Summary
최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.
Abstract
기본 cilium 많은 진 핵 세포의 표면에는 microtubule 기반 돌출 이며 포함 단백질의 독특한 보완 기능을 비판적으로 세포 운동 성 및 신호 합니다. 속눈썹 자신의 단백질을 합성 할 수 있다, 이후 약 200 독특한 속눈썹 단백질 cytosol와 기본 속눈썹 사이 매매 될 필요가 있다. 그러나, 그것은 여전히 전송 경로 라이브 기본 속눈썹 현재 존재의 제한 때문에이 단백질의 3 차원 (3D) 위치를 지도에 대 한 기술 도전 기법. 도전을 정복, 최근 우리가 발전 하 고 고속 가상 3D 슈퍼 해상도 현미경 검사 법, 단일 포인트에 지-여기 하위 회절 (속도) 현미경 검사 법의 전송 경로 대 한 3 차원 공간 위치를 결정 하 되 나를 고용 둘 다 cytosolic와 라이브 셀의 기본 속눈썹에 막 단백질. 이 문서에서는, 우리 속도 현미경 검사 법, 형광 단백질 분류 속눈썹 단백질, 라이브 cilium 개별 단백질의 실시간 단일 분자 추적 및 공적을 표현 하는 세포의 준비의 자세한 설치를 선보일 예정 이다 3D 공간 확률의 밀도 속눈썹 단백질에 대 한 전송 노선 지도.
Introduction
1873 년에 Ernst Abbe를 정한 이후 기존의 가벼운 현미경의 해상도 때문에 객관적인1,2에서 빛 회절 제한 약 200 nm 될 믿고 되었습니다 있다. 현재, 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법 기술을 휴식이 제한 하 고 하위 회절 (< 200 nm) 해상도와 동적 이미지 캡처를 허용. 기술은 일반적으로 두 개의 광범위 한 범주로을: 자극 방출 소모 (호텔 위치) 현미경 기반으로 접근, 샘플3; fluorophores의 비선형 광학 반응으로 인해 하위 회절 조명 볼륨을 생성 하는 photoactivated 가벼운 현미경 검사 법 (팜) 그리고 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)-지역화 fluorophores의 중심을 다음 reconstitute 이러한 중심 수학 함수를 활용 하는 슈퍼 해상도 기법을 기반으로 양식 슈퍼 해상도 이미지4,5. 현재, 상대적으로 단순한 광학 설치 인해 손바닥과 폭풍 광범위 하 게 채택 된다만 생물학 준비의 긴 비디오의 각 프레임에 fluorophores의 작은 하위 집합을 활성화 하 여. 이로써 더 정확 하 게 지역화, 형광의 2D 가우스 피팅 하 여 불리 포인트 확산 기능 (PSF), 비디오의 각 프레임에 놓여있는지 표시 된 단백질의. 다음 생물 준비1,2의 슈퍼 해상도 이미지를 단일 이미지 비행기 각 붙일 표시 된 분자의 2D 위치 위에 수 있습니다. 이러한 단일 분자 지역화 슈퍼 해상도 현미경에 접근을 확실히 생물 샘플의 영상 이었다 수행 하는 방법을 혁명, 아직도 도전을 극복할 수 있다. 예를 들어 폭풍 팜 수 생물 샘플의 고정 후 그들의 최고의 공간 해상도 달성 고 따라서 현재의 붙일 표시 된 단백질의 정적 표현 전자 현미경의 비슷한 제한입니다. 또한, 라이브 셀에 각 붙일 표시 된 단백질에 대 한 높은 공간적 해상도 달성 하기 위해 샘플 해야 될 몇 군데 단백질 역동성을 캡처 수 있는 매우 긴 프레임에. 따라서, 그것은 이러한 주요 기술 장애물을 극복 하기 위해 필요입니다.
라이브 셀에 빠르게 움직이는 단백질 또는 RNAs를 감지 하는 데 적합된 한 높은 spatiotemporal 해상도 얻으려면, 우리가 개발한 슈퍼 해상도 속도 현미경 우리의 실험실 (그림 1)6,7, 8. 속도 현미경에서 몇 가지 주요 기술 발전 이전 성공적으로 작은 분자의 nucleocytoplasmic 전송 추적을 설정한, 단백질 mRNA, 바이러스 핵 아메리카를 통해 기 공 단지 (Npc)6, 7 , 8. 짧게, 속도 현미경의 다음 기능 것입니다 사용을 추적할 수 라이브 셀, Npc 등 기본 속눈썹에에서 서브 마이크로미터 회전 대칭 구조를 통해 빠른 속도로 움직이는 고분자: (1) 한 경사 또는 수직 조명 PSF 수 있습니다 (그림 1); 초점면에서 작은 회절 제한 볼륨 내에서 단일 분자의 여기를 (2) 경사 PSF 크게 밖의 초점 형광을 방지 하 고 따라서 신호 대 잡음 비율을 향상 시킬 수 있습니다. (3) 100-500 kW의 광학 밀도 / cm2 조명 PSF에서에서 빠른 검색 속도 (> 500 Hz)와 단일 fluorophores에서 수집 하는 광자의 수천 수 있습니다. (4) 빠른 탐지 속도 또한 크게 감소 단일 분자 공간 지역화 오류 (< 10 nm) 분자 확산 주요 요인 중 하나입니다 있기 때문에 살아있는 세포에서 형광 성 분자를 이동의 공간 궤도 결정 분자를 이동 하는 것에 대 한 단일 분자 지역화의 결점을 일으키는. (5) 음 2D 3d 변환 알고리즘 NPC 또는 기본 cilium 분자에 대 한 3D 공간 확률 밀도 지도 전송 경로 제공을 통해 있습니다. 그것은 우리의 변환 프로세스는 직교 및 원통형 조정 시스템 간의 3D 공간 확률 밀도 보다는 3D 지도 단일 분자 추적 (그림 2)를 생성 하는 데 사용은 주목 된다. 이전, 전자 현미경 검사 법 데이터 NPC9,10 및 기본 cilium11 둘 다 회전 대칭 구조를가지고 계시 했다. 원칙적으로, 임의로 NPC 또는 기본 cilium 통해 이동 하는 분자 확산 회전 대칭 배포판 또한 있어야 한다. 무작위로 실린더 내부 분자 확산의 높은 숫자 더 결과 대략 균일 한 NPC에 그만큼 횡단면 보기에서 회전 대칭 배포판 생성 그림 2에서 같이, 공간 두 개의 이웃 링 (그림 2E) 사이 각 매우 작은 하위 영역 내에서 배포. 이 균일 한 분포 지도 원통형 시스템에서 θ 차원 공간 분포는 일정. 다음 3 차원 좌표 (R, X, θ) 2D 좌표 (R, X, 상수) 수를 단순 수 있습니다. 사실, 우리의 변환 프로세스는 직교 및 원통형 시스템 간의 2D (R, X, 상수)를 2 차원 (X, Y)에서입니다. 상수 θ, 방정식 A를 사용 하 여 계산 됩니다 그림 2E에서 공간적 밀도 p 말합니다
.
궁극적으로, 단일 분자 추적 생물학 연구에서 광범위 한 응용 프로그램은, 따라서, 그것은 자연 기술의 과다 특정 생물 학적 틈새12,13,14을 채우기 위해 개발 될 것 이다. 이러한 속도 현미경의 경우 이다입니다. 이전에 3D 변환 알고리즘으로 사용할 경우,이 기술은 환승 NPCs, 하위 diffraction 크기와 회전 대칭 생물학 구조6통해 분자의 3D 전송 경로 해결 하기 위해 개발 되었다. 이 논문에서는, 기본 속눈썹 우수한 모델 세포도 표시 됩니다. 기본 속눈썹은 대부분 포유류 세포15,16,17의 표면에서 프로젝트는 원통형, 안테나 모양의 세포 (~ 125 nm radius). 그들은 외부 신호를 수신 하 고 성장 및 대사15,16와 일반적으로 관련 된 세포내 응답 전송에 대 한 책임이 있습니다. 따라서, 구조 단백질의 플럭스, 막 횡단 수용 체와 세포내 메신저의 전송의 재활용 기본 속눈썹의 중요 한 책임입니다. 셀 몸과 기본 속눈썹 사이 접합에는 전환 영역 또는 TZ,이 통해이 모든 단백질 전송 발생11,,1819, 중요 한 선택도 장벽 20. TZ의 제어 기능 이외에 두 개 이상의 전송 프로세스, intraflagellar 전송 및 수동 확산이 지역16,21, 를 통해 단백질의 움직임에 대 한 책임 것으로 생각 22. 인간의 건강 관점에서 기본 속눈썹의 손실 및 다운스트림 신호의 후속 규제 많은 암의 특징입니다. 또한, Bardet-Biedl 증후군, polycystic 신장 질환 등 많은 유전 질환, 불완전 단백질 전송23와 연결 됩니다. 하위 회절 제한 크기와는 TZ 통해 선택적 단백질 수송의 복잡 한 과정 기본 속눈썹이이 기술에 대 한 주요 대상으로 확인합니다. 이 방법은 종이에 속눈썹 막 횡단 단백질, somatostatin 수용 체 3 (SSTR3)의 추적을 시연할 예정 이다 우리24, 알 렉 사 Fluor 647 IFT, IFT2025, 융합된 GFP 분자와 표시의 구성 요소와 외부 표시.
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Protocol
1. 재고에서 속도입니다 NIH-3T3 세포 준비
- 실험에 앞서 1.5 주 37 ° C에 녹고 고 3 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 110 mg/mL와 함께 보완으로 25 cm2 셀 문화 플라스 크에 세포를 전송 하 여 냉동된 재고에서 NIH-3T3 세포의 신선한 문화를 복구 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 및 1% 페니실린/스.
- 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 분할 매 2 일에 대 한 80 %confluency 세포의 세포 주기를 위해 실험 하루 전에 적어도 세 번. 37 ° C에서 2 분 동안 0.25 %trypsin 셀 trypsinize, 트립 신을 발음 하 고 매체의 2 mL와 함께 그것을 대체. 피펫은 반복 셀 클러스터 헤어, 원하는 셀 수를 제거 하 고 미디어의 전체 볼륨을가지고 매체 3 mL를 다시.
참고: NIH-3T3 NPHP-4, localizes는 TZ26, mCherry에는 C에 융합 단백질을 표현 하기 위해 유전자 설계 이전 했다. mCherry 이다 fluorophore 561 nm 조명을 양적 TZ 선택도 배리어를 지역화 하 고 기본 속눈썹 방향으로 흥분 될 수 있는. - 2 일 전에 실험, 접시 35 m m 유리 하단으로 셀 단계 1.1 같은 매체의 1.5 mL와 60-70 %confluency 접시 고 인큐베이터에 셀을 반환 합니다.
- 하루는 실험 전에 화학적으로 원하는 플라스 미드와 셀 transfect. 500-1000 원하는 플라스 미드의 ng (아래 참고 참조) transfection 시 약 30 분에서 35 Aspirate 미디어에 대 한 항생제 없이 감소 된 혈 청 미디어의 0.25 ml에서 1:2.5 비율에 m m 유리 하단 접시를 혼합 하 고 0.25 mL 플라스 미드 / transfection 시 믹스 플러스 항생제 없이 감소 된 혈 청 미디어의 여분의 1.25 mL. 감소 된 혈 청 미디어 성공적인 transfection를 촉진, 기본 속눈썹 성장 유도를 살려 셀 충분히 실험을 수행 하는 목적을 제공. 다음 날에 실험에 대 한 보육을 셀을 반환 합니다.
참고: IFT20의 단일 분자 추적을 수행할 때 사용된25는 유전자 변형 IFT20 GFP에의 C에 융합을 포함 하는 플라스 미드. 단일 분자를 수행할 때 SSTR3의 추적 수락자 펩 티 드 (AP) 도메인에는 N에 융합 하는 유전자 변형 SSTR3를 포함 하는 플라스 미드 이며 C terminus GFP 사용된22. SSTR3 구문 이외 biotin 리가 BirA를 포함 하는 플라스 미드를 공동 표현 해야 합니다 및 transfection 미디어 10 µ M biotin으로 보충 해야 합니다. BirA biotin 응급실의 수준에서 새로 합성된 AP-SSTR3-GFP 분자의 AP 도메인에 다음 연결합니다. Alexa647 3 streptavidin에 있는 4 개의 biotin 바인딩 사이트 활용 된 평균 수 있습니다 다음 보완 될 AP-SSTR3-GFP 분자는 셀22,27의 외부 표면에 붙일 라벨을 이미징 이전 미디어 . GFP와 AlexaFluor647;이 방법에 사용 됩니다. 그러나, 만약 그들이 마찬가지로 높은 사진-안정성과 양자 항복 다른 형광 프로브를 사용할 수 있습니다. - 외부에서 표시 된 SSTR3 구문, 유리 바닥에서 미디어 실험 하기 전에 1 시간을 요리, 세척 5 회 인산 버퍼 (PBS), 염 분의 1 mL와 함께 셀 및 감소 된 혈 청 미디어의 1 mL 1 µ M와 보충 추가 제거를 사용 하는 경우 Alexa647 활용 streptavidin입니다.
- 실험을 하기 전에 더 이상 15 분 유리 하단 접시에서 미디어를 제거 하 고 5 번 1 mL의 PBS로 레이블이 transfected 세포를 씻어.
- 이미지 버퍼 (20 mM HEPES, 110mm KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1mm EGTA, pH 7.3)의 1 mL 유리 하단 접시에 놓습니다.
참고: 이미지 버퍼에 셀은 3 h 보다 더 이상에 대 한 가능한. 따라서, 각 요리에만 2 시간 실험의 수행 됩니다.
2. 속도 현미경 검사 법
참고: 속도 현미경 설치 포함 1.4 나 100 × 기름 침수 apochromatic 목표, 35 mW 633 nm 그-Ne 레이저, 50 mW 고체 488 nm 및 561-nm 레이저, 온-칩 곱셈 이득 거꾸로 형광 현미경 충전 결합 장치 카메라와 데이터 수집 및 처리 (그림 1)에 대 한 현미경 소프트웨어 패키지. 개별 채널 이미징, GFP, mCherry, 및 Alexa647 흥분 488 nm, 561, 또는 633 nm 레이저, 각각. 단일 분자 추적에 대 한 단일 지점 조명 개별 붙일 표시 된 분자를 추적 하는 데 사용 됩니다. Epifluorescence 이미징, 오목 렌즈는 빔 조명 유니폼 분야에 확장 레이저 조명 경로에 배치 됩니다. 형광 방출 동일한 목적에 의해 수집 된, (405/488/561/635) dichroic 필터와 배기 필터 (405/488/561/635), 필터링 및 단일 분자 추적에 대 한 500 Hz 또는 대 한 2 Hz에서 위의 CCD 카메라와 함께 몇 군데 epifluorescence 이미지입니다.
- 현미경의 단계로 유리 하단 플레이트를 부착 하 고 원하는 구문을 제대로 표현 하는 셀을 찾습니다. 일단 적당 한 셀을 발견 했습니다, 레이저의 단일 지점 조명에 해당 하는 영상 평면에 위치와 함께 기본 속눈썹의 기지에서 NPHP4 mCherry 자리를 맞춥니다.
- Epifluorescence NPHP4-mCherry IFT20-GFP 및 AP-SSTR3-GFP 디지털 현미경 소프트웨어 패키지를 사용 하는 경우 "포커스 컨트롤" 창의 "카메라" 탭에서 "스냅" 기능을 사용 하 여 이미지를 캡처합니다 ( 재료의 표참조).
참고:이 이미지는 이후 단일 분자 위치에 대 한 참조로 작동할 것 이다. - 참조 이미지는 얻은 로컬 레이블이 단일 분자의 농도 줄일 수 있습니다. 사진-블리치 20에 대 한 1 mW 레이저 조명 TZ s 또는 형광 강도 배경 형광의 가까이까지.
참고: 때 정확한 농도 통제 될 수 있다, 0.1-1 nM 단일 분자를 레이블이 사용 됩니다. - 단일 분자 추적에 대 한 준비, 레이저 조명 전력 ~0.15 mW GFP와 함께 표시 하는 단일 분자 또는 분자 Alexa647 표시에 대 한 ~0.5 mW를 줄일 수 있습니다.
- 최대한 빨리 레이저 파워 및 이미징 매개 변수 설정, 최대 이득 및 강화 및 2 ms 프레임 속도, 단일 분자 이미징, 적절 한 조명 레이저 고 비-photobleached, 그들은 이송으로 단일 분자를 표시 기록 통해 "포커스 컨트롤" 창의 "카메라" 탭에서 "스트림" 버튼을 클릭 하 여 TZ의 photobleached 지역.
참고: 비디오의 2 분 더 이상 무시할 수준으로 속눈썹 드리프트의 효과 최소화 하기 위해 캡처할 수 해야 합니다. - 단일 분자 비디오를 캡처 후 정확 하 게 중심의 관심 (아오이)의 각 단일 분자의 여기 PSF 포괄 영역에서 localizes Gelles 랩, 망원경 등의 2D 가우스 피팅 알고리즘을 사용 하 여 비디오를 처리 합니다.
- 모든 단일 분자 위치 정밀도를 선택 < 10 nm 단일 분자 위치 2D 가우스 기능 장착의 분포에 따라 속눈썹의 센터 수정.
참고: 사용 하 여 2D 3D 변환 알고리즘, IFT20-GFP와 AP SSTR3 노선의 3D 전송 노선 명확 하 게 표시 됩니다 속눈썹 또는 속눈썹 axonemal 막에 각각.
3입니다. 2D 3D 변환
- 일단 몇 천 지역화는 cilium에서 분자 (신호 소음 비율 > 11를) 환승에 대 한 수집, X 차원으로는 cilium의 긴 축을 선택 합니다. 위치 Y 차원 히스토그램을 확인 하 고 10 nm 단위로 빈 합계를 얻을.
참고: 2D 3D 변환 손 또는 어떤 소프트웨어 또는 프로그래밍 언어에 의해 평가 될 수 있습니다. 저자는 성공적으로 Matlab에 파이썬 2.7 변환을 구현 했습니다.
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Representative Results
이 섹션에서는 기본 속눈썹의 TZ SSTR3 Alexa647 하 ~ 15 nm 외부 링커로 연결의 전송 경로 연구에 속도 현미경 수행에서 얻은 데이터를 보여 줍니다 (그림 3A). 그것은 3D 변환 알고리즘을 확인 하는 이중 목적을 제공 합니다. Alexa647은 레이블 기본 cilium 따라서, 3D 수송 루트의 외부 표면 그 위치에서 고밀도 전송 경로 공개 해야만 한다. NIH-3T3 안정적으로 표현 하는 NPHP3-mCherry는 TZ에는 AP-SSTR3-GFP와 페 고 incubated streptavidin 활용 된 Alexa647와 위의 프로토콜에 따라 해야 합니다. MCherry 라벨의 넓은 필드 이미징은 GFP 셀 원하는 SSTR3 구문 표현 했다 보장 하기 위해 사용 하는 동안에 TZ를 지역화 하는 데 사용 됩니다. 또한 633 nm 광원을 사용 하 여 Alexa647 라벨의 넓은 필드 이미징 셀 제대로 BirA 플라스 미드를 표현 했다 및 미디어에서 충분 한 비오 틴 흡수가 필요 하다. 긍정적인 확인 표시 cilium 배경 형광 (그림 3B)에서 뚜렷한 특징 이다. AP-SSTR3-GFP 구조 streptavidin 활용 된 Alexa647와의 효율적인 라벨만 이러한 조건에서 발생할 수 있습니다. 일단 Alexa647에 의해 기본 cilium의 선택적 라벨의 긍정적인 확인을 얻은 photobleaching 및 단일 지점 조명 633 nm 레이저 TZ의 단일 분자 수를 허용할 것 이다. 데이터 분석 하기 전에 유용한 유효성 검사 단계 (그림 3C)는 넓은 필드 조명에 단일 분자 비디오를도 랑. 예를 들어 레이저 제대로 정렬 되지 아니 단일 분자는 TZ와 공동 지역화를 표시 됩니다. 단일 분자 영상 (그림 3E)의 길이 TZ에 강도 확인 하는 충분 한 신호 대 잡음 비율을 보장 하기 위해 또 다른 사전 데이터 분석 유효성 검사 단계가입니다. 이러한 분석에 ImageJ '플롯 z 축 프로 파일' 기능을 사용 하 여 신속 하 게 수행할 수 있습니다. 그림 3F 에 봉우리는 신호-잡음 ~ 5.0으로 TZ에 단일 분자의 모양에 해당합니다. 이 그래프는 또한 단일 분자의 잘 분리 된 주파수에 의해 입증으로 충분 한 photobleaching 발생 했습니다 보장 수 있습니다. 그림 3 G < 0.5의 낮은 신호 대 잡음 비율을 보여 줍니다. 1 개의 설명은 레이저는 TZ에 직접 정렬 되지 것입니다. 또 다른 이유는 레이저 조명 전원 너무 낮습니다 있을 수 있습니다. 두 설명 낮은 구동 되며, 따라서, 낮은 TZ에 fluorophores의 방출. 이 검사 한 후 단일 분자의 2D 가우스 피팅 TZ (그림 3H)에 그들의 궤도 생산할 예정 이다. 많은 궤도 랑 (그림 3나) TZ의 레이블이 지정 된 단백질의 수송 루트를 생산할 예정 이다. 더 관심의 지역화 (그림 3J의 단백질을 설명 하기 위해 TZ 기본 속눈썹의 넓은 필드 이미지와 y 단일 분자 데이터를 병합 수 있습니다 때문에 검출기, x, 픽셀 값에 해당 하는 2D 가우스 피팅 ).
IFT20 기본 속눈썹25내부 microtubules 따라 화물 운반 IFT, 복잡 한 구성 요소입니다. Arl13b-mCherry, 널리 속눈썹 마커 단백질을 기본 속눈썹19사용 되었다. 넓은 필드에 피 형광 현미경 이미지 기본 cilium Arl13b mCherry와 IFT20-GFP를 표현 하는 데 사용 되었고 기본 속눈썹에 개별 IFT20 GFP 단백질 GFP의 사전 photobleaching 후 추적 속도 현미경으로 전환 단일 분자 수준의 속도 현미경 검사 법 (그림 4A-4 C)의 조명 영역에서의 형광
결국, < 16 nm의 체계적인 지역화 정밀도 가진 단일 분자 IFT20 GFP 위치 수백 라이브 셀 (그림 4D)의 기본 cilium에서 얻어질 수 있다. 우리의 시뮬레이션에 따르면 250 95의 반경 가진 분자 위치 단일 nm (그림 5) 신뢰할 수 있는 3D 전송 경로 생성 하기에 충분 했습니다. IFT20-GFP 수송 루트의 최종 결정은 10 속눈썹 (그림 4E)에서 수집 된 단일 분자 IFT20 GFP 위치의 수천을 기반으로 합니다. 이후 기본 속눈썹 회전 대칭 구조를가지고, 2D 3D 변환 알고리즘을 2D 투영된 데이터에 적용 되었습니다. 흥미롭게도, IFT20의 3D 공간 확률 밀도 지도 ~ 60 nm 폭만 단일 고밀도 지역 ~ 95에 만족 표시 기본 속눈썹 (그림 4E)의 반경에 따라 nm. 이 고밀도 지역 가능성이 axonemal microtubules IFT 경로 (그림 4F)의 알려진된 위치와 함께 공동 localizes.
그림 1 . 속도 현미경의 단순화 된 회로도. (경로 1) 수직 또는 경사 (경로 2) 점 확산 함수 초점면에서 단일 fluorophore 분자를 조명 하는 데 사용 됩니다. "d" 목표의 센터를 통과 하는 수직 조명 레이저 빔 조명 레이저는 목표의 가장자리에 초점을 맞춤 으로써 달성 각도 조명 사이의 거리를 말합니다. 두 개 이상의 레이저 여기 온-오프 모드를 광학 헬기에 의해 규제는 NPC 또는 기본 cilium 환승 단일 분자를 추적 하는 데 사용 됩니다. 오프 시간은 대상된 분자에 fluorophore 라벨의 photobleaching 시간 보다 적어도 10 배 이상 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 2D의 3D 변환 프로세스에 그래픽 데모. 그들은 중앙 루멘 (A-F) 또는 튜브의 주변 지역 (G-L) 내에서 확산 하는 경우 설계도 등 2D 분자, 3D 변환 알고리즘을 보여 줍니다. (무작위로 확산 튜브 내부 분자의 A) 이상적인 3D 공간 위치 원통형 조정 시스템 (R, X, θ)에 조정 될 수 있습니다. 속도, 3D 밀도 지도 궁극적으로 2D 공간 위치에서 계산 됩니다. 그러나, 이것은 3D 조밀도 지도 해당 2D 또는 3D 공간 위치 알려진 여부를 설명 하는 이상적인된 경우. (B) 3 차원 분자 위치는 현미경 이미징 하 여 데카르트 조정 시스템 (X, Y, Z)에서 2D 평면에 투영. (C)는 매우 얇은 슬라이스 (δ x) 차원 x 따라 A에 실린더에서 잘라. (D) 3D 공간 위치 C 에서처럼 조각에 좁은 2D 영역 내에서 투사할 수 있습니다. (C.에 표시 된 얇은 조각에 모든 위치 E) 횡단면 보기 이러한 위치 동심원 사이의 하위 영역으로 그룹화 할 수 있습니다. 실린더에 컷된 매우 얇은 슬라이스, 위치 공간 밀도 높은 수 무작위로 분산된 분자를 감안할 때 (p나) 두 개의 인접 링 사이의 각 하위 영역 (Si)에서 회전 대칭 하 고 균일 한 있을 것입니다. 이러한 위치 Y 차원 1 D에 추가 투영 수 있습니다. Y 차원 위치는 히스토그램 j 열에 클러스터 된 하는 경우. 위치에 각 열 (에)의 총 수와 동등 하다 
는 측정 될 수 있다 실험적으로 (F)와 같이. (G-L) 위와 마찬가지로, 변환 프로세스는 분자는 튜브의 주변 지역 내 확산을 위해 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 3 차원 공간 위치 수송 루트의 SSTR3 속도 현미경에 라이브 기본 속눈썹에. (GFP 태그 SSTR3 NPHP4-mCherry에 의해 표시 TZ 통해의 추적에 적용 되는 속도 현미경의 A) 그래픽 표현입니다. (B) Epifluorescence NPHP4-mCherry (빨강), AP-SSTR3-GFP (녹색), Alexa647의 이미지를 외부에서 AP-SSTR3-GFP (흰색), 사용 하 고 최종 이미지를 병합. 눈금 막대: 2 µ m. (C)는 단일 알 렉 사 647 개 AP-SSTR3-GFP (화이트) 4 프레임 (2 ms/프레임)에 대 한 포인트 조명 필드를 통과 하는 추적. 눈금 막대: 2 µ m. (D) 단일 분자 궤도 (흰색) (c) NPHP4-mCherry (빨강) 및 AP-SSTR3-GFP (녹색)의 epifluorescence 이미지에. 눈금 막대: 2 µ m. (E) 화이트는 TZ에 단일 지점 조명 영역 중심 광장 하이라이트 점선. 눈금 막대: 2 µ m. (F) 광자 수 vs 프레임 번호 단일 분자 높은 신호 대 잡음 비 배경 형광 나눈 단일 분자의 최대 형광을 나눈와 비디오에 대 한 그래프. (G) 광자 수 vs 단일 분자 낮은 신호 대 잡음 비와 비디오에 대 한 숫자 그래프 프레임. ((E)에서 H) 궤도 (D) 2D 가우스 피팅 하 여 각 프레임에 지역화 및 또한 2D 가우스 피팅 하 여 지역화 된 TZ의 정확한 그래픽 표현에. 2D 가우스 피팅 과정 관심 (아오이) 단일 분자의 PSF.(I) 2D 슈퍼 해상도 220 개별의 공간 배급을 포괄 한 영역의 강도 프로필의 X와 Y 차원 가우스 함수에 맞는 알 렉 사 Fluor 647 분류 AP-SSTR3-GFP 위치 단일 기본 cilium에서 수집. (J) 슈퍼 해상도 단일 분자 위치 (I)에서 NPHP4-mCherry (빨강) 및 AP-SSTR3-GFP (녹색)의 epifluorescence 이미지에. 눈금 막대: 2 µ m. (K)는 2D 3D 변환 알고리즘에 의해, 알 렉 사 Fluor 647 개 AP-SSTR3-GFP R 차원 기본 속눈썹에의 공간 확률 밀도 분포를 얻어. 피팅, 알 렉 사 Fluor 647 개 AP-SSTR3-GFP 주로 24±1 nm의 절반 최대 (FWHM)에 전체 폭 131±3 nm의 반경에서 속눈썹 막에 있는 가우스 기능을 기반으로 합니다. (L) 단면 기본 속눈썹에 알 렉 사 Fluor 647 개 AP-SSTR3-GFP의 공간 확률 밀도 분포 (녹색 구름)의 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 라이브 기본 속눈썹 속도 현미경 검사 법에 의해 매핑된 내부 IFT20에 대 한 전송으로 3D 공간 위치. (A-C) Arl13b-mCherry (A)와 IFT20-GFP (B) 공동 NIH3T3 세포와는 병합 (C)에 표시의 대표 이미지. 원 (녹청) 기본 cilium에 속도 현미경의 단일 포인트 조명의 위치 셀 (흰색 점선) 그 가장자리 따라 셀 신체와 밝은 필드 조명 IFT20 GFP 형광 (안 측에 증가 나타냅니다. 표시). 눈금 막대: 10 µ m 」 (D) 2D 슈퍼 해상도 공간 배포 286 개별 IFT20 GFP 위치의 단일 기본 cilium에서 수집. (2D 3D 변환 알고리즘,에 의해 E) R 차원 기본 속눈썹 안쪽 IFT20 GFP의 공간 확률 밀도 분포는 얻어진 다. 가우스 함수 피팅을 바탕으로, IFT20-GFP 주로 찾습니다 95±1 nm의 반경에서 56±5 nm의 절반 최대 (FWHM)에 전체 폭. (H. 눈금 막대에 회로도와 중첩 기본 속눈썹에 IFT20 GFP의 공간 확률 밀도 분포 (녹색 구름)의 F) 횡단면 보기: 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 시뮬레이션 2D 3D 변환 알고리즘에 대 한 신뢰할 수 있는 3D 공간 확률 밀도 지도 생성 하기 위해 2D 단일 분자 위치의 최소 수를 예측 하는 데 사용 되었다. (A) 단일 분자 위치 계산을 통해 생성 된 가운데 95에 방사형 밀도 정규 분포에서 무작위로 샘플 100 nm (IFT20 우리의 실험에서 결정 된 기본 전송 경로에 해당). 16의 지역화 정밀 nm 샘플링 하 여 각 단일 분자의 위치에 대 한 시뮬레이션은 σ와 정규 분포에서 = 16 nm. 같이 그림 2C, 매우 얇은 조각 (δ x) x에 변환 알고리즘에 사용 되 고 따라서 x 2D 단일 분자 계산을 통해 생성 된 위치에 표시 되지 않습니다. (Y 차원 프로젝트 데이터와 3D R 차원 밀도 B) 변환 5 가지 시뮬레이션된 데이터 세트 (각 100 점)에 대 한 3D R 차원 밀도의 히스토그램을 생성 합니다. 위의 숫자는 오류를 피팅 피크 위치 ±. (C-D) 시뮬레이션 결과 250 단일 분자의 위치에 따라. (E-F) 시뮬레이션 결과 500 단일 분자의 위치에 따라. (G-나) 평균 100, 250 및 500 포인트 시뮬레이션에서 3D 밀도 히스토그램 각각. 오차 막대는 피크 위에 숫자는 평균 피크 위치 ± 표준 편차 히스토그램 빈 높이에 변화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 속도 현미경의 기본 cilium, 셀룰러 신호 세포 기관이 매우 효율적인 단백질 수송에 의존 하는 응용 프로그램을 설명 합니다. 속도 현미경 단일 지점 조명은 TZ에 중심을 통과 높은 해상도 (< 10 nm) 위치 붙일 표시 된 분자를 제공할 수 있습니다. 이전 그것은 전인대6,,78매매 단백질 연구에 적용 되었다. 그러나, 그것은 어떤 하위 회절 셀룰러 구멍을 통해 밀매 공부를 확장할 수 있습니다. 이 기술은 장점이 다른 고해상도 이미징 기술을 통해 공간 및 시간 해상도 라이브 셀 시스템에서 단일 단백질 수송의 역학을 캡처할 수 있는 < 10 nm 그리고 < 2 ms, 각각. 또 다른 장점은 이다 하나만 붙일 레이블 관심사의 단백질을 해야 합니다 transfection, 단백질 지 방화, 속도 현미경을 수행 하려면 공부 하는 일반적인 분자 생물학 접근 방식을 통해 구문 표현. 하나는 고 출력 레이저와 단일 지점 조명 잘 분리, 높은 해상도 단일 분자 위치를 제공 하는 기능에 유지 해야 합니다. 그러나,이 또한 조명 영역을 제한 하 고 기술을 넓은 분야 지역화에 적합 하지 않은 게. 다행히, 필요한 경우 선택할 수 사관에 대 한 많은 넓은 필드 슈퍼 해상도 기술이 있다. 고려해 야 할 또 다른 점은 속도 현미경만 이동 하는 단일 분자의 위치를 캡처합니다. 따라서, 모바일은 총 분자의 부분을 확인할 수 있습니다, FRAP 함께 분석에 유용한 추가 수 있습니다.
3 차원 단일 분자 추적을 기반으로 3D 뷰 보다는 가상 3 차원 확률 밀도 지도 생성 하는 직교 및 원통형 조정 시스템 간의 변환 프로세스가입니다. 세부 사항에, 전자 현미경 검사 법 데이터 기본 속눈썹 특정 반경에 따라 균일 한 분자 분포를 생성할 수 있는 회전 대칭 구조는 계시 했다. 이 균일 한 분포 지도 원통형 시스템에서 θ 차원 공간 분포는 일정. 다음 3 차원 좌표 (R, X, θ) 2D 좌표 (R, X, 상수) 수를 단순 수 있습니다. 사실, 우리의 변환 프로세스는 직교 및 원통형 시스템 간의 2D (R, X, 상수)를 2 차원 (X, Y)에서입니다. 상수 θ, 방정식 A를 사용 하 여 계산 공간 밀도 p말합니다
(그림 2). 매트릭스 계산기를 사용 하 여 벡터 계산 
, 횡단면 보기6,7이 s에에서 이웃 동심원 사이의 영역을 기준으로 총 상호 작용 사이트 위치 j에 해당 실험;에서 직접 측정 따라서, pi ri에서 상호 작용 사이트의 공간 확률 밀도 의행렬 방정식을 해결 하 여 산출 될 수 있다.
참조 이미지 수집 및 비디오 단일 분자 사이 현미경 설치의 어떤 섭 동을 최소화 하기 위해 프로토콜에 중요 한 단계가입니다. 어떤 운동 든 지 발생 하면, 단일 분자 위치는의 열 대권 외 기본 속눈썹 epifluorescence 이미징 통해 얻은 그 자신 있게 매핑할 수는. 또 다른 필수적인 단계는 photobleach 로컬 붙일 레이블이 단일 분자의 농도 줄이기 위해 충분 한 조명 영역 하지만 너무 많은 인구는 완전히 photobleached. 경우 SSTR3, 확산 계수는 느린 용 해 분자에 비해와 photobleached 지역으로 다시 유엔 photobleached SSTR3 분자의 인구 운동의 2 분, 있는 속눈썹 드리프트는 시간 보다 더 긴 것을 무시할 수 없는 요소입니다. 각된 조명 레이저는 흥분 위와 아래 놓여있는지 레이블이 단일 분자의 양을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다 photobleaching의 적절 한 수준은 달성 하기 어려운 배경 형광의 높은 레벨은 여전히 존재 하는 경우는 평면을 이미지입니다. 이 배경 하 각 캡처된 단일 분자에 대 한 신호 대 잡음 비율을 향상 하십시오.
요약 하자면, 속도 현미경 레이저 조명 소스, 관련 된 거울, 그리고 고속 CCD 카메라의 추가 의해 기존의 현미경 설정에 쉽게 구현 될 수 있다. 다른 유사한 기술을 통해 주요 발전은 크게 배경 형광을 감소 시키는 경향이 레이저와 2D 단일 분자에서 3D 공간 확률 밀도 지도 재구성 하는 2D-3D 변환 알고리즘 위치입니다. 생물 학적 관점에서 관심의 fluorophore 활용 된 단백질 외 아무 추가 라벨은 필요 합니다. 이러한 기능 수 높은 단일 분자를 추적 속도 현미경 spatiotemporal (5-10 nm, 0.4-2 ms) 해상도 그들은 회전 대칭 구조와 서브 마이크로미터 바이오-구멍 또는 바이오-채널을 통해 트래픽. 3 차원 확률 밀도 변환 알고리즘을 결합 하 여, 태그 단백질의 3 차원 전송 노선 구멍 또는 채널을 통해 결정 될 수 있습니다. 이 기술의 응용 프로그램은 이전에 사용 된 단백질 및 NPC 통해 RNAs의 3D 전송 경로 구분 하 고, 여기, 우리는 막 횡단 단백질, SSTR3, 및 IFT20, cytosolic 단백질의 3 차원 전송의 TZ에서 얻을 수 있습니다 보여줍니다. 기본 속눈썹입니다. 3D-폭풍 같은 다른 슈퍼 해상도 기법, 얻은 x, y, z 위치 위 또는 아래 그것의 위치에 따라 단일 분자 PSF의 비대칭 왜곡을 만드는 광학 경로에 원통형 렌즈를 배치 하 여 단일 분자에 대 한 초점면28. 또 다른 사전 방출 PSF의 폭을 더욱 해상도 증가 따라서 가상 pinhole 기술을 구현 하려고 수 있습니다. 위의 기술 속도 현미경 검사 법에 매우 쉽게 구현 될 수 있습니다. 속도 현미경 전송 경로 간-또는 내부-세포 기관이 분자 인신 매매에 대 한 슈퍼 높은 spatiotemporal 해상도 단일 분자 수준 및 3D 지도에서 전송 속도 결정 하는 동시에에 독특한 접근 방식을 제공 하는 전반적으로, 아래 라이브 셀 시스템에서 특정 상황.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
우리가 제공 하는 일부 플라스 미드에 대 한 박사 순 영 Verhey (미시간 대학, 앤 아 버)와 닥터 그레고리 Pazour (매사 추세 츠 대학의과 대학) 감사 합니다. 프로젝트는 건강의 국가 학회 (NIH GM097037, GM116204 및 W.Y. GM122552)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
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