أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس
Summary
وهدف الطريقة المعروضة هنا استكشاف تجميع البروتين أثناء الشيخوخة العادية في نموذج الكائن الحي C. ايليجانس. ويمثل البروتوكول أداة قوية لدراسة مجاميع كبيرة غير قابلة للذوبان العالية التي تشكل مع التقدم في السن وتحديد كيفية تأثير التغيرات في بروتيوستاسيس تجميع البروتين.
Abstract
في العقود الأخيرة، زاد انتشار اضطرابات الأعصاب، مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD). هذه الاضطرابات المرتبطة بالعمر تتميز بظهور المجاميع البروتين مع هيكل فيبريلاري في أدمغة هؤلاء المرضى. بالضبط لماذا تخضع عادة للذوبان البروتينات تظل عملية تجميع غير مفهومة. وأعرب عن اكتشاف أن تجميع البروتين لا يقتصر على عمليات المرض، وبدلاً من ذلك جزءا من عملية الشيخوخة العادية يمكن دراسة الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم تجميع البروتين، دون استخدام اكتوبيكالي البشرية البروتينات المرتبطة بالمرض. هنا يصف لنا منهجيات دراسة تجميع البروتين المتأصلة في ايليجانس كاينورهابديتيس من خلال نهج تكميلية. أولاً، علينا النظر في كيفية زراعة عدد كبير من العمر متزامنة C. ايليجانس للحصول على الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين ونقدم الإجراءات البيوكيميائية لعزل المجاميع عالية-غير قابلة للذوبان-كبيرة. في تركيبة مع ضربة قاضية وراثية مستهدفة، من الممكن تشريح دور مورثة مصلحة في تعزيز أو منع البروتين العمر تعتمد على التجميع باستخدام أما تحليل شامل مع الكمية الكتلي أو التحليل القائم على مرشح مع الأجسام المضادة. يتم ثم تأكدت هذه النتائج بتحليل في فيفو مع الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن معلم الفلورسنت البروتينات المعرضة للتجميع. هذه الأساليب ينبغي أن تساعد على توضيح السبب في بعض البروتينات المعرضة للتجميع مع التقدم في السن وكيفية الحفاظ على هذه البروتينات تعمل بكامل طاقتها في نهاية المطاف.
Introduction
ويعترف ميسفولدينج البروتين والتجميع كسمة مميزة لعدة أمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي (المرض) الإعلانية، والمشتريات، والخرف فرونتوتيمبورال (FTD) والعديد من الآخرين. على سبيل المثال، تجميعات α-سينوكلين في ييفات اميلويد التي تتراكم كهيئات ليفي خاصة في المادة الرمادية في الدماغ للمرضى PD، أثناء وجوده في المرض المرضى ميسفولد، ماساتشوستس-43 أو فوس على شكل مجاميع هيولى في تردي الخلايا العصبية الحركية. في كل من هذه الاضطرابات الأعصاب، تفشل آليات الحفاظ على التوازن بروتين أو بروتيوستاسيس لمنع تراكم تجمعات البروتينات، وبالتالي تؤدي إلى المرض.
بروتيوستاسيس أمر حاسم لضمان الوظائف الخلوية وفي ظل الظروف العادية هذه الآليات التنظيمية أحكام السيطرة على معدل تخليق البروتين وقابلة للطي، والتدهور. عدة دراسات تثبت أن مع الشيخوخة، العديد من الخلايا والأجهزة قادرة على الحفاظ على التوازن البروتين تدريجيا للخطر، وتدهور الفسيولوجية لشبكات بروتيوستاسيس مع التقدم في السن ظرفا هاما أمراض الأعصاب (إعادة النظر في المراجع1،،من23). حقيقة أن مراقبة جودة البروتين والاستجابة الخلوية على الإجهاد البروتين تكشفت هي الخطر مع التقدم في السن تشير إلى أن ميسفولدينج البروتين وتجميع يمكن أن تكون نتيجة عامة للشيخوخة. وفي الواقع، نحن وآخرون أظهرت أن تجميع البروتين لا يقتصر على الأمراض، وبدلاً من ذلك يصبح جزء من البروتين شدة المنظفات-غير قابلة للذوبان في الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين4،،من56،7 ،،من89،10. وكشف تحليل الحسابية و في فيفو أن هذه المجاميع الفسيولوجية المتعلقة بالسن يشابه المجاميع المرض في عدة جوانب5. اكتشاف تجميع البروتين الذاتية، وتعتمد على العمر يعطينا الفرصة لتشريح الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم تجميع البروتين، دون استخدام اكتوبيكالي أعرب عن البروتينات البشرية المرتبطة بالمرض. وفي الوقت الحاضر، توجد سوى معلومات محدودة حول تنظيم إينسولوبيليتي البروتين على نطاق واسع وآثار هذه التقلبات على صحة الكائن الحي.
السلكية C. ايليجانس واحدة من الكائنات نموذج درس آخر على نطاق واسع في الشيخوخة البحث هذه الحيوانات عمر قصيرة نسبيا وتظهر العديد من الميزات المميزة الشيخوخة لاحظ في أعلى من الكائنات الحية. وقد درست آثار الشيخوخة على إينسولوبيليتي البروتين في C. ايليجانس بتجزئة البيوكيميائية متسلسلة استناداً إلى قابلية الذوبان التفاضلية، الذي يستخدم على نطاق واسع لاستخراج المجاميع المرض في ميدان البحوث نيوروديجينيريشن11 . حسب الكمية الكتلي، عرضت عدة مئات من البروتينات ليصبح تجميع المعرضة في C. ايليجانس في غياب المرض5. هنا نحن تصف بالتفصيل في البروتوكول أن تنمو إعداد كبيرة من الديدان في ثقافة السائل واستخراج متسلسلة لعزل البروتينات المجمعة للقياس الكمي بالطيف الكتلي والتحليل بوصمة عار الغربية. لأن تتراكم البروتينات تجمعات والمعرضة للتجميع في سن C. ايليجانس الغدد التناسلية وأقنعة التغييرات الأخرى الأنسجة الجسدية5،،من1213، نستخدم متحولة الغدد التناسلية أقل لتركيز التحليل على البروتين إينسولوبيليتي في أنسجة غير الإنجابية. طريقة عرض تمكين تحليل مجاميع كبيرة تستعصي على الحل عالية، والتي غير قابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي 0.5% والأعلاف بسرعة الطرد المركزي منخفضة نسبيا. بدلاً من ذلك، تم وضع بروتوكول استخراج أقل صرامة لجمع مجاميع أصغر وأكثر قابل للذوبان أيضا نشرها في أماكن أخرى من10. وبالإضافة إلى ذلك، يصف لنا الطريقة المستخدمة لتقييم التجميع في فيفو في C. ايليجانس.
عموما، يمكن تقييم هذه الأساليب في تركيبة مع تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) دور مورثة اهتمام بتحوير تجميع البروتين تعتمد على العمر. ولهذا يصف لنا تحليل مقتطفات من الديدان الصغار والمسنين مع أو بدون ضربة قاضية من البروتين محددة تهم استخدام [رني]. هذه الأساليب ينبغي أن تكون أداة قوية لتحديد مكونات شبكة الاتصال بروتيوستاسيس تنظيم إينسولوبيليتي البروتين. مداخلات عديدة مثل خفض الأنسولين/يشبه الأنسولين عامل النمو (IGF) 1 إشارات (IIS) قد ثبت بشكل كبير تأخير C. ايليجانس الشيخوخة14. مسارات طول العمر غالباً ما يحفز آليات مراقبة نوعية البروتين وهكذا هذه المسارات يمكن أن يكون نشاط التأثير على معدل التراكم البروتين. وكمثال على ذلك، علينا أن نظهر التجميع انخفاض البروتين المتأصلة في الحيوانات المعمرة على تثبيط مسار IIS7.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ونحن التقرير منهجية لعزل البروتين عالية الذوبان المجاميع من الشيخوخة C. ايليجانس تعرض ل [رني] لتحليل الطيف الكتلي والنشاف الغربية. ونحن تبين أن تحسين بروتيوستاسيس بخفض IIS إلى حد كبير يحول دون تجميع البروتين تعتمد على العمر. عن طريق تحديد البروتينات المعرضة لتجميع معين أوفيريكسبري?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من دزني وماري كوري منحة الإدماج الدولي (322120 إلى D.C.D.)
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
