Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Dit manuscript wordt beschreven van een protocol bij isolaat en cultuur osteoclasten in vitro uit beenmerg van de muis, en te bestuderen van de rol van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 in osteoclast vorming.

Abstract

Osteoclasten zijn unieke bot-resorbeerbare cellen die van de bloedlijn monocyt/macrophage van beenmerg onderscheiden. Dysfunctie van osteoclasten kan resulteren in een reeks van bot metabole ziekten, met inbegrip van osteoporose. Ontwikkeling van farmaceutische doelstellingen voor de preventie van pathologische massa botverlies, moeten de mechanismen waarmee osteoclasten van precursoren onderscheiden worden begrepen. De mogelijkheid om te isoleren en een groot aantal osteoclasten in vitro cultuur is van cruciaal belang om te bepalen van de rol van specifieke genen bij osteoclast differentiatie. Inactivering van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 (TORC1) in osteoclasten kan verminderen osteoclast nummer en verhoging van de botmassa; echter de onderliggende mechanismen nader moeten worden onderzocht. In de huidige studie, wordt een RANKL gebaseerde protocol cultuur osteoclasten uit beenmerg van de muis te isoleren en te bestuderen of de invloed van mTORC1 inactivatie op osteoclast vorming beschreven. Dit protocol met succes geleid tot een groot aantal reus osteoclasten, meestal binnen een week. Schrapping van de Raptor verminderde osteoclast vorming en daalde de activiteit van secretoire tartraat-resistente zure fosfatase, die aangeeft dat mTORC1 is van cruciaal belang voor osteoclast vorming.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bot is een orgaan steeds veranderende en is gerenoveerd door botcellen en osteoclasten gedurende het hele leven. Osteoclasten zijn verantwoordelijk voor gemineraliseerde matrix resorptie en botcellen synthetiseren en afscheiden van nieuw bot matrices1. Het evenwicht tussen resorptie van het been en been vorming is van cruciaal belang voor de gezondheid van de botten met inbegrip van onderhoud van bot massa en respons op stimulatie en schade. Als dit evenwicht is verstoord, kan een reeks van metabole ziekten bot optreden, met inbegrip van osteoporose en parodontale ziekten. In deze ziekten overschrijdt massale botverlies als gevolg van osteoclastic bot resorptie het bot vormen capaciteit van botcellen2,3. Het is dus, teneinde farmaceutische doelstellingen voor de behandeling van skeletstoornissen zoals osteoporose, kritiek te begrijpen van de generatie en de biologie van osteoclasten4.

Osteoclasten zijn unieke giant multinucleaire cellen zich op of in de buurt van het oppervlak van bot en behoren tot de familie van monocyt/macrofaag1. Ibbotson K. J. et al. een methode voor het genereren van osteoclast-achtige cellen in vitro met medium met 1,25-dihydroxy-vitamine D35gemeld. De identificatie van macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator voor nuclear factor-Kappa B ligand (RANKL) als essentiële factoren van osteoclast formatie is sterk toegenomen de efficiëntie van de osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. de mogelijkheid om cultuur osteoclasten in vitro verbeterd ons begrip van de generatie en regulering van de osteoclasten.

Het zoogdier/mechanistische doel van rapamycin (mTOR) functies in twee structureel en functioneel verschillende complexen, namelijk mTORC1 en mTORC28,9. De twee multi eiwitcomplexen zijn verschillend van elkaar als gevolg van hun verschillende componenten en de stroomafwaartse substraten. mTORC1 bevat de unieke regelgevende-geassocieerde proteïne van mTOR (Raptor), terwijl mTORC2 de rapamycin-ongevoelig metgezel van mTOR (Rictor)9 bevat. mTORC1 kan integreren en zenden belangrijke signalen voor het regelen van de celgroei, proliferatie en differentiatie. Onlangs, we laten zien dat mTORC1 speelt een sleutelrol in het netwerk van katabole bot resorptie door schrapping van de Raptor naar de inactivering van mTORC1 in de osteoclasten10. Echter de onderliggende mechanismen nader moeten worden onderzocht. In de huidige studie, werd een RANKL gebaseerde osteoclastogenic-methode gebruikt voor het genereren van osteoclasten uit beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs) van wild-type (WT) en RapCtsk muizen, en te bestuderen van de invloed van mTORC1 inactivatie op osteoclast vorming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedures met betrekking tot de dieren werden uitgevoerd volgens het protocol goedgekeurd door het Stanford administratieve Panel op Laboratory Animal Care (APLAC) en zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van het Shanghai Institute of Biochemistry en de cel Biologie.

