle migration kan blive påvirket af en række microenvironmental stikord som kemokiner, cytokiner og vækstfaktorer som EGF. EGF er en vækstfaktor, der udøver sin biologiske virkning via binding til dens receptor, EGF receptoren⁹, og øger invasive og metastatisk opførsel af tumor celler^4,9,10. Her, dot analysen bruges til at studere EGF stimuleret celle migration i en menneskelig invasive, lunge kolonidannende bryst kræft celle linje (MCF10CA1a)^8,11,12.

Protocol

1. belægning af retter (dag 1) Bemærk: Sørg for ikke at efterlade fingeraftryk eller snavs i bunden af pladen, når du håndterer det. Tø mus kollagen IV på isen, og fortynd det med 50 mM HCl (pH 1.3) for at forberede 3 mL af en 10 µg/mL kollagen IV løsning.Bemærk: Kollagen vil bundfald ved 37 ° C. Det er derfor vigtigt at holde kollagen løsning ved en lav temperatur mens optøning og arbejder med det. Undgå gentagne fryse-tø cykler ved at udarbejde passende størrelse delprøver og gemme…

Representative Results

Dot analysen præsenteres her (figur 1) blev udført ved hjælp af invasive, lunge kolonidannende brystkræftceller (MCF10CA1a) som et modelsystem. Dot assay udbytter meget reproducerbare celle prikker selv i hånden af begyndere, hvilket gør det en praktisk og let at udføre analysen (fig. 1D). Dot assay kombineret med han farvning eller time-lapse imaging og efterfølgende partikel billede Velocimetri (PIV) gi…

Discussion

Under tumor progression celler vandrer fra væv af oprindelse til at invadere det omgivende væv og metastaserer til fjerne steder¹⁵. Migration af celler fra en celle koloni kan observeres i dot assay. Her, er dot assay illustreret ved at analysere den vandrende Fænotypen af humane brystkræftceller svar på EGF.

For at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater flere trin i etableringen af dot er assays kritisk. Først, overfladebehandling af pladen bestemmer, om o…

Materials

MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for asay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid )	Cayman	10093	used to stimulate cells
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for LPA and EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)