Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Ved hjælp af Dot analyse til at analysere Migration af celle ark

doi: 10.3791/56451 Published: December 5, 2017

Summary

Celle migration er afgørende for udvikling, væv vedligeholdelse og reparation og tumordannelse, og er reguleret af vækstfaktorer, kemokiner og cytokiner. Denne protokol beskriver dot assay, en to-dimensionelle, uhindret migration assay at vurdere den vandrende Fænotypen af vedlagte, sammenhængende celle ark som svar på microenvironmental stikord.

Abstract

Selv om komplekse organismer vises statisk, er deres væv under en løbende omsætning. Som celler alder, flytte die, og er erstattet af nye celler, celler inden for væv i et stramt orkestreret måde. Under tumor udvikling, denne balance forstyrres, og tumorceller forlade epitel af oprindelse til at invadere den lokale mikromiljø, til at rejse til fjerne steder og i sidste ende udgør metastatisk tumorer på fjerne steder. Dot-analysen er en enkel, to-dimensionelle uhindret migration assay, til at vurdere den netto bevægelse celle ark ind i en celle-området og analysere parametre i celle migration ved hjælp af time-lapse billeddannelse. Her, dot assay er påvist ved hjælp af en human invasive, lunge kolonidannende breast cancer cellelinie, MCF10CA1a, til at analysere de celler vandrende svar til epidermal vækst faktor (EGF), som er kendt for at øge malignt potentiale af brystkræftceller og at ændre den vandrende Fænotypen af celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Migration assays er almindeligt anvendt til at evaluere den invasive og metastatisk potentiale af tumor celler i vitro. Mest almindeligt, bruges sår eller Skrab analysen til at vurdere migration af epitel ark ind i en celle markeret område1,2,3. For at udføre de scratch assay, celler er belagt i en éncellelag og en "scratch" eller celle-området er lavet med en pipette spids. Scratch analysen er nem at sætte med almindeligt tilgængelige vævskultur forsyninger og kan udføres i flere godt plader, giver mulighed for behandling af flere prøver. Men som scratch celler er fysisk fjernet fra éncellelag og ofte undergår celledød. Derudover er ekstracellulære matrix knyttet til pladen ofte beskadiget under en aflysning proces. Ligeledes brugen af silicium indsætter (f.eks Ibidi kamre4) eller af stencils5,6,7 kan føre til mekanisk afbrydelse af cellerne og delvis fjernelse af matrix proteiner anvendes til overfladebehandling af plader. En anden ulempe ved assays overvågning lukning af sår eller rifter er deres begrænsede tidsforløb, som celle migration kan kun analyseres, indtil bunden er lukket.

Ved udførelsen af dot assay, er celler forgyldt som en cirkulær koloni på en overtrukket eller Ubestrøget plade8. Begrundelsen for denne plating strategi er at opnå celle ark med definerede kanter, der kan overføre eller invadere i de omkringliggende områder, celle-fri uden at forstyrre kulturen af fjernelse af celler eller skær. Det overordnede mål med dot assay er at observere migration af celle ark som målt ved kanten forskydning eller koloni diameter, samt at udføre time-lapse imaging for at analysere den vandrende Fænotypen af celler i højere spatio-temporal opløsning.

Celle migration kan blive påvirket af en række microenvironmental stikord som kemokiner, cytokiner og vækstfaktorer som EGF. EGF er en vækstfaktor, der udøver sin biologiske virkning via binding til dens receptor, EGF receptoren9, og øger invasive og metastatisk opførsel af tumor celler4,9,10. Her, dot analysen bruges til at studere EGF stimuleret celle migration i en menneskelig invasive, lunge kolonidannende bryst kræft celle linje (MCF10CA1a)8,11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. belægning af retter (dag 1)

Bemærk: Sørg for ikke at efterlade fingeraftryk eller snavs i bunden af pladen, når du håndterer det.

  1. Tø mus kollagen IV på isen, og fortynd det med 50 mM HCl (pH 1.3) for at forberede 3 mL af en 10 µg/mL kollagen IV løsning.
    Bemærk: Kollagen vil bundfald ved 37 ° C. Det er derfor vigtigt at holde kollagen løsning ved en lav temperatur mens optøning og arbejder med det. Undgå gentagne fryse-tø cykler ved at udarbejde passende størrelse delprøver og gemme dem på-80 ° C.
  2. Tilsæt 250 µL kollagen IV løsning til hver brønd af 12-godt glas bundplade og placere dem i en passende størrelse, stram-afsluttende plastboks. Placer våd køkkenrulle over og omkring plader til at fremstille et fugtkammer og lukke boksen. Inkuber plader natten over ved stuetemperatur.
    Bemærk: Som kun området vækst skal belægges, er det tilstrækkeligt at kun dække dække slip, som er knyttet til bunden af pladen, med kollagen løsning (Se figur 1A, B for en skematisk af plade).
  3. Næste morgen, skyl plader med deioniseret vand H2O to gange for at fjerne ikke-absorberet kollagen og buffer. Direkte vand til kanten af pladen godt, ikke til kanten dannet af pladen bunden og coverslip (hvis vand er pipetted i dette område, det vil splash). Lufttørre plader i laminar flow hætte. Bruge pladerne straks eller opbevares ved 4 ° C i op til 5 dage.
    Bemærk: Forskellige cellelinjer kan kræve forskellige belægning, såsom fibronektin eller kollagen jeg.

2. plating Dot Assay (dag 2)

  1. Forberede cellesuspension
    1. For at forberede cellesuspension, bruge celler, der har været dyrket i en 60-mm vævskultur fad i DMEM/F12 medium suppleret med 5% hest serum til 80% sammenløb
    2. Skyl celler med calcium - og magnesium-fri Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) en gang, tilsættes 500 µL trypsin-EDTA (stuetemperatur), og der inkuberes celler i 3-5 min. i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2, befugtet atmosfære.
    3. Suspendere de fritliggende celler i 4,5 mL næringssubstratet at stoppe trypsin aktivitet og tælle en 20 µL alikvot af cellesuspension i en hemocytometer.
    4. Pellet de resterende celler i en 15 mL konisk slange ved centrifugering ved 200 x g i 3 min og Opsug supernatanten resuspend celler i dyrkningsmediet til 3 x 106 celler/mL.
      Bemærk: Andre belægning substrater og/eller cellelinjer, optimal celle tæthed skal være etableret i en fortyndingsrække. 3 x 106 celler/mL anbefales som udgangspunkt.
  2. Plating celler
    1. Sted en 10 µL dråbe cellesuspension på midten af hver dække slip af kollagen IV belagt 12-godt glas bundplade uden at røre eller skrabe belægningen (figur 1A, B). Inkuber plade i 30 minutter ved 37 ° C, befugtet atmosfære, at cellerne til at vedhæfte. Check i en inverteret mikroskop at cellerne er knyttet.
      Bemærk: Dette kan bedst ses ved kanten af faldet, hvor dannelsen af et éncellelag kan observeres (figur 1C). Hvis det er nødvendigt, inkuberes pladen op til 3 h. være sikker på, at fugtighed i rugemaskinen er høj nok, så dråberne kan tørre ud hurtigt. Hvis en reduktion af drop volumen under dette trin er observeret, tilføjes mellemrum mellem brøndene at øge luftfugtigheden PBS.
    2. Forsigtigt vaske brønde med 1 mL af næringssubstratet to gange for at fjerne løsgængere celler. Tilsæt 1 mL kultur medium til hver brønd. Kontrollere i en inverteret mikroskop, ingen flydende celler forbliver, ellers vaske brøndene igen. Inkuber celler natten over ved 37 ° C, 5% CO2, befugtet atmosfære, at få veldefinerede celle ark.
      Bemærk: Flydende celler er tilbøjelige til at re-vedhæfte til pladen og uønskede celle kolonier.

3. stimulere celler (dag 3)

  1. Kontroller alle brønde ved hjælp af en invers mikroskop til at sikre, at celle kolonierne er vokset korrekt. Hvis det er nødvendigt, markere uegnet brønde og ikke bruger dem.
  2. Label hver brønd af plade korrekt for hver betingelse undersøgt. Kør hver betingelse i to eller tre eksemplarer.
  3. Ændre medium for at sulte celler i DMEM/F12 med 0,1% hest serum (sultende medium) 3 h før celler er stimuleret.
  4. Stimulere celler ved tilsætning af EGF (5 ng/mL endelige koncentration) eller andre ønskede mæglere og forsigtigt blandes medium ved hjælp af en 1 mL micropipettor eller af hvirvlende pladen.
  5. Inkuber plade for 1-4 dage til at observere kant deplacement og kant profil som beskrevet i afsnit 4.1 eller udføre time-lapse imaging som beskrevet i afsnit 4.2.

4. visualisering af celle kolonier og celle Migration

  1. Hæmatoxylin-eosin (han) farvning for at måle koloni vækst (dag 4-7)
    1. Fix celler i 70% ethanol (1 mL/hul) til ~ 2 min.
    2. Pletten kerner med hæmatoxylin (1 mL/hul), ~ 2 min.
    3. Vask celler med vand fra hanen (1 mL/hul) indtil kerner er blå, 5-10 min.
    4. Pletten cytoplasma med eosin (1 mL/hul), ~ 2 min.
    5. Skyl med deioniseret vand (1 mL/hul).
      Bemærk: Hæmatoxylin og eosin løsninger kan indsamles og bruges flere gange indtil farvning bliver svag.
    6. Lufttørre plade.
    7. Vend pladen og måle prik diameter med en lineal. Alternativt kan du tage billeder af pladen med et kamera, og analysere prik diameter i ImageJ.
  2. Time-lapse mikroskopi (dag 3)
    1. Tænd for inkubator mikroskop og justere temperaturen til 37 ° C. Fyld luftfugter med dH2O. Juster CO2 til 5%. Sikre at inkubator kammer er fugtet og den motoriserede Stadium kan bevæge sig frit. Luk inkubator kammer og tillade mikroskop til at tilpasse sig til 37 ° C.
      Bemærk: Mikroskop (se tabel materialer) bruges her skal være opvarmet til 37 ° C i mindst 3 timer før cellerne er afbildet for at undgå drivende af fokus.
    2. Pladen anbringes på scenen i inkubator mikroskop og konfigurere listen fase. Billede to modstående kanter og midten af hver celle dot (fig. 1A).
    3. Tage billeder hver 3 min, for 15-24 h ved hjælp af de 10 X mål. Downloade data og fortsætte med billedanalyse i et program af valg, fxImageJ eller Matlab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dot analysen præsenteres her (figur 1) blev udført ved hjælp af invasive, lunge kolonidannende brystkræftceller (MCF10CA1a) som et modelsystem. Dot assay udbytter meget reproducerbare celle prikker selv i hånden af begyndere, hvilket gør det en praktisk og let at udføre analysen (fig. 1D). Dot assay kombineret med han farvning eller time-lapse imaging og efterfølgende partikel billede Velocimetri (PIV) giver mulighed for undersøgelse af forskellige migration parametre, herunder fortrængning af epitel kanter, celle hastighed og celle retningsbestemt som celler i kanterne af en epitel ark vandre ind i en celle-fri område. I første omgang afslørede fase kontrast billeddannelse af celle prikker, at invasive, lunge koloni danner bryst kræftceller (MCF10CA1a) opretholde en mesenchymale fænotype efter stimulation med EGF. Dog er enkelte celler forlader arket observeret hyppigere i EGF-stimuleret celle prikker (figur 2, pile). Svar af MCF10CA1a celler til EGF blev yderligere vurderet af han farvning af kulturer, der blev stimuleret med EGF i 4 dage. Faktisk, EGF-stimulation resulterede i et øget koloni diameter (figur 3). Disse observationer viser at migration af EGF stimuleret celler vil blive ændret.

Derfor, dot analysen var næste udnyttet til at udføre en mere detaljeret analyse af den dynamiske migration fænotype MCF10CA1a celle ark. Celler i arket kanter blev afbildet for 9 h efter stimulation af celler med EGF (Video 1 og Video 2) og billeder blev derefter analyseret af PIV i Matlab4,13,14. PIV afslørede, at EGF øger celle hastighed (figur 4A) til 0.63 µm/min. fra 0,45 µm/min i kontrol celler. På samme tid, EGF øget direktionalitet af celler, og det angives ved en reduktion af variabiliteten af celle direktionalitet (kantede spredning) fra 0,95 i kontrol kulturer til 0.79 i EGF-stimuleret kulturer (fig. 4B). EGF øget radial forskydning af epitel kant over 9 h fra 257 µm til 356 µm (figur 4), som blev også observeret af han farvning efter 4 dage (figur 3). Brugen af dot analysen i kombination med forskellige efterfølgende assays viser således, at EGF ændrer migration i kanterne af MCF10CA1a celler ark at celle hastighed og retningsbestemt er steget, resulterer i en øget koloni radius.

Figure 1
Figur 1: Imaging dot assay. (A, B) Celler er forgyldt som en cirkulær koloni i midten af glas nederste plade brønde. For migration analyse, er billeder taget på to modstående kanter samt centrum af kolonien (A). (C) mørkefelt billede af celle dot under plating (venstre), og i højere forstørrelse (fasekontrast) viser drop kant og kanten af den celle prik efter celler knyttet til plade (center). Vedlagte celler er flade og polygonal, mens løsgængere celler er runde (til højre). (D) Diameteren af prikker er yderst reproducerbare. Prikker blev afbildet umiddelbart efter plating og før celler blev stimuleret og diameter bestemmes ved hjælp af ImageJ. Prik størrelse er meget reproducerbare inden for et eksperiment samt mellem forskellige brugere og lille uddannelse er nødvendig for at opnå færdigheder i plating celle prikker (E = mere end 10 års erfaring i vævskultur, jeg = mindre end 4 uger erfaring i væv c ulture). n = 12 punkter pr. gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: EGF modulerer morfologiske Fænotypen af MCF10CA1a celler. MCF10CA1a celler blev sultet for 3 h i DMEM/F12 suppleret med 0,1% hest serum, før de blev stimuleret med EGF (5 ng/mL). På kanten af EGF-stimuleret kolonier enkelt celler har tendens til at migrere ud af arket (pile). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : EGF øger nettotilvæksten af celle kolonier. MCF10CA1a celler blev sultet for 3 h i DMEM/F12 medium suppleret med 0,1% hest serum, før de blev stimuleret med EGF (5 ng/mL). 4 dage senere, var celler ethanol fast og farves med hæmatoxylin og Eosin. EGF-stimuleret prikker har en større diameter efter 4 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : EGF modulerer vandrende Fænotypen af MCF10CA1a celler. MCF10CA1a celler blev sultet for 3 h i DMEM/F12 medium suppleret med 0,1% hest serum, før de blev stimuleret med EGF (5 ng/mL). Celler var afbildet hver 3 min for 9 h. efterfølgende partikel billede Velocimetri analyse blev udført i Matlab13. Hastighedsværdier repræsenterer den gennemsnitlige hastighed over tid for hvert felt. Kantede spredning af velocity vektorer blev beregnet som:
Equation 1hvor Equation 2 , og spænder fra 0 (høj direktionalitet) til Equation 3 (lav direktionalitet). Et fald i kantede spredning anses en stigning i tekstretning. Radial forskydning blev beregnet ved at fratrække koloni radiussen på t = 0 h fra koloni radius på t = 9 h. EGF-stimulation af MCF10CA1a celle prikker resulteret i øget celle hastighed (A; øverste panel), faldt kantede spredning eller øget direktionalitet (B, midt panel), og øget koloni radius (C, nederste panel). Data repræsenterer gennemsnit ± SEM af n = 3 forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Video 1: Time-lapse imaging unstimulated celler, MCF10CA1a. Billeder blev taget hver 3 min for 9 h. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Movie 2
Video 2: Time-lapse imaging af MCF10CA1a celler stimuleret med EGF (5 ng/mL). Billeder blev taget hver 3 min for 9 h. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under tumor progression celler vandrer fra væv af oprindelse til at invadere det omgivende væv og metastaserer til fjerne steder15. Migration af celler fra en celle koloni kan observeres i dot assay. Her, er dot assay illustreret ved at analysere den vandrende Fænotypen af humane brystkræftceller svar på EGF.

For at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater flere trin i etableringen af dot er assays kritisk. Først, overfladebehandling af pladen bestemmer, om og hvordan stærk celler kan tiltræde pladen og hvis celler vandrer. Omhu bør tages, overfladebehandling af pladen med kollagen IV eller andre ekstracellulære matrix er homogen at minimere eksperimentel variation. Det skal desuden sikres, at cellerne undersøges tillægger og overflytte på bestrøget pladen, og flere eksperimenter med forskellige matricer i flere koncentrationer kan være nødvendigt at optimere belægning betingelserne for en valgte cellelinie. For det andet er den nøjagtige plating af cellerne afgørende for reproducerbarhed. Fodaftryk af celle drop bestemmer størrelsen på den celle prik samt dens form. Ideelt, drop placeres uden pipette spidsen rører overfladen. Form af drop bestemmes derefter for det meste af overfladespænding plade overflade, hvilket resulterer i en cirkulær fodaftryk af reproducerbare diameter. Derfor, diameteren af den celle prik kan ændres ved at ændre mængden af cellesuspension forgyldt.

Flere punkter er således, at overveje, når du udfører dot assay. For det første skal celle tætheden af cellesuspension justeres til overfladebehandling og celletype anvendes. I almindelighed, hvis dråbe spreder bredere, er højere celle tætheder nødvendige for plade celler i Konfluerende monolag. Endvidere skal flere celler være belagt for at opnå en sammenflydende éncellelag hvis celler er små og ikke spredes meget som i forhold til store, sprede celler. For det andet, dot assay kan vedtages til forskellige plade formater, og for dette, dot størrelse kan tilpasses til mindre brønde ved at reducere mængden af dot forgyldt, og hvis det ønskes, større prikker kan være forgyldt ved hjælp af højere drop diskenheder. For det tredje kan nogle celle linjer ikke vil vedhæfte på pladen i 30 min, hvorefter plating tid forlænges op til 3 h. På samme måde, overfladebehandling af pladen skal være egnet til cellerne til at migrere på og bør sørges for ikke at ridse belægningen, når plating cellerne. Hvis celler ikke vedhæfte eller overflytte på den valgte matrix, andre typer af belægning, for eksempel kollagen 1 eller fibronektin, kan udforskes, eller koncentrationer af matrix proteiner, inkuberingstider og inkubation temperaturer under overfladebehandling af plader ændret. Egnet ekstracellulære matrix for specifikke cellelinjer kan findes i litteraturen.

Dot analysen har få begrænsninger. Det er en to-dimensionel migration assay og dermed dette kan betragtes som en ulempe i forhold til tre-dimensionelle assays, der er dog mere vanskeligt at udføre end to-dimensionelle assays. Et stort problem er måske at celledelingen kan påvirke resultaterne, især hvis hurtig prolifererende cellelinjer bruges og celle migration er vurderet over længere perioder, som det skete her for analysen af koloni diameteren efter 4 dage. På samme måde i scratch assays er lukningen af en skramme sår påvirket af celledelingen i arket celle; og i Boyden kammer assays, især hvis serum eller andre mæglere, der inducerer celle proliferations bruges som en chemoattractant, øget celleproliferation i bunden kammer kan forvrænge resultater. Enkelt celle tracking kan bruges til at specielt overholde bevægelighed for ikke-prolifererende celler. Derudover kan celleproliferation reduceres ved (i) serum sult som gjort her og/eller (ii) hæmning af mitosen ved tilsætning af mitomycin eller andre spredning hæmmere4,16. For at reducere celleproliferation, men skal pleje tages ikke skader celler i et omfang, de ikke længere kan migrere. Interessant, vi fandt i en lignende uhindret overførsel assay, celleproliferation ikke korreleret med kant deplacement, selv om det er involveret i at opretholde epitelial ark integritet under migration4,5, 17. Dette åbner et interessant spørgsmål: er celleproliferation en nødvendig bestanddel af en celle ark migration? Det forventes, at migration af celle ark med stærk celle-celle sammenvoksninger i det omgivende miljø vil blive negativt påvirket, hvis spredning er blokeret helt, da arket i sidste ende vil ikke længere være stand til at udvide og støtte migration af celler. På dette tidspunkt, cellerne skal enten langsom eller stoppe migration, eller arket skal forstyrre. Omvendt kan migration af ark med lav celle-celle sammenvoksninger være mindre påvirket som celler kan forlade ark for at overflytte uafhængigt, såsom spredning på kanten af arket epitel. Således celle migration og cell spredning er indbyrdes afhængige, og ethvert forsøg på at blokere celledelingen at studere ark migration skal overvejes nøje. Således er assays analysere ark migration for det meste udføres under serum sult, som reducerer men ikke afskaffe celle migration.

Andre migration assays til at studere ark migration på to-dimensionelle overflader omfatter ridse eller såret assay og, mere for nylig, uhindret migration assays bruger silicium eller PDMS kamre og stencils, som tillader plating af celler i definerede områder og Ufikseret migration af celler i området celle-fri efter fjernelse af afdeling eller stencil1,3,4,5,6,7,16. Disse sidstnævnte assays og dot assay tilbyde høj reproducerbarhed i hånden af såvel erfarne som uerfarne brugere som celle plating bestemmer formen og størrelsen af kolonien. Derimod kradse af de cellulære éncellelag i scratch assays kræver praksis, og selv i hænderne på eksperter dele af ark kan være flået fejlagtigt hvis cellelinjer, der danner stramme encellelag er brugt. Dette spørgsmål er forbedret, når silikone kamre eller stencils anvendes til forkromning celler, selv om vi observeret fejlagtige såret celle ark efter fjernelse af Ibidi kamre. Dot assay undgår dette problem, som cellerne er belagt i en koloni og lov til at vokse frit. Af samme grunde tillader dot analysen også cellerne til at migrere på uforandret belægning, som er let forstyrret af skrabe eller fjernelse af kammeret/stencil i andre migration assays. Desuden, som cellerne ikke er skadet ved aflysning eller fjernelse af kamre/stencils, celle død og tilknyttede frigivelse af cytokiner forbundet med fjernelse af kamre/stencils har ingen indvirkning på migration i dot assay. Endelig er celler ofte over forgyldt i scratch assays og assays brug kamre eller stencils. Således, efter at rydde celler ved at skrabe dem ud eller fjerne de fysiske barrierer, der hindrer celle migration, celle éncellelag vil slappe af og celle er skubbet, spredning i området celle-fri uden aktivt overfører. Derimod i dot assay, kan celle ark etablere sig natten over før migration er observeret, og celle migration i stedet for lempelse af arket celle kan observeres.

Dot-analysen, som let kan udføres uden nogen specialiseret udstyr, egner sig til en række efterfølgende assays, herunder farvning af celler til at vurdere grov koloni morfologi og celle spredning8, immunfarvning8, time-lapse billedbehandling, og efterfølgende dataanalyse ved hjælp af ImageJ, Matlab eller andre billede analyse software13. Yderligere parametre beskrive såsom korrelation af nærliggende vektorer eller deres adskillelse baner kan vurderes mere præcist sammenhængen i celle bevægelse inden for ark13. Time-lapse imaging kan også kombineres med immunfarvning og ImageJ støttet celle sporing for at få yderligere indblik i celle migration. For eksempel, prikker kan være immunostained for cytoskeletal proteiner efter time-lapse billedbehandling, og cellerne kan derefter spores ved hjælp af ImageJ til at analysere, hvordan udtryk for disse proteiner påvirker den vandrende Fænotypen af celler. En anden fremtidig brug er enkelt celle sporing af celler, der udtrykker nukleare fluorescerende proteiner. Vigtigere, dot assay kan udføres i flere godt plader og er så velegnet til medium til høj overførselshastighed imaging, gør det et let tilgængeligt og meget overkommelig værktøj til at screene effekt af narkotika eller shRNAs på ark migration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at videregive.

Acknowledgments

Forfatteren ønsker at takke Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo og Carole Parent for læsning og kommentering på manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af den murene Research Program af National Cancer Institute, National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF10CA1a cells Karmanos Research Institute N/A cells used for assay
mouse collagen IV BD Biosciences 354233 used to coat plates
trypsin / EDTA Thermo Fisher 25300054 used to remove cells from tissue culture plates
DPBS  Mediatech 21-031-CV used to wash cells
DMEM / F12 Thermo Fisher 11320082 used as culture medium
horse serum Thermo Fisher 26050088 used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate MatTek P12G-1.5-14-F used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant) Peprotech AF-100-15 used to stimulate cells
fatty acid free BSA Sigma A8806-1G used to make buffer for EGF
hematoxylin Sigma HHS32 used to stain colonies
eosin Electron Microscopy Sciences 26051-10 used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator Sanyo model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage Zeiss model Axio Observer.Z1 used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera BioVision C11440-42U-KIT used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph BioVision MMACQMIC software used for time lapse imaging
inverted microscope Olympus model IX70 used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box Lock&Lock N/A used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2, (2), 329-333 (2007).
  2. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62, (1), 1-21 (2013).
  3. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, (1), 107-124 (2011).
  4. Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8, (3), 58859 (2013).
  5. Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (41), 15988-15993 (2007).
  6. Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353, (6304), 1157-1161 (2016).
  7. Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17, (4), 409-420 (2015).
  8. Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5, (3), 9832 (2010).
  9. Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366, (1), 2-16 (2006).
  10. Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
  11. Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65, (2), 101-110 (2001).
  12. Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112, (7), 1116-1124 (2003).
  13. Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2, (2), 025001 (2016).
  14. Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15, (2), (2013).
  15. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  16. Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137, (2), 11-16 (2017).
  17. Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (8), 4760-4763 (1980).
Ved hjælp af Dot analyse til at analysere Migration af celle ark
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stuelten, C. H. Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets. J. Vis. Exp. (130), e56451, doi:10.3791/56451 (2017).More

Stuelten, C. H. Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets. J. Vis. Exp. (130), e56451, doi:10.3791/56451 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter