Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Andrew Ruba; Wangxi Luo; Weidong Yang

doi:10.3791/56475

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Biology

Aplicação da microscopia de velocidade de alta velocidade super-resolução no cílio primário ao vivo

Published: January 16, 2018

doi:

10.3791/56475

Andrew Ruba, Wangxi Luo, Weidong Yang

¹Department of Biology,Temple University

Summary

Recentemente nós mapeamos locais espaciais tridimensionais (3D) de rotas de transporte para várias proteínas se dentro cílios primários em células vivas. Aqui este detalhes de papel a instalação experimental, o processo de amostras biológicas e as análises de dados para a fluorescência de super-resolução 3D imagem abordagem recém aplicadas em viver cílios primários.

Abstract

O cílio primário é uma protrusão do microtubule-baseado na superfície de muitas células eucarióticas e contém um único complemento de proteínas que funcionam criticamente em motilidade celular e sinalização. Desde que cílios são incapazes de sintetizar suas próprias proteínas, cerca de 200 proteínas ciliares originais precisam ser traficadas entre o citosol e cílios primários. No entanto, ainda é um desafio técnico para mapear tridimensional (3D) locais, das vias de transporte para estas proteínas em cílios primários ao vivo devido às limitações do atualmente existente técnicas. Para conquistar o desafio, recentemente desenvolvemos e empregou uma microscopia 3D de alta velocidade virtual Super-resolução, denominada microscopia difração sub (velocidade) de single-point da borda-excitação, para determinar a localização espacial 3D das vias de transporte para ambos citosólico e proteínas de membrana em cílios primários de células vivas. Neste artigo, vamos demonstrar a configuração detalhada da microscopia de velocidade, a preparação de celulas que expressam proteínas ciliares fluorescência-proteína-labeled, o acompanhamento em tempo real do único-molécula de proteínas individuais no cílio ao vivo e a realização de densidade de probabilidade espacial 3D mapas de rotas de transporte para proteínas ciliares.

Introduction

Como afirmado por Ernst Abbe em 1873, a resolução da microscopia de luz convencional foi crida para ser limitada a aproximadamente 200 nm devido à difração de luz do objectivo¹^,². Atualmente, as técnicas de microscopia de luz de super-resolução quebrar essa limitação e permitam a captura de imagens dinâmicas, com resolução de difração sub (< 200 nm). As técnicas geralmente caem em duas categorias amplas: estimulada abordagens de microscopia com base de depleção (STED) emissão, que geram o volume de iluminação sub difração devido à resposta óptica não-linear de fluorophores em amostras³; e (palma), microscopia de luz fotoativo e microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade)-com base em técnicas de super-resolução, que utilizam funções matemáticas para localizar os centroides de fluorophores e então reconstituir essas centroides para formar imagens de super-resolução⁴^,⁵. Atualmente, devido a configuração óptica relativamente uncomplicated, PALM e tempestade são extensivamente empregados ativando apenas um pequeno subconjunto de fluorophores em cada quadro de um vídeo longo de uma preparação biológica. Isto permite a localização mais exata por 2D montagem Gaussian da mancha fluorescente, denominado a função de ponto de espalhar (PSF), das proteínas fluorescente-etiquetadas em cada quadro do vídeo. A localização 2D de cada molécula fluorescente-etiquetadas então pode ser sobreposta a um único avião de imagens para produzir uma imagem de super-resolução da preparação biológica¹^,². Enquanto estes localização único-molécula, abordagens de super-resolução para microscopia certamente revolucionaram como imagem latente de amostras biológicas foi executada, ainda existem desafios a serem vencidos. Por exemplo, tempestade e PALM podem alcançar seus melhores resoluções espaciais após a fixação de amostras biológicas e, portanto, apresentar uma representação estática das proteínas fluorescente-etiquetadas, que é uma limitação similar de microscopia eletrônica. Além disso, para atingir a alta resolução espacial para cada proteína fluorescente-etiquetadas em células vivas, amostras devem ser fotografadas no framerates há muito tempo que são incapazes de capturar a dinâmica da proteína. Portanto, é necessário superar estes obstáculos técnicos principais.

Para obter uma alta resolução spatiotemporal que é adequada para a detecção de proteínas ou RNAs de movimento rápido em células vivas, nós desenvolvemos microscopia de super-resolução velocidade em nosso laboratório (Figura 1)⁶^,⁷^, ⁸. vários grandes avanços técnicos na microscopia de velocidade anteriormente permitiram-nos controlar com sucesso nucleocytoplasmic transporte de pequenas moléculas, proteínas, mRNA e vírus através de nativo nuclear pore complexos (NPCs)⁶^, ⁷ ^, ⁸. resumidamente, os seguintes recursos da microscopia de velocidade serão usados para rastrear velozes macromoléculas através das estruturas simétrica e rotacionalmente sub-micrônicas em células vivas, tais como NPCs e cílios primários: (1) um inclinado ou uma iluminação vertical PSF permite a excitação de moléculas simples dentro de um volume pequeno de difração-limite no plano focal (Figura 1); (2), o PSF inclinado pode evitar muito fora de foco da fluorescência e, assim, melhorar a relação sinal-ruído. (3), a densidade óptica de 100-500 kW / cm² no PSF iluminação permite que milhares de fótons para ser coletado de único fluorophores com velocidades de deteção rápida (> 500 Hz). Velocidade de deteção (4), o jejum também reduz o erro de localização espacial único-molécula (< 10 nm) ao determinar as trajetórias espaciais de mover moléculas fluorescentes em células vivas, porque a difusão molecular é um dos principais fatores fazendo com que as imperfeições da único-molécula de localização para a movimentação de moléculas. Algoritmos de transformação (5) bem estabelecidas 2D para 3D permitem-nos fornecer a densidade de probabilidade espacial 3D mapas de rotas de transporte para moléculas no NPC ou o cílio primário. Vale ressaltar que nosso processo de conversão entre o cartesiano e o sistema de coordenação cilíndrico é usado para gerar uma densidade de probabilidade espacial 3D mapa ao invés de 3D único-molécula rastreamento (Figura 2). Anteriormente, os dados de microscopia eletrônica revelaram que o NPC⁹^,¹⁰ e o cílio primário¹¹ ambos têm uma estrutura simétrica e rotacionalmente. Em princípio, aleatoriamente, difundir moléculas movendo-se através do NPC ou cílio primário também deve ter distribuições simétricas e rotacionalmente. Como mostrado na Figura 2, um número elevado de difusão aleatoriamente as moléculas no interior do cilindro geraria distribuições simétricas e rotacionalmente com a vista de seção transversal como que em NPC, ainda mais, resultando em um aproximadamente uniforme espacial distribuição dentro de cada sub-região muito pequena entre dois anéis vizinhos(Figura 2). Esta distribuição uniforme leva a que a distribuição espacial ao longo da dimensão θ no sistema cilíndrico é constante. Então as coordenadas 3D (X, R, θ) podem ser simplificadas para ser as coordenadas 2D (R, X, constante). Na verdade, nosso processo de conversão entre os cartesianos e os sistemas cilíndricos é de 2D (X, Y) a 2D (R, X, constante). A constante θ, refere-se a densidade espacial p na Figura 2,E, é calculada utilizando a equação A.

Em última análise, rastreamento único-molécula tem ampla aplicação em pesquisa biológica, portanto, é natural que uma infinidade de técnicas será desenvolvida para preencher nichos biológicos específicos¹²^,¹³^,¹⁴. Tal é o caso com microscopia de velocidade. Anteriormente, quando combinada com um algoritmo de transformação 3D, esta técnica foi desenvolvida para resolver as rotas de transporte 3D de trânsito moléculas através os NPCs, uma estrutura biológica rotacionalmente simétrica e diffraction subtamanho⁶. Neste trabalho, cílios primários são mostrados para ser organelas excelente modelo também. Cílios primários são organelas cilíndricas, como antena (raio de ~ 125 nm) que o projeto da superfície dos mamíferos mais células¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. Eles são responsáveis por receber os sinais externos e transmitir uma resposta intracelular, geralmente associada com crescimento e metabolismo de¹⁵^,¹⁶. Portanto, fluxo de proteínas estruturais, reciclagem de receptores transmembranares e transmissão dos mensageiros intracelulares são responsabilidades vitais dos cílios primários. Na junção entre os cílios primários e o corpo da célula é uma barreira de seletividade crítica, chamada de zona de transição ou TZ, através do qual todo o transporte desta proteína deve ocorrer¹¹^,¹⁸^,¹⁹^, ²⁰. Além da função associada do TZ, pelo menos, dois processos de transporte, do transporte e difusão passiva, são pensados para ser responsável pelo movimento da proteína através desta região¹⁶^,²¹^, ²². do ponto de vista da saúde humana, a perda de cílios primários e desregulamentação subsequente de sinalização a jusante são característica de muitos cancros. Além disso, muitas doenças genéticas, como síndrome de Bardet-Biedl e doença renal policística, estão associadas a proteína defeituosa transporte²³. Tanto o tamanho do limite de difração sub e o complexo processo de transporte seletivo de proteína através do TZ fazem os cílios primários um alvo principal para esta técnica. Neste trabalho de métodos, demonstraremos o rastreamento de uma proteína transmembrana ciliar, receptor de somatostatina 3 (SSTR3)²⁴, rotulado externamente com Alexa Fluor 647 e um componente do IFT, IFT20²⁵, rotulado com uma molécula GFP fundida.

Protocol

1. preparação da pilha NIH-3T3 para microscopia de velocidade do estoque 1,5 semanas antes do experimento, recuperar uma cultura fresca de células NIH-3T3 de um estoque congelado descongelar a 37 ° C e transferindo as células para um balão de cultura de células de2 25 cm com 3 mL de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 110 mg/mL piruvato de sódio, glutamina 2 mM, 10% de soro fetal bovino e 1% penicilina/estreptomicina. Incube a 37 ° C numa incubadora 5% CO<s…

Representative Results

Esta seção demonstra os dados obtidos da realização de microscopia de velocidade para o TZ de cílios primários para estudar a rota de transporte de SSTR3 ligado por um vinculador externo de nm ~ 15 de Alexa647(Figura 3). Serve o duplo objectivo de verificar o algoritmo de transformação 3D. Alexa647 deve apenas rótulo a superfície externa do cílio primário e, portanto, a rota de transporte 3D deve revelar uma rota de transporte de …

Discussion

Este protocolo descreve a aplicação da microscopia de velocidade para o cílio primário, uma organela celular de sinalização que é altamente dependente do transporte eficiente de proteínas. Microscopia de velocidade pode fornecer alta resolução locais (< 10 nm) para moléculas fluorescente-etiquetadas como passam através da iluminação de ponto único centralizada sobre o TZ. Anteriormente tiver sido aplicado para estudar a proteína tráfico através do NPC⁶^,<sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. Kristen Verhey (Universidade de Michigan, Ann Arbor) e Dr. Gregory Pazour (Universidade de Massachusetts Medical School) para fornecer alguns plasmídeos. O projeto foi apoiado por concessões do National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 e GM122552 para W.Y.).

Materials

25 cm² tissue culture dish	Corning	VV-01936-00
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher	15140122
Fetal bovine serum	ThermoFisher	10438018
DMEM	ThermoFisher	10566-016
OPTIMEM	ThermoFisher	31985062
Trypsin	ThermoFisher	25300054
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-1PAK
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
35 mm glass bottom dish	MatTek	P35GCOL-0-14-C
AlexaFluor 647-conjugated streptavidin	ThermoFisher	S21374
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
633 nm He-Ne laser	Melles Griot	25-LHP-928-249
561 nm solid state laser	Coherent	OBIS 561-50 LS
488 nm solid state laser	Coherent	1185053
Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective	Olympus	UPLSAPO 100×
On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera	Roper Scientific	Cascade 128+
Dichroic filter	Semrock	Di01- R405/488/561/635-25×36
Emission filter	Semrock	NF01-405/488/561/635-25X5.0
Slidebook 6.0	Intelligent Imaging Innovations		digital microscopy software

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Ruba, A., Luo, W., Yang, W. Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium. J. Vis. Exp. (131), e56475, doi:10.3791/56475 (2018).