Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.

Abstract

Gli osteoclasti sono unico osso-resorbing cellule che si differenziano da monocito/macrofagica del midollo osseo. Una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso osteoporosi può provocare disfunzione degli osteoclasti. Per sviluppare obiettivi farmaceutici per la prevenzione della perdita di massa ossea patologica, si devono intendere i meccanismi da cui gli osteoclasti differenziano dai precursori. La capacità di isolare e un gran numero di osteoclasti in vitro della coltura è fondamentale al fine di determinare il ruolo di geni specifici nel corso del differenziamento degli osteoclasti. Inattivazione del mammiferi/meccanicistica bersaglio della rapamicina complesso 1 (TORC1) in osteoclasti può diminuire il numero degli osteoclasti e aumentare la massa ossea; Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nello studio presente, un protocollo basato su RANKL per isolare e cultura osteoclasti da midollo osseo di topo e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 sulla formazione degli osteoclasti è descritto. Questo protocollo ha provocato con successo un gran numero di osteoclasti giganti, in genere entro una settimana. Eliminazione di Raptor alterata formazione di osteoclasti ed ha fatto diminuire l'attività secretiva fosfatasi acida tartrato-resistente, che indica che mTORC1 è essenziale per la formazione degli osteoclasti.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dell'osso è un organo mutevole ed è ristrutturato da osteoblasti e osteoclasti per tutta la vita. Gli osteoclasti sono responsabili del riassorbimento di matrice mineralizzata e osteoblasti sintetizzano e secernono nuovo osso matrici1. L'equilibrio tra la formazione dell'osso e riassorbimento dell'osso è cruciale per salute dell'osso, compreso il mantenimento di ossa massa e la risposta alla stimolazione e lesioni. Se questo equilibrio viene interrotto, può verificarsi una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso l'osteoporosi e le malattie parodontali. In queste malattie, perdita di massa ossea derivante da riassorbimento osteoclastic dell'osso supera l'osso formando la capacità di osteoblasti2,3. Così, al fine di sviluppare obiettivi farmaceutici per il trattamento di patologie ossee come l'osteoporosi, è fondamentale per capire la generazione e la biologia di osteoclasti4.

Gli osteoclasti sono cellule multinucleated giganti uniche situate in o vicino alla superficie dell'osso e appartengono alla famiglia del monocito/macrofago1. Ibbotson K. J. et al. segnalato un metodo per generare osteoclast-come le cellule in vitro con mezzo contenente 1,25-diidrossi-vitamina D35. L'identificazione del fattore di stimolazione della macrofago-colonia (M-CSF) e attivatore del recettore per il ligando di nuclear factor-κ B (RANKL) come fattori essenziali della formazione degli osteoclasti è aumentato drammaticamente l'efficienza di osteoclastogenesi in vitro 1 , 6 , 7. la capacità di cultura osteoclasti in vitro ha migliorato la nostra comprensione della generazione e regolamento degli osteoclasti.

La destinazione dei mammiferi/meccanicistica rapamycin (mTOR) funzioni in due complessi strutturalmente e funzionalmente distinte, vale a dire mTORC1 e mTORC28,9. I due complessi della multi-proteina sono distinti gli uni dagli altri a causa dei loro diversi componenti e substrati a valle. mTORC1 contiene la proteina unica regolamentazione-collegata di mTOR (Raptor), mentre mTORC2 contiene il compagno rapamicina-insensibile di mTOR (Rictor)9. mTORC1 è in grado di integrare e trasmettere segnali importanti per regolare la crescita cellulare, la proliferazione e la differenziazione. Recentemente, abbiamo dimostrato che mTORC1 svolge un ruolo chiave nella rete di riassorbimento dell'osso catabolico dall'eliminazione di Raptor per inattivare mTORC1 in osteoclasti10. Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nel presente studio, un metodo basato su RANKL osteoclastogenico è stato usato per generare gli osteoclasti da derivate da midollo osseo macrofagi (saggi) di wild-type (WT) e topi RapCtsk e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 su osteoclasto formazione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite secondo il protocollo approvato dal pannello amministrativo, Stanford su cura degli animali di laboratorio (APLAC) e sono state approvate dal comitato di uso della Shanghai Istituto di biochimica e cellulare e cura degli animali Biologia.

1. preparazione

  1. Generare degli osteoclasti specifico Raptor eliminazione topi (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, aldilà RapCtsk) dall'accoppiamento Raptorfl/fl topi con Ctsk-cre topi. Utilizzare i mouse Raptorfl/fl come controllo WT in questo studio.
  2. Dispone di un contenitore con ghiaccio per mantenere isolato dell'osso.
  3. Preparare il terreno di coltura.
    1. Preparare il terreno di coltura α-MEM completando il minimo essenziale alfa medio (α-MEM) 1 x glutammina, penicillina-streptomicina e 10% di siero fetale di vitello.
    2. Preparare il supporto di induzione di macrofago del midollo osseo costituito da 50 mL di medium di α-MEM e M-CSF a 20 ng/mL.
    3. Preparare il supporto di induzione di osteoclasto consistente di M-CSF e RANKL a 20 ng/mL, rispettivamente, in 50 mL di terreno di α-MEM.
  4. Preparare i buffer seguenti prima della colorazione della trappola.
    1. Preparare la soluzione di fix composto da 6,5 mL di acetone, 2,5 mL di soluzione di citrato e 0,8 mL di soluzione (vol/vol) formaldeide al 37%.
    2. Preparare la trappola soluzione di colorazione.
      1. Preriscaldare la acqua deionizzata a 37 ° C.
      2. Aggiungere 100 µ l di soluzione di base fast garnet GBC e 100 µ l di soluzione di nitrito di sodio in una microprovetta 1,5 mL e mescolare capovolgendo delicatamente per 30 s. lasciate il composto riposare per 2 min.
      3. Preriscaldare la 9 mL di acqua deionizzata a 37 ° C. Aggiungere 200 µ l di soluzione di diazotized fast garnet GBC base dal punto 1.4.2.2, 100 µ l di soluzione di fosfato del naftolo AS-BI, 400 µ l di soluzione di acetato e 200 µ l di soluzione di tartrato.
      4. Mantenere la trappola macchiatura soluzione di miscela in un bagno di acqua a 37 ° C.
  5. Preparare il tampone di seguenti prima di quantificazione di attività di trappola del terreno di coltura.
    1. Preparare il tampone di tartrato (50 mL): 2 mL di acido L-tartarico 0,33 M, 48 mL di 0,33 M tartrato di sodio bibasico disidratare. Regolare il pH a 4.9.
    2. Preparare 4-nitrofenil fosfato disodico (pNPP) tampone (200 mL): 1,502 g di glicina, 41 mg di MgCl2, 27,2 mg di ZnCl2e 180 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH a 10.4 con 3 M NaOH e il volume di 200 mL con acqua deionizzata.
    3. Preparare il tampone di pNPP con substrato fosfatasi (per una piastra a 96 pozzetti): 49,37 mg di substrato fosfatasi e 175 µ l di tampone di pNPP di passaggio 1.5.2.
    4. Preparare il tampone substrato (9 mL/96 pozzetti): 6,24 mL di acqua deionizzata, 360 μL di soluzione di acetato e 2,4 mL di tampone tartrato. Mescolare Vortex e preriscaldate a 37 ° C prima dell'uso.
    5. Aggiungere 90 μL di tampone di pNPP con fosfatasi substrate(1.5.3) a 9ml di substrato preriscaldato buffer(1.5.4) per fare una miscela di substrato e vortexare per 10 s.

2. dissezione (giorno -1)

  1. Eutanasia 3 topi femminili della WT e RapCtsk del one-month-old di CO2 separatamente. Eseguire l'inalazione di CO2 con attrezzature adeguate da personale addestrato.
  2. Immergere 6 topi in un becher con 100 mL di etanolo al 75% (vol/vol) per 5 min prevenire la contaminazione batterica e poi posto su una tavola di dissezione in posizione supina. Fare un'incisione presso il distale della tibia verticalmente e sezionare la pelle lungo l'arto con forbici oftalmiche.
  3. Tagliare il legamento articolare dell'articolazione dell'anca con le forbici e dislocare le zampe dal tronco.
  4. Tagliare il legamento articolare dell'articolazione del ginocchio e attentamente dissociare la tibia e femore al giunto di ginocchio. Rimuovere delicatamente il tessuto molle con le forbici.
  5. Posizionare tutte le ossa di un genotipo in un mouse a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di α-MEM sul ghiaccio.
    Nota: Per mantenere la vitalità cellulare, l'osso dovrebbe essere mantenuto in queste condizioni per meno di 1 h.

3. isolamento (giorno -1)

  1. Riempire un pozzetto di una piastra di sei pozzetti con etanolo di 75% (3 mL) e le altre 5 pozzi con mezzo di α-MEM (3 mL).
  2. Mettere tutte le ossa di un genotipo nel lavaggio di etanolo per 15 ossa s e lavare 5 volte con mezzo di α-MEM per 10 s ogni volta.
  3. Tagliare delle epifisi con la forbice e inserire un ago di siringa di 0,45 mm la cavità e a filo del midollo osseo fuori con il mezzo di α-MEM in una provetta da centrifuga da 50 mL.
  4. Sciacquare la cavità dell'osso usando lo stesso metodo da altra estremità dell'osso. Ripetere almeno due volte per lavare accuratamente la cavità dell'osso fino a quando l'osso è pallido.
  5. Centrifugare il midollo osseo per ottenere un pellet cellulare a 800 x g e a 4 ° C per 5 min, aspirare il surnatante.
  6. Aggiungere 3 mL di tampone di lisi delle cellule di anima rosse nella provetta da centrifuga e pipetta dolcemente per risospendere il midollo osseo. Tenere la provetta da centrifuga sul ghiaccio per 8 min a lisare cellule rosse del sangue.
  7. Aggiungere 6 mL di terreno di α-MEM nella provetta da centrifuga per interrompere lisi cellulare. Centrifugare a 500 x g e a 4 ° C per 10 min e aspirare il supernatante.
  8. Risospendere in 3 mL di terreno di coltura di α-MEM e inserire le celle in una piastra a 6 pozzetti (generalmente un mouse per pozzetto).
  9. Incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% durante la notte.

4. placcatura (giorno 0)

  1. Trasferire il surnatante in una provetta per centrifuga 15 mL per raccogliere le cellule non attaccate la mattina successiva.
  2. Centrifugare a 800 x g e a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante.
  3. Risospendere in 4 mL di terreno di coltura di α-MEM.
  4. Prendere 20 µ l della soluzione cella e mescolare con 20 µ l di Trypan Blue. Aggiungere 10 µ l della miscela nella camera di conteggio e ottenere il conteggio delle cellule per mL di soluzione.
  5. Aggiungere un volume adeguato di α-MEM di coltura per ottenere una soluzione di cella di 500.000 cellule/mL.
  6. Aggiungere 500 µ l e 50 µ l di terreno di induzione di midollo osseo del macrofago in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.
  7. Aggiungere 500 µ l e 50 µ l di soluzione di cella in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.
  8. Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 3 giorni.

5. differenziazione (giorni 3-7)

  1. Tre giorni dopo il placcaggio, raccogliere medio di 50 µ l di ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e congelare a-20 ° C e quindi aspirare il mezzo residuo.
  2. Aggiungere 1 mL e 100 µ l degli osteoclasti induzione media in tutti i pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e una piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.
  3. Incubare a 37 ° C per 2 giorni.
  4. Raccogliere 50 µ l di terreno da ogni pozzetto e aspirare il mezzo residuo.
  5. Aggiungere mezzo induzione degli osteoclasti in ciascun pozzetto.
  6. Incubare a 37 ° C per 1 giorni.
    Nota: A questo punto del tempo, grandi, multinucleated osteoclasti dovrebbero essere visto sotto un microscopio invertito (Figura 2A).
  7. Se non si vedono gli osteoclasti, cambiare il mezzo di induzione degli osteoclasti e osservare quotidianamente fino a quando gli osteoclasti sono visti.
  8. Raccogliere 50 µ l di terreno da ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti dopo gli osteoclasti sono formate.

6. tartrato fosfatasi acida resistente (TRAP) colorazione

Nota: Gli osteoclasti maturi possono essere presenti dopo 6-7 giorni di coltura in vitro (passaggio 4).

  1. Medio di aspirare e lavare delicatamente 3 volte con 1x PBS.
  2. Fissare le cellule in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti con 100 µ l di soluzione di correzione per 30 s a temperatura ambiente.
  3. Dopo la fissazione, aspirare la soluzione di fix e lavare delicatamente 3 volte con acqua deionizzata preriscaldata a 37 ° C. Aspirare acqua deionizzata.
  4. Aggiungere 100 µ l di macchia TRAP in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min e scudo dalla luce.
  5. Dopo la colorazione, aspirare la macchia di trappola e delicatamente lavare 3 volte con acqua deionizzata.
  6. Osteoclasti immagine utilizzando un microscopio invertito a 40 ingrandimenti.

7. trappola attività quantificazione del terreno di coltura

  1. Raccogliere il supernatante di coltura di 30 µ l di ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti dal passaggio 5.1, 5.4 e 5.8; Utilizzare 30 µ l di terreno di induzione di osteoclasto non coltivate come controllo negativo. Posizionare i campioni in una nuova piastra a 96 pozzetti.
  2. Aggiungere 90 μL di mixture(1.5.5) di substrato in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.
  3. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 h e scudo dalla luce.
  4. Fermare la reazione aggiungendo 50 µ l di 3 M NaOH in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.
  5. Misurare la theabsorbance alla lunghezza d'onda di 405 nm.

8. Western Blotting

Nota: Dopo 6-7 giorni di cultura in vitro della piastra a 24 pozzetti, osteoclasti maturi dovrebbero essere visibili.

  1. Aspirare il mezzo.
  2. Lavare delicatamente con pre-raffreddata 1X PBS 3 volte.
  3. Aspirare il PBS.
  4. Aggiungere 100 µ l di 1 x SDS lysis buffer contenente l'inibitore della proteasi cocktail.
  5. Lisati di calore a 105 ° C per 10 min e centrifugare a 12.000 × g e 4 ° C per 10 min. raccogliere i surnatanti contenenti proteine.
  6. Separare i lisati contenenti 30 µ g di proteina di 10% SDS-PAGE11 e poi il trasferimento ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF).
  7. Bloccare le membrane con 5% latte scremato per 30 min.
  8. Incubare le membrane con anti-Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-actina a diluizione 1:1,000 in 5% latte scremato a 4 ° C durante la notte.
  9. Lavare le membrane con Tris isotonico con Tween-20 (TBST) per 10 min a temperatura ambiente.
  10. Ripetere il passaggio 8,9 due volte.
  11. Incubare le membrane con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato gli anticorpi di IgG anti-topo o coniglio alla diluizione di 1:5,000 in 5% latte scremato per 1 h a temperatura ambiente.
  12. Lavare le membrane 3 volte con TBST per 10 min a temperatura ambiente.
  13. Per rilevazione chemiluminescente, aggiungere substrato chemiluminescente occidentale di HRP sulle membrane e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Drenare il substrato in eccesso ed esporre le macchie a pellicola di raggi x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utilizzando il presente protocollo, un gran numero di osteoclasti giganti sono stato veduto il giorno 6; Se non si vedono gli osteoclasti giganti, un altro giorno di differenziazione di osteoclasto può essere necessari (Figura 1). Formazione di osteoclasti successo è stata confermata dalla trappola macchiatura (Figura 2A). Osteoclasts erano cellule giganti di vino rosso/viola con più di 3 nuclei. Più di 250 osteoclasti sono stati ottenuti in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti in WT saggi (Figura 4A).

Eliminazione di Raptor è stata confermata dall'analisi macchiante occidentale e l'inattivazione di mTORC1 è stato determinato da una diminuzione nella fosforilazione della proteina ribosomale S6 (P-S6), che è ampiamente usato come la lettura di mTORC1 (Figura 3).

Il numero degli osteoclasti TRAP-positiva è diminuito in saggi di RapCtsk rispetto al gruppo WT (Figura 4A), che ha indicato che la carenza di Raptor alterata formazione degli osteoclasti.

L'attività secretiva trappola è importante per il riassorbimento dell'osso, e attività di trappola nel terreno di coltura è stata analizzata nello studio presente. Come mostrato in Figura 4B, trappola attività aumentata dovuto stimolazione del RANKL WT sia saggi RapCtsk . Inoltre, la trappola attività diminuita in saggi di RapCtskrispetto al corrispondente gruppo WT (P < 0,05).

Figure 1
Figura 1: diagramma schematico del protocollo di induzione di osteoclasto. Saggi sono sono isolati il giorno 1 e incubati con il mezzo di base α-MEM durante la notte. Il giorno 0, saggi sono stati raccolti e piastrate su una piastra a 96 pozzetti e piastra a 24 pozzetti seguita da incubazione in α-MEM medium con 10 ng/mL M-CSF. Il giorno 3, il medium è stato cambiato a mezzo di α-MEM con 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL per induzione di differenziazione degli osteoclasti. Giorno 5, è stato cambiato il mezzo di differenziazione degli osteoclasti. Il giorno 6, un gran numero dei osteoclasts era visibile e degli osteoclasti analisi sono state eseguite. Se osteoblasti non erano visibili, il mezzo di induzione degli osteoclasti è stato cambiato e incubazione ha continuato per un altro giorno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: vista rappresentativo degli osteoclasti. (A) Giant osteoclasti osservato nel campo luminoso il giorno 6. La linea rossa ha delineato il confine degli osteoclasti. (B), un giganti in genere, multinucleated, trappola positivo (vino rosso) degli osteoclasti. La freccia nera indicato due nuclei dell'osteoclasto multinucleated. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: mTORC1 inattivazione in saggi RapCtsk . Western blot analisi dell'espressione di Raptor, P-S6 e S6 in WT e saggi RapCtsk il giorno 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Eliminazione di Raptor alterata formazione di osteoclasti. (A) trappola colorazione dei saggi il giorno 6. Alto ingrandimento immagini delle piazze di WT e RapCtsk gruppi vengono visualizzate, rispettivamente. C'erano meno gli osteoclasti positivi a trappola giganti, formati nei saggi RapCtsk rispetto al gruppo WT. Attività (B), trappola di coltivate WT e RapCtsk saggi. dati rappresentano significa ± S.D.* P < 0.05, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Il dosaggio di osteoclastogenico è il metodo più utilizzato per isolare e cultura gli osteoclasti in vitro12,13. Mentre diversi induzioni degli osteoclasti RANKL-base sono stati descritti13,14,15, lo studio presente ha descritto un protocollo con alcune modifiche sulla base dei metodi precedenti.

Nello studio precedente, saggi erano placcatura immediatamente dopo isolamento14,15. È consigliabile che i saggi sono stati coltivati con terreno di base durante la notte prima di placcatura per isolare i saggi da cellule staminali mesenchimali e fibroblasti che immediatamente aderiscono al piatto. M-CSF possono promuovere la proliferazione dei monociti ai precursori degli osteoclasti e stimolare precursori degli osteoclasti per esprimere RANK che lega RANKL e quindi induce la formazione di osteoclasti maturi6,16,17. Pertanto, nel nostro studio, i saggi sono stati indotti con 10 ng/mL M-CSF per 3 giorni prima dell'induzione degli osteoclasti, invece per l'induzione di osteoclasto il secondo giorno dopo il placcaggio15. La densità delle cellule è fondamentale per la formazione di osteoclasti in vitro. È consigliabile che 25.000 saggi sono stati seminati in ciascun pozzetto di un seguito di piastra a 96 pozzetti di incubazione di 3 giorni con 10 ng/mL M-CSF. Al raggiungimento dell'80-90% alla confluenza delle cellule, è un momento adatto per induzione degli osteoclasti di RANKL. Di solito, maturo modulo osteoclasti il giorno 6. Il motivo più comune per alcuni osteoclasti è densità non ottimale delle cellule, che può essere il risultato di una bassa densità di semina o di attuabilità delle cellule basso. Saggi sono cellule primarie delicate e devono essere trattati con delicatezza. Mantenendo l'osso sul ghiaccio per lungo tempo o risospensione vigorosamente diminuisce la vitalità di saggi e successivamente altera la formazione degli osteoclasti. Così, la densità di semina ottima dei saggi praticabile è fondamentale per l'ottenimento di un gran numero degli osteoclasti.

L'attività secretiva trappola è critica per riassorbimento osteoclastic dell'osso. In questo studio, descriviamo un metodo per analizzare quantitativamente l'attività secretiva trappola nel terreno di coltura. Il cambiamento di attività trappola nel terreno di coltura può derivare da cambiamenti di numero degli osteoclasti o secretiva trappola di osteoclasto o una combinazione di entrambi. Così, questo potrebbe essere un metodo utile per l'analisi degli osteoclasti funzione in vitro insieme con il dosaggio di riassorbimento degli osteoclasti descritto precedentemente18.

mTOR è una chinasi di proteina evolutivamente conservata che regolano il metabolismo e la differenziazione di cellule9. In questo studio, abbiamo trovato che mTORC1 ha giocato un ruolo importante nel riassorbimento dell'osso regolando la formazione degli osteoclasti. mTORC1 può essere un potenziale target farmacologico per il trattamento dei disordini metabolici dell'osso quali osteoporosi in futuro.

In sintesi, il nostro protocollo per induzione degli osteoclasti con successo ha provocato un gran numero di osteoclasti giganti in vitro e i nostri dati suggeriscono che mTORC1 è fondamentale per la formazione degli osteoclasti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tutti gli autori dichiarano che non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. Minghan Tong e S. Kato per topi e gentilmente fornendo reagenti. Ringraziamo i membri del laboratorio Zou per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni da 973 programma dal Ministero cinese della scienza e tecnologia (MOST) [2014CB964704 e 2015CB964503], programma di ricerca clinica dell'ospedale di 9 persone, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Grazie per l'aiuto della funzione di memoria per biologia cellulare e funzione di memoria per biologia chimica, CAS Center for Excellence in molecolare di Cell Science, Shanghai Institute di biochimica e biologia cellulare, Accademia cinese delle scienze.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter