Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium
Summary
Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.
Abstract
De primaire cilium is een uitsteeksel microtubulus-gebaseerd op het oppervlak van vele eukaryotische cellen en een unieke aanvulling van eiwitten bevat die functie kritisch in cel beweeglijkheid en signalering. Aangezien cilia niet in staat hun eigen eiwit synthese zijn, moeten bijna 200 unieke Ciliaire eiwitten worden verhandeld tussen het cytosol en primaire cilia. Het is echter nog steeds een technische uitdaging om driedimensionale (3D) locaties van vervoer trajecten voor deze proteïnen in levende primaire cilia vanwege de beperkingen van de huidige kaart technieken. Om te veroveren de uitdaging, hebben onlangs we ontwikkeld en ingezet een snelle virtuele 3D super resolutie microscopie, zogenaamde single-punts rand-excitatie microscopie van de sub diffractie (snelheid), om de 3D ruimtelijke locatie van vervoer opleidingstrajecten te bepalen beide cytosolische en membraaneiwitten in primaire cilia van levende cellen. In dit artikel zullen we laten zien van de gedetailleerde opzet van snelheid microscopie, de voorbereiding van cellen uiten fluorescentie-eiwit-geëtiketteerden Ciliaire eiwitten, de real-time tracking van de single-molecuul van afzonderlijke proteïnen in levende cilium en de verwezenlijking van 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaarten van transportroutes voor Ciliaire eiwitten.
Introduction
Omdat verklaarde door Ernst Abbe in 1873, heeft de resolutie van de lichte microscopie van conventionele is geloofd te worden beperkt tot ongeveer 200 nm als gevolg van lichte diffractie van de objectieve1,2. Momenteel super resolutie de lichte microscopie technieken breken deze beperking en toestaan dat de vangst van dynamische afbeeldingen met een resolutie van de sub diffractie (< 200 nm). De technieken in het algemeen vallen in twee brede categorieën: gestimuleerd emissie uitputting (STED) microscopie gebaseerde benaderingen, die sub diffractie verlichting volume als gevolg van niet-lineaire optische reactie van fluorophores te in monsters3 genereren; en de lichte microscopie van photoactivated (PALM) en stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)-op basis van super resolutie technieken, die gebruik maken van wiskundige functies om de centroids van fluorophores te lokaliseren en vervolgens reconstrueren deze centroids naar formulier super resolutie beelden4,5. Momenteel, als gevolg van de relatief ongecompliceerde optische setup, zijn PALM en STORM uitgebreid werkzaam bij slechts een kleine ondergroep van fluorophores in elk frame van een lange video van een biologische preparaat te activeren. Dit zorgt voor de nauwkeurigere lokalisatie door 2D Gaussian aanbrengen van fluorescerende plaatse genoemd van het punt verspreiden functie (PSV), van fluorescently gelabelde proteïnen in elk frame van de video. De 2D locatie van elke fluorescently gelabelde molecuul kan vervolgens worden bovenop een enkele imaging vliegtuig naar een super-resolutie afbeelding van de biologische voorbereiding1,2te produceren. Terwijl de lokalisatie van deze single-molecuul, super resolutie benaderingen van microscopie zeker een revolutie teweeggebracht in hoe beeldvorming van biologische monsters werd uitgevoerd, zijn er nog uitdagingen moeten worden overwonnen. Bijvoorbeeld, kunnen STORM en PALM bereiken hun beste ruimtelijke resoluties na fixatie van biologische monsters en dus een statische weergave van de fluorescently gelabelde proteïnen, die is een soortgelijke beperking van elektronenmicroscopie. Bovendien, om te bereiken hoge ruimtelijke resolutie voor elke fluorescently-geëtiketteerden proteïne in levende cellen, moeten monsters worden beeld bij zeer lange framerates die niet kunnen vangen van eiwit dynamiek. Daarom moet deze belangrijkste technische hindernissen overwinnen.
Voor het verkrijgen van een hoge Spatio resolutie die is geschikt voor het opsporen van snelbewegende proteïnen of RNAs in levende cellen, hebben we super resolutie snelheid microscopie in ons laboratorium (Figuur 1)6,7, 8. verschillende grote technische vooruitgang in snelheid microscopie hebben eerder ingeschakeld ons om bij te houden met succes nucleocytoplasmic vervoer van kleine molecules, eiwitten, mRNA en virus via native nucleaire porie complexen (NPC)6, 7 , 8. kort, de volgende functies van snelheid microscopie worden gebruikt voor het bijhouden van snelbewegende macromoleculen via sub micrometer rotatie symmetrische structuren in levende cellen, zoals NPC’s en primaire cilia: (1) een geneigd of een verticale verlichting PSF maakt de excitatie van afzonderlijke moleculen binnen een kleine diffractie-limit volume in het brandvlak (Figuur 1); (2) de geneigd PSF kan sterk voorkomen out-of-focus fluorescentie en dus de signal-to-noise verhouding te verbeteren. (3) de optische dichtheid van 100-500 kW / cm2 in de verlichting PSF maakt duizenden fotonen worden verzameld uit één fluorophores met snelle detectie snelheden (> 500 Hz). (4) de snelle detectie snelheid vermindert ook aanzienlijk de single-molecuul ruimtelijke lokalisatie fout (< 10 nm) bij het bepalen van de ruimtelijke trajecten van fluorescerende moleculen bewegen in levende cellen, omdat Moleculaire diffusie een van de belangrijkste factoren is veroorzaakt door onvolkomenheden van single-molecuul lokalisatie voor het bewegen van moleculen. (5) bekendere 2D naar 3D-transformatie-algoritmen kunnen wij leveren 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaarten van transportroutes voor moleculen in de NPC of de primaire cilium. Het is opmerkelijk dat onze conversieproces tussen de cartesiaanse en de cilindrische coördinatiesysteem wordt gebruikt voor het genereren van een 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaart in plaats van 3D single-molecuul tracking (Figuur 2). Eerder, elektronenmicroscopie gegevens is gebleken dat de NPC9,10 en de primaire cilium11 beide een rotatie symmetrische structuur hebben. In principe moeten willekeurig verspreiden moleculen bewegen door de NPC of primaire cilium ook rotatie symmetrische distributies. Zoals blijkt uit Figuur 2, een groot aantal willekeurig verspreiden moleculen in de cilinder rotatie symmetrische distributies op de dwarsdoorsnede bekijken als die zou genereren in de NPC, verder resulterend in een ongeveer eenvormige ruimtelijke distributie binnen elke zeer kleine subregio tussen twee naburige ringen(Figuur 2). Deze uniforme verdeling leidt dat de ruimtelijke spreiding langs θ dimensie in het cilindrische systeem constant is. Vervolgens kunnen de 3D-coördinaten (X, R, θ) worden vereenvoudigd om de 2D-coördinaten (R, X, constante). Eigenlijk is onze conversieproces tussen de Cartesische en cilindrische systemen van 2D (X, Y) aan 2D (R, X, constante). De constante θ, verwijst naar de ruimtelijke dichtheid p in Figuur 2E, wordt berekend met behulp van de vergelijking A
.
Uiteindelijk, single-molecuul tracking heeft een brede toepassing in biologisch onderzoek, dus het is logisch dat een overvloed aan technieken worden ontwikkeld om te vullen specifieke biologische niches12,13,14. Dit is het geval met snelheid microscopie. Eerder, wanneer in combinatie met een 3D-transformatie-algoritme, deze techniek werd ontwikkeld om op te lossen 3D transportroutes van doorvoer van de moleculen door de NPC’s, een sub-diffraction en middelgrote rotatie symmetrische biologische structuur-6. In dit document, zijn primaire cilia uitstekende model organellen zo goed aangetoond. Primaire cilia zijn cilinder-, antenne-achtige organellen (~ 125 nm radius) dat van het oppervlak van de meeste zoogdieren cellen15,16,17 project. Zij zijn verantwoordelijk voor het ontvangen van externe signalen en verzenden van een intracellulair reactie meestal verband met groei en metabolisme15,16. Daarom, flux van structurele proteïnen, recycling van transmembraan receptors, en doorgeven van intracellulaire boodschappers zijn essentiële verantwoordelijkheden van primaire cilia. Bij het verbindingspunt tussen de primaire trilharen en de cel lichaam is een kritische selectiviteit barrière, genaamd de overgangszone of TZ, waardoor alle dit eiwit transport11,18,19, moet voorkomen 20. Naast de gating functie van de TZ, worden ten minste twee transportprocessen, intraflagellair vervoer en passieve diffusie, verondersteld te zijn die verantwoordelijk zijn voor het verkeer van eiwitten door middel van deze regio16,21, 22. vanuit een oogpunt van de menselijke gezondheid, het verlies van primaire cilia en verdere deregulering van de stroomafwaartse signalering is kenmerkend voor veel kankers. Daarnaast zijn veel genetische ziekten, zoals het syndroom van Bardet-Biedl en polycysteuze nierziekte, geassocieerd met defecte eiwit vervoer23. Zowel de grootte van het beperken van de sub diffractie en het complexe proces van selectieve eiwit transport via de TZ maken de primaire cilia een belangrijk doelwit voor deze techniek. In deze paper methoden zullen we laten zien dat het volgen van een Ciliaire transmembraan eiwit, Somatostatine receptor 3 (SSTR3)24, extern gelabeld met Alexa Fluor 647 en een onderdeel van IFT, IFT2025, gemarkeerd met een gesmolten GFP-molecuul.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de toepassing van de microscopie van de snelheid op de primaire cilium, een cellulaire signalering organelle dat is sterk afhankelijk van efficiënte Eiwittransport. SNELHEID microscopie bieden hoge resolutie (< 10 nm) locaties voor fluorescently gelabelde moleculen als ze de aanspreekpunt verlichtingssterkte gecentreerd op de TZ passeren. Het is eerder toegepast om te bestuderen van de proteïne die handel tot en met de NPC6,7,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Kristen Verhey (Universiteit van Michigan, Ann Arbor) en Dr. Gregory Pazour (medische faculteit van de University of Massachusetts) voor het verstrekken van sommige plasmiden. Het project werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 en GM122552 naar W.Y).
Materials
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25×36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -. W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell’s antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