1. voorbereiding

  1. Genereren van osteoclast specifieke Raptor schrapping muizen (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, hiernamaals RapCtsk) door de paring Raptorfl/fl muizen met Ctsk-cre muizen. Gebruik de Raptorfl/fl muizen als het besturingselement van de WT in deze studie.
  2. Het hebben van een container met ijs te houden geïsoleerd bot.
  3. Bereiden kweekmedium.
    1. Bereiden α-MEM-kweekmedium door minimale essentiële middellange alpha (α-MEM) met 1 x glutamine, penicilline-streptomycine en foetaal kalfsserum 10% aan te vullen.
    2. Bereiden van beenmerg macrofaag inductie medium bestaande uit α-MEM medium en M-CSF 50 mL bij 20 ng/mL.
    3. Osteoclast inductie medium uit M-CSF en RANKL bij 20 ng/mL, respectievelijk, in 50 mL van α-MEM medium voor te bereiden.
  4. De volgende buffers voorbereiden voordat u OVERVULLING kleuring.
    1. Fix oplossing bestaande van 6,5 mL aceton, 2,5 mL citraatoplossing en 0,8 mL van 37% (vol/vol) formaldehyde-oplossing te bereiden.
    2. TRAP kleurstofoplossing voor te bereiden.
      1. Prewarm gedeïoniseerd water tot 37 ° C.
      2. Voeg 100 µL van snel garnet GBC-basisoplossing en 100 µL van natrium nitriet oplossing in een microtube 1.5-mL en meng door zachte inversie 30 s. verlof het mengsel te staan gedurende 2 minuten.
      3. Prewarm 9 mL gedeïoniseerd water tot 37 ° C. Voeg 200 µL van diazotized snel garnet GBC basisoplossing uit stap 1.4.2.2, 100 µL van naftol AS-BI-oplossing, 400 µL van acetaat oplossing en 200 µL tartraatoplossing.
      4. Houden van de val kleurstofoplossing van het mengsel in een waterbad bij 37 ° C.
  5. Voorbereiding van de volgende buffer voordat TRAP activiteit kwantificering van kweekmedium.
    1. Bereiden tartraat buffer (50 mL): 2 mL van 0.33 M L-wijnsteenzuur, 48 mL van 0.33 M natriumkaliumtartraat dibasische uitdrogen. De pH-waarde tot 4,9 aanpassen.
    2. Fosfaatbuffer Dinatrium (pNPP) de 4-nitrofenyl (200 mL) bereiden: 1.502 g van glycine, 41 mg MgCl2, 27.2 mg ZnCl2en 180 mL gedeïoniseerd water. Pas de pH-waarde te 10.4 met 3 M NaOH en het volume tot 200 mL met gedeïoniseerd water.
    3. Voorbereiden pNPP buffer met fosfatase substraat (een 96-wells-plaat): 49.37 mg fosfatase substraat en 175 µL van pNPP buffer van stap 1.5.2.
    4. Substraat buffer (9 mL/96-wells-plaat) bereiden: 6.24 mL gedeïoniseerd water en 360 μL van acetaat oplossing 2.4 mL tartraatoplossing buffer. Meng door vortex en verwarm bij 37 ° C vóór gebruik.
    5. Voeg 90 l pNPP buffer met fosfatase substrate(1.5.3) 9 ml voorverwarmde substraat buffer(1.5.4) te maken van een mengsel van het substraat en vortex voor 10 s.

2. dissectie (dag -1)

  1. Euthanaseren 3 één-maand-oude vrouwelijke WT en RapCtsk muizen door CO2 afzonderlijk. Uitvoeren van CO2 inhalatie met geschikte apparatuur door geschoold personeel.
  2. Onderdompelen 6 muizen in een bekerglas met 100 mL 75% ethanol (vol/vol) voor 5 min ter voorkoming van bacteriële besmetting en vervolgens plaats op een bord van de dissectie in een liggende positie. Maken van een incisie in de distale van het scheenbeen verticaal en ontleden de huid langs de hind-limb met ophthalmic schaar.
  3. Snijd het articulaire ligament van het heupgewricht met een schaar en ontreddering van de ledematen van hind uit de kofferbak.
  4. Knip het articulaire ligament van het kniegewricht en zorgvuldig distantiëren van het scheenbeen en het dijbeen van het kniegewricht. Verwijder voorzichtig het zachte weefsel met een schaar.
  5. Plaats alle beenderen van één genotype in van een muis in ieder putje van een zes-well-plate met 2 mL van α-MEM op ijs.
    Opmerking: Om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden, het been moet worden gehouden in deze omstandigheden voor minder dan 1 uur.

3. isolatie (dag -1)

  1. Vul één putje van de plaat van een zes-well met 75% ethanol (3 mL) en de andere 5 putten met α-MEM medium (3 mL).
  2. Zet alle beenderen van één genotype in de ethanol wassen voor 15 s en wassen botten 5 keer met α-MEM medium voor 10 s telkens.
  3. Afgesneden de epifyses met de schaar en invoegen van een 0,45 mm spuit-naald in de holte en flush beenmerg uit met α-MEM medium in een centrifugebuis van 50 mL.
  4. Spoel de holte van de bot gebruikend de zelfde methode uit het andere uiteinde van het bot. Herhaal dit ten minste tweemaal om te wassen de bot holte grondig totdat het been bleek is.
  5. Centrifugeer het beenmerg om te verkrijgen van een cel pellet bij 800 x g en 4 ° C gedurende 5 min. Aspirate het supernatant.
  6. Voeg 3 mL lysis-buffermengsel van rode bloedcellen in de centrifugebuis en pipet zachtjes aan resuspendeer de beenmerg. Houd de centrifugebuis op ijs gedurende 8 minuten lyse van rode bloedcellen.
  7. Voeg 6 mL van α-MEM medium in de centrifugebuis te stoppen van lysis van de cel. Centrifugeer bij 500 x g- en 4 ° C gedurende 10 minuten en het supernatant gecombineerd.
  8. Resuspendeer in 3 mL α-MEM-kweekmedium en plaats van de cellen in een zes-well plaat (over het algemeen één muis per putje).
  9. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator's nachts.

4. plating (dag 0)

  1. Het supernatant overbrengen in een centrifugebuis 15 mL voor het verzamelen van de niet-vastgemaakte cellen de volgende ochtend.
  2. Centrifugeer bij 800 x g- en 4 ° C gedurende 5 minuten en het supernatant gecombineerd.
  3. Resuspendeer in 4 mL α-MEM-kweekmedium.
  4. Neem 20 µL van de cel-oplossing en meng met 20 µL van Trypan Blue. 10 µL van het mengsel aan de tellen kamer toevoegen en het aantal cellen per mL van de oplossing te verkrijgen.
  5. Het toevoegen van een passende omvang van α-MEM-kweekmedium aan het verkrijgen van een mobiele oplossing van 500.000 cellen/mL.
  6. Voeg toe 500 µL en 50 µL van het beenmerg macrofaag inductie medium in elk putje van een 24-well plaat en 96-wells-plaat, respectievelijk.
  7. Voeg toe 500 µL en 50 µL van cell oplossing in ieder putje van een 24-well plaat en 96-wells-plaat, respectievelijk.
  8. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 3 dagen.

5. differentiatie (3-7 dagen)

  1. Drie dagen na de beplating, 50 µL medium verzamelen van elk putje van de 96-well-plate bevriezen bij-20 ° C en vervolgens gecombineerd het residuele medium.
  2. Voeg 1 mL en 100 µL osteoclast inductie medium in elk putje van de plaat van een 24-well en een 96-wells-plaat, respectievelijk.
  3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 dagen.
  4. Verzamelen elk putje 50 µL van medium en het resterende medium gecombineerd.
  5. Osteoclast inductie medium in elk putje toevoegen.
  6. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 dag.
    Opmerking: Op dit punt van tijd, grote, multinucleaire osteoclasten moeten worden gezien onder een omgekeerde Microscoop (figuur 2A).
  7. Als osteoclasten niet worden gezien, wijzigt u het osteoclast inductie medium en dagelijks observeren totdat osteoclasten worden gezien.
  8. Verzamel 50 µL van medium van elk putje van de 96-wells-plaat nadat osteoclasten hebben gevormd.

6. tartraat resistente zure fosfatase (TRAP) kleuring

Opmerking: Volwassen osteoclasten mag na 6-7 dagen van in vitro cultuur (stap 4).

  1. Medium gecombineerd en spoel zachtjes 3 keer met 1 x PBS.
  2. Bevestigen van de cellen in elk putje van de 96-wells-plaat met 100 µL van fix oplossing voor 30 s bij kamertemperatuur.
  3. Na fixatie, de fix-oplossing gecombineerd en zachtjes 3 keer te wassen met gedeïoniseerd water voorverwarmde tot 37 ° C. Gecombineerd gedeïoniseerd water.
  4. Voeg 100 µL van de TRAP vlek in elk putje van de 96-wells-plaat en plaats van de plaat in een incubator bij 37 ° C voor 30 min en schild van licht.
  5. Na kleuring, gecombineerd de TRAP vlek en voorzichtig wassen 3 keer met gedeïoniseerd water.
  6. Afbeelding osteoclasten met behulp van een omgekeerde Microscoop op 40 X vergroting.

7. TRAP activiteit kwantificering van kweekmedium

  1. Verzamelen 30 µL cultuur supernatant van elk putje van de 96-wells-plaat uit stap 5.1, 5.4 en 5.8; Gebruik 30 µL van niet-gekweekte osteoclast inductie medium als de negatieve controle. Leg de monsters in een nieuwe 96-wells-plaat.
  2. Voeg 90 μL van substraat mixture(1.5.5) in elk putje van de 96-wells-plaat.
  3. Plaats de plaat in een incubator bij 37 ° C voor 1 h en schild van licht.
  4. Zet de reactie stop door 50 µL van 3 M NaOH in elk putje van de 96-wells-plaat toe te voegen.
  5. Meten van theabsorbance bij de golflengte van 405 nm.

8. westelijke bevlekken

Opmerking: Na 6-7 dagen van in vitro cultuur in de 24-well plaat, volwassen osteoclasten zichtbaar moeten zijn.

  1. Het medium gecombineerd.
  2. Voorzichtig wassen met vooraf gekoeld 1 x PBS 3 keer.
  3. Gecombineerd PBS.
  4. Voeg 100 µL van 1 x SDS lysis buffer met proteaseinhibitor cocktail.
  5. Warmte lysates bij 105 ° C gedurende 10 minuten en centrifuge op 12.000 × g- en 4 ° C voor 10 min. verzamelen het supernatant die eiwitten bevatten.
  6. Scheid de lysates 30 µg eiwit bevattende 10% SDS-pagina11 en vervolgens overbrengen naar een membraan Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride.
  7. Het blokkeren van de membranen met 5% nonfat melk gedurende 30 minuten.
  8. Incubeer de membranen met anti-Raptor anti-P-S6, S6-anti, anti-β-actine bij 1:1,000 verdunning in de nonfat melk 5% bij 4 ° C's nachts.
  9. Het wassen van de membranen met Tris gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBST) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Herhaal stap 8,9 tweemaal.
  11. Incubeer de membranen met horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd anti-muis of konijn IgG antilichamen bij 1:5,000 verdunning in de nonfat melk 5% gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  12. Het wassen van de membranen 3 keer met TBST gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Voor de chemiluminescentie detectie, voeg westerse chemiluminescentie HRP substraat op de membranen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Afvoer van het overtollige substraat en bloot de vlekken X-ray film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Met behulp van dit protocol, werden een groot aantal reus osteoclasten gezien op dag 6; Als giant osteoclasten niet gezien zijn, een dag van osteoclast differentiatie mogelijk nodig (Figuur 1). Succesvolle osteoclast vorming werd bevestigd door val kleuring (figuur 2A). Osteoclasten waren gigantische wijn rood/paars cellen met meer dan 3 kernen. Meer dan 250 osteoclasten werden verkregen in elk putje van de 96-wells-plaat in WT BMMs (figuur 4A).

Schrapping van de Raptor werd bevestigd door Westelijke Bevlekkende analyse en de inactivering van mTORC1 werd bepaald door een afname van de ribosomal proteïne S6 fosforylatie (P-S6), die veel als de uitlezing voor mTORC1 gebruikt wordt (Figuur 3).

Het aantal TRAP-positieve osteoclasten daalde in RapCtsk BMMs in vergelijking met de WT-groep (figuur 4A), die aangegeven dat Raptor deficiëntie osteoclast vorming verminderde.

De activiteit van secretoire TRAP is belangrijk voor bot resorptie, en TRAP activiteit in het kweekmedium werd geanalyseerd in de huidige studie. Zoals blijkt uit figuur 4B, TRAP activiteit steeg als gevolg van de stimulatie van RANKL in zowel WT en RapCtsk BMMs. Daarnaast val activiteit daalde in RapCtskBMMs vergeleken met de corresponderende WT-groep (P < 0,05).

Figure 1
Figuur 1: Schematisch diagram van het protocol van de inductie osteoclast. BMMs waren geïsoleerd op dag 1 en geïncubeerd met medium fundamentele α-MEM's nachts. Op dag 0, werden BMMs verzameld en vergulde op een 96-wells-plaat en de plaat van de 24-well gevolgd door incubatie in α-MEM medium met 10 ng/mL M-CSF. Op dag 3, werd het medium veranderd naar α-MEM medium met 20 ng/mL M-CSF en 20 ng/mL RANKL voor inductie van osteoclast differentiatie. Op dag 5 veranderde het osteoclast differentiatie medium. Op dag 6, een groot aantal osteoclasten zichtbaar waren en osteoclast tests werden uitgevoerd. Als botcellen niet zichtbaar waren, het osteoclast inductie medium werd veranderd en incubatie gedurende één dag voortgezet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: representatieve weergave van osteoclasten. (A) reus osteoclasten waargenomen in heldere veld op dag 6. De rode lijn die de grens van osteoclasten. (B) een typisch reus, multinucleaire, TRAP positief (wijn rood) osteoclast. De zwarte pijl aangegeven twee kernen van de multinucleaire osteoclast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: mTORC1 inactivatie in RapCtsk BMMs. Western blotting analyse van Raptor, P-S6 en S6 meningsuiting in WT en RapCtsk BMMs op dag 6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Schrapping van de Raptor verminderde osteoclast vorming. (A) TRAP kleuring van BMMs op dag 6. Hoge vergroting beelden van de pleinen in WT en RapCtsk groepen worden weergegeven, respectievelijk. Er waren minder reus, TRAP positieve osteoclasten gevormd in de RapCtsk BMMs in vergelijking met de WT-groep. (B) TRAP activiteit van gekweekte WT en Ctsk Rap BMMs. gegevens vertegenwoordigen betekent ± S.D.* P < 0,05, n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De bepaling van de osteoclastogenic is de wijdst gebruikte methode cultuur osteoclasten in vitro12,13te isoleren. Terwijl verscheidene RANKL gebaseerde osteoclast inducties beschreven13,14,15 zijn, wordt in de huidige studie een protocol met enkele aanpassingen op basis van de bovenstaande methoden beschreven.

In de vorige studie, waren BMMs plating onmiddellijk na isolatie14,15. Het wordt afgeraden om dat BMMs werden gekweekt met voedingsbodem 's nachts voordat plating BMMs isoleren van mesenchymale stamcellen en fibroblasten, die onmiddellijk aan de schotel. M-CSF kan de verspreiding van monocyten naar osteoclast precursoren bevorderen en osteoclast precursoren te drukken rang die bindt RANKL en vervolgens induceert de vorming van volwassen osteoclasten6,16,17. Daarom in onze studie, werden de BMMs geïnduceerde met 10 ng/mL M-CSF voor 3 dagen vóór de osteoclast inductie, in plaats daarvan voor osteoclast inductie op de tweede dag na15plating. De celdichtheid is essentieel voor osteoclast vorming in vitro. Het wordt aanbevolen dat 25.000 BMMs werden zaadjes in ieder putje van een 96-wells-plaat aanhang door 3 dagen incubatie met 10 ng/mL M-CSF. Wanneer de cel samenvloeiing bereikt 80 – 90%, is het een geschikte tijd voor osteoclast inductie van RANKL. Meestal oudere vorm van de osteoclasten op dag 6. De meest voorkomende reden voor paar osteoclasten is suboptimaal celdichtheid, die kan het resultaat van een lage seeding dichtheid of de levensvatbaarheid van de laag cellen. BMMs gevoelig primaire cellen zijn en moeten voorzichtig worden behandeld. Het bot op ijs te houden voor een lange tijd of krachtig resuspending verlaagt de levensvatbaarheid van de BMMs en vervolgens schaadt de vorming van osteoclasten. Dus, de optimale seeding dichtheid van levensvatbare BMMs is essentieel voor het verkrijgen van een groot aantal osteoclasten.

De activiteit van secretoire TRAP is essentieel voor osteoclastic bot resorptie. In deze studie beschrijven we een methode om de secretoire activiteit van de TRAP in het kweekmedium kwantitatief te analyseren. De wijziging in de werkzaamheden van de TRAP in het kweekmedium kan ontstaan door wijzigingen van osteoclast getal of secretoire TRAP osteoclast of een combinatie van beide. Dus, dit mogelijk een handige methode voor het analyseren van osteoclast functie in vitro samen met de bepaling van de resorptie osteoclast eerder beschreven18.

mTOR is een evolutionair geconserveerd proteïne kinase die cel stofwisseling en differentiatie9kunt regelen. In deze studie vonden we dat mTORC1 een belangrijke rol gespeeld in bot resorptie door het reguleren van osteoclast vorming. mTORC1 kunnen een potentieel farmacologische doelwit voor de behandeling van bot stofwisselingsziekten zoals osteoporose in de toekomst.

Kortom, ons protocol voor osteoclast inductie succesvol resulteerde in een groot aantal reus osteoclasten in vitro en onze gegevens blijkt dat mTORC1 is van cruciaal belang voor osteoclast vorming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs vermelden dat ze geen conflicten van interesse hebben.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Minghan Tong en S. Kato vriendelijk bieden reagentia en muizen. Wij danken de leden van de lab Zou voor nuttige discussies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van 973 Program van het Chinese ministerie van wetenschap en technologie (MOST) [2014CB964704 en 2015CB964503], klinische Research Program van 9e People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Bedankt voor de hulp van Core faciliteit voor Core faciliteit voor chemische biologie, celbiologie en CAS Center for Excellence in de moleculaire cel Science, Shanghai Instituut voor Biochemie en celbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter