Summary
לאחרונה אנחנו ממופה המיקומים מרחבי תלת מימדי (3D) של נתיבי תחבורה חלבונים שונים translocating בתוך ראשי cilia בתאים חיים. כאן זה פרטים נייר את הגדרת הניסוי, התהליך של דגימות ביולוגיות, הניתוחים נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית הרזולוציה סופר 3D הדמיה הגישה לאחרונה המוחלת בחיים cilia העיקרי.
Abstract
ריסי העיקרי הוא מבוסס microtubule בליטה על פני השטח של התאים האיקריוטים רבים והוא מכיל מהווה השלמה ייחודי של חלבונים שהפונקציה אנושות תא תנועתיות, איתות. מאז cilia אינם מסוגלים לסנתז חלבון משלהם, כמעט 200 חלבונים ciliary ייחודי צריך להיות הנסחר בין ציטוזול cilia העיקרי. עם זאת, זה עדיין אתגר טכני כדי למפות תלת מימדי (3D) מיקומים של תחבורה מסלולים עבור חלבונים אלה, חי ראשי cilia בגלל מגבלות הקיימת כיום טכניקות. לכבוש את האתגר, לאחרונה יש שפותחה ואנו המועסקים של מיקרוסקופ וירטואלי 3D super-resolution במהירות גבוהה, כינה מיקרוסקופ תת עקיפה (מהירות) נקודה אחת קצה-עירור, כדי לקבוע את המיקום המרחבי התלת-ממד של נתיבים לתחבורה שניהם cytosolic, קרום חלבונים ב- cilia העיקרי של תאים חיים. במאמר זה נדגים את ההתקנה מפורט של מהירות מיקרוסקופ, ההכנה של תאים המבטאים חלבונים ciliary זריחה-חלבון-שכותרתו ', את מעקב בזמן אמת אחר מולקולה בודדת של חלבונים בודדים ב ריסי בשידור חי, את ההישג של מפות צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד של נתיבי תחבורה ciliary חלבונים.
Introduction
מאז כאמור על ידי ארנסט אבה בשנת 1873, הרזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי יש כבר האמין להיות מוגבל כ 200 ננומטר עקב שבירת האור אובייקטיבית1,2. כיום, סופר-רזולוציה מיקרוסקופ אור טכניקות לשבור מגבלה זו ולאפשר לכידת תמונות דינאמית ברזולוציה תת עקיפה (< 200 ננומטר). הטכניקות בדרך כלל מתחלקים לשתי קטגוריות רחבות: גירוי פליטה דלדול (STED) מיקרוסקופיה המבוסס על גישות, המניבות עקיפה תת נפח תאורה עקב תגובת אופטית לא-לינאריות fluorophores דגימות3; מיקרוסקופ אור photoactivated (דקל), מיקרוסקופיה סטוכסטי שחזור אופטי (סערה)-המבוסס על שיטות זיהוי סופר, אשר מנצלים את פונקציות מתמטיות, ולהתאימם לעגה של centroids של fluorophores ואז לשקם את centroids האלה כדי ליצור סופר רזולוציה תמונות4,5. כיום, עקב הגדרת אופטי מסובכת יחסית, סערה ודקלים בהרחבה מועסקים על ידי הפעלת רק קבוצת משנה קטנה של fluorophores בכל מסגרת של סרטון ארוך של תכשיר ביולוגי. זה מאפשר עבור ההתאמה מדויקת יותר על ידי התאמה לפי עקומת גאוס 2D של הנקודה פלורסנט, כינה את הפונקציה הליין (PSF), שכותרתו fluorescently חלבונים בכל מסגרת של הוידאו. המיקום 2D של כל מולקולה עם התווית fluorescently ואז יכול להיות יונחו על מטוס הדמיה בודד כדי לייצר תמונת סופר רזולוציה של הכנה ביולוגי1,2. בזמן לוקליזציה מולקולה בודדת אלה, גישות סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה בהחלט מהפכה כיצד בוצעה הדמיה של דגימות ביולוגיות, עדיין ישנם אתגרים להתגבר. לדוגמה, סערה ודקל ניתן להשיג החלטות המרחבי בצורה הטובה ביותר שלהם לאחר קיבוע של דגימות ביולוגיות, ובכך להציג ייצוג סטטי של החלבונים עם התווית fluorescently, אשר היא מגבלה דומה של מיקרוסקופ אלקטרונים. בנוסף, להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה עבור כל חלבון הנקרא fluorescently בתאים חיים, דוגמאות חייב לדימות-framerates רב אשר אינם מסוגלים ללכוד dynamics חלבון. לכן, יש צורך להתגבר על מכשולים טכניים הראשי אלה.
כדי להשיג רזולוציה גבוהה ייתכן כי הוא מתאים היטב עבור זיהוי מהיר-המעבר חלבונים או RNAs בתאים חיים, פיתחנו רזולוציה סופר מהירות מיקרוסקופ ב שלנו מעבדה (איור 1)6,7, 8. ההתקדמות הטכנית מרכזיים במיקרוסקופ מהירות בעבר אפשרו לנו לעקוב בהצלחה nucleocytoplasmic התחבורה של מולקולות קטנות, חלבונים, mRNA ווירוסים דרך מקורית גרעיני הנקבוביות מתחמי (NPCs)6, 7 , 8. בקצרה, התכונות הבאות של מהירות מיקרוסקופ ישמש למעקב מהיר-המעבר מקרומולקולות דרך מבנים סימטריים rotationally מיקרומטר תת בתאים חיים, כגון NPCs cilia ראשי: (1) נוטה או תאורה אנכי PSF מאפשר את עירור של מולקולות יחיד בתוך אמצעי אחסון קטן עקיפה הגבלה ב מישור מוקד (איור 1); (2) PSF נוטה ניתן במידה רבה למנוע out-of-להתמקד פלורסצנטיות, ובכך לשפר את יחס אות לרעש. (3) הצפיפות האופטית של 100-500 קילוואט / ס מ2 ההארה PSF מאפשר אלפי פוטונים להיות שנאספו מ- fluorophores אחד עם זיהוי מהר למהירויות (> 500 Hz). (4) המהיר זיהוי מהירות מקטינה באופן משמעותי גם את השגיאה לוקליזציה המרחבי מולקולה בודדת (< 10 ננומטר) בקביעת את מסלולי המרחבי של מולקולות פלורסנט לגור תאים חיים, כי פעפוע הוא אחד הגורמים העיקריים גורם פגמים של מולקולה בודדת לוקליזציה להעברת מולקולות. (5) להקציע 2D ל 3D המרה אלגוריתמים מאפשרים לנו לספק מפות צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד של נתיבי תחבורה עבור מולקולות של NPC או את ריסי העיקרי. ראוי לציין כי תהליך ההמרה בין את קרטזי לבין מערכת תיאום גלילי משמש ליצירת צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד מפה ולא תלת-ממד יחיד מולקולה מעקב (איור 2). בעבר, מיקרוסקופ אלקטרונים נתונים נחשפו9,NPC10 ו ריסי הראשי11 לשניהם יש מבנה סימטרי rotationally. בעקרון, באופן אקראי לשדר המולקולות דרך NPC או ריסי הראשי צריך גם הפצות rotationally סימטרי. כפי שמוצג באיור2, מספר גבוה של אקראי לשדר מולקולות בתוך הגליל ליצור הפצות סימטרית rotationally-תצוגת חתך הרוחב עד כדי כך ב NPC, נוסף והתוצאה אחידה כ מרחבית הפצה בכל אזור משנה קטן מאוד בין שתי השכנות טבעות (איור 2E). התפלגות אחידה זה מוביל התפוצה המרחבית לאורך ממד θ באמצעות במערכת צירים היא קבועה. לאחר מכן ניתן לפשט את קואורדינטות תלת-ממד (R, X, θ באמצעות) להיות הקואורדינטות 2D (R, X, קבוע). למעשה, תהליך ההמרה בין קרטזי את המערכות גלילי הוא מ- 2D (X, Y) 2D (R, X, קבוע). Θ באמצעות מתמדת, מתייחס הצפיפות המרחבי p ב- איור 2E, מחושב באמצעות המשוואה A
.
בסופו של דבר, מולקולה בודדת המעקב מצא יישום רחבות במחקר ביולוגי, לכן טבעי כי שפע של טכניקות יתפתחו למלא נישות ביולוגי מסוים12,13,14. כזה הוא המקרה עם מיקרוסקופ מהירות. בעבר, כאשר בשילוב עם אלגוריתם שינוי תלת-ממד, טכניקה זו פותחה כדי לפתור נתיבי תחבורה תלת-ממדי של מולקולות דרך NPCs, משנה-diffraction בגודל rotationally סימטרי ביולוגי ומבנה6הם מגיעים. בנייר זה, מוצגים cilia הראשי להיות דגם מעולה organelles גם כן. Cilia הראשי הם גלילי, כמו אנטנה organelles (~ 125 nm radius) המקרינים מפני השטח של ביותר בתרבית של תאים15,16,17. הם אחראים על קבלת אותות חיצוניים והעברת מענה תאיים הקשורים בדרך כלל צמיחה חילוף החומרים15,16. לכן, שטף של חלבונים מבניים, מיחזור של רצפטורים transmembrane, והעברת שליחי תאיים האחריות חיוני של cilia העיקרי. בצומת בין של cilia העיקרי לגוף התא היא מכשול סלקטיביות קריטיים, המכונה אזור המעבר או צ', שדרכו כל העברה חלבון זו חייבת להתבצע11,18,19, 20. בנוסף הפונקציה חסימה של למתחם, נחשבים לפחות שני תהליכים התחבורה, תחבורה intraflagellar, דיפוזיה פסיבית, להיות אחראי על התנועה של חלבון דרך זה אזור16,21, 22. מבחינת בריאות האדם, האובדן של cilia העיקרי, ורשות עוקבות של איתות במורד הזרם היא תכונה של סרטן רבים. בנוסף, מחלות גנטיות רבות, כגון תסמונת Bardet-Biedl, מחלת כליות פוליציסטיות, משויכים חלבון פגום תחבורה23. עקיפה תת מגבלת גודל והן את תהליך מורכב של חלבונים סלקטיבי התחבורה באמצעות למתחם להפוך cilia העיקרי זה ליעד עיקרי עבור טכניקה זו. בנייר זה שיטות, נדגים את המעקב אחר טראנסממברנלי ciliary, קולטני סומטוסטטין 3 (SSTR3)24, תווית חיצונית עם אלקסה עבור חיל הים 647, רכיב של: אי, IFT2025, המסומנת מולקולה GFP מאוחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NIH-3T3 תא הכנה מהירות מיקרוסקופיה של מניות
- 1.5 שבועות מראש הניסוי, להתאושש תרבות טריים של תאים NIH-3T3 מניה קפוא על ידי מפשיר ב 37 מעלות צלזיוס והעברת התאים אל בקבוק התרבות התא של2 25 ס מ עם 3 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 110 מ"ג/מ"ל פירובט נתרן 2 מ מ גלוטמין, סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%.
- לפצל תאים ב- 80% confluency, על כל יומיים, לפחות שלוש פעמים לפני יום ניסיוני כדי להבטיח ההומוגניות של מחזור התא. Trypsinize תאים עם 0.25% טריפסין למשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, תשאף טריפסין ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של מדיום. פיפטה המדיום שוב ושוב כדי לשבור את התא אשכולות, להסיר את מספר התאים הרצויים ולהביא את הנפח הכולל של המדיה בחזרה עד 3 מ.
הערה: NIH-3T3 היו בעבר מהונדסים גנטית כדי להביע את NPHP-4, חלבון זה רגישה ל ט ז26, התמזגו התחנה הסופית C כדי mCherry. mCherry הוא fluorophore אשר יכול להיות שמחים עם תאורה nm 561 באופן כמותי בתרגום המכשול סלקטיביות ט ז, אוריינט cilia את ראשי. - יומיים לפני הניסוי, צלחת התאים 35 מ מ זכוכית תחתון דיש-60-70% confluency 1.5 מ של המדיום אותה כשלב 1.1 וחוזרים התאים החממה.
- יום אחד לפני הניסוי, מבחינה כימית transfect התאים עם פלסמיד הרצוי. לערבב 500-1000 ng של פלסמיד הרצויה (ראו הערה למטה) על יחס 1:2.5 עם ריאגנט תרביות תאים ב- 0.25 mL של מדיה מופחת סרום ללא אנטיביוטיקה במשך 30 דקות לשאוב מדיה מ- 35 מ מ זכוכית צלחת התחתון והחלף אותו פלסמיד 0.25 mL / תרביות תאים ריאגנט מיקס פלוס של mL 1.25 נוספת של מדיה מופחת סרום ללא אנטיביוטיקה. מדיה מופחת סרום משרת את המטרה להקל על תרביות תאים מוצלחת, גרימת cilia העיקרי לצמיחה, וכן להשאיר את התאים בחיים מספיק זמן כדי לבצע את הניסוי. לחזור תאים החממה לניסוי. למחרת היום.
הערה: בעת ביצוע המעקב מולקולה אחת של IFT20, פלסמיד המכיל ש-ift20 מהונדס גנטית התמזגו ב לתחנתו C ל GFP הוא בשימוש25. בעת ביצוע יחיד מולקולה מעקב של SSTR3, פלסמיד המכיל SSTR3 מהונדס גנטית התמזגו ב לתחנתו N לתחום פפטיד (AP) מקבל והוא טרמינוס C ל GFP בשימוש22. בנוסף הבונה SSTR3, פלסמיד המכיל את ליגאז ביוטין בירה חייבת להתבטא במשותף, התקשורת תרביות תאים חייב להיות בתוספת 10 מיקרומטר ביוטין. בירה מכן מצרף ביוטין לתחום AP של מולקולות AP-SSTR3-GFP לאחרונה מסונתז ברמה של המיון. Alexa647 מצומדת של האתרים מחייב ביוטין ארבע על streptavidin, שלושה בממוצע, ייתכן ואז ניתן להשלים את התקשורת לפני הדמיה לתווית fluorescently AP-SSTR3-GFP מולקולות על פני השטח החיצוני של התא22,27 . GFP, AlexaFluor647 נמצאים בשימוש בשיטה זו; עם זאת, אחרים הגששים פלורסנט יכול לשמש אם יש להם באופן דומה צילום-ביציבות גבוהה קוונטית תשואות. - אם באמצעות תווית חיצונית SSTR3 הבונה, הסר התקשורת מתחתית הכוס דיש h 1 לפני הניסוי, לשטוף את התא 5 פעמים עם 1 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS), ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה מופחת סרום בתוספת 1 מיקרומטר Alexa647 מצומדת streptavidin.
- לא יותר מ- 15 דקות לפני הניסוי, להסיר מדיה מן המנה התחתון זכוכית ולשטוף את התאים transfected ומתויגים 5 פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS.
- מקום 1 מ"ל של מאגר הדמיה (20 מ מ HEPES, 110 מ מ KOAc, 5 מ מ NaOAc, 2 מ מ. MgOAc, 1 מ"מ EGTA, pH 7.3) המנה קרקעית זכוכית.
הערה: במאגר הדמיה, תאים הם קיימא לא יותר מ-3 שעות. לכן, רק 2 h של ניסויים מבוצעים על כל מנה.
2. מהירות מיקרוסקופ
הערה: ההגדרה של מיקרוסקופ מהירות כולל מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד 1.4-נה 100 × שמן-טבילה apochromatic מטרה, עם 35 mW 633 ננומטר הוא-Ne לייזר, 50 mW מצב מוצק 488 ננומטר, 561-nm לייזרים, רווח כפל על שבב תשלום-בשילוב-התקן מצלמה, חבילת תוכנה מיקרוסקופ רכישת נתונים ועיבוד (איור 1). עבור ערוץ נפרד הדמיה, שמחים GFP, mCherry ו- Alexa647 על ידי 488 ננומטר, 561 ננומטר, או לייזרים nm 633, בהתאמה. לצורך מעקב מולקולה בודדת, תאורה בנקודה אחת משמשת למעקב אחר מולקולות בודדות עם התווית fluorescently. עבור הדמיה epifluorescence, עדשה קעורה ממוקם בנתיב תאורה לייזר כדי להרחיב את הקרן לתוך שדה אחיד של תאורה. פליטת קרינה פלואורסצנטית שנאספו על ידי אותה מטרה, מסוננת על-ידי מסנן ודיקרואיק זוהר (405/488 561 635) והן של מסנן פליטה (405/488 561 635) הינם עם תמונה עם מצלמת CCD לעיל פועלים ב 500 הרץ למעקב מולקולה בודדת או 2 הרץ עבור הדמיה epifluorescence.
- מוספית צלחת התחתון זכוכית לשלב של המיקרוסקופ ולאתר תא כראוי מביע המבנה הרצוי. ברגע תא מתאים נמצאה, יישר את המקום NPHP4-mCherry בבסיס cilia ראשי עם המיקום על המטוס הדמיה המתאים להארה בנקודה אחת של הלייזר.
- ללכוד את התמונה epifluorescence של NPHP4-mCherry IFT20-GFP או AP-SSTR3-GFP באמצעות הפונקציה "Snap" בכרטיסיה "המצלמה" החלון "המוקד בקרות" אם באמצעות חבילת התוכנה מיקרוסקופ דיגיטלי (ראה טבלה של חומרים).
הערה: התמונות האלה תפעל כנקודת התייחסות המיקומים הבאים מולקולה בודדת. - ברגע הדימויים הפניה מתקבלים, באופן מקומי להפחית את ריכוז מולקולות יחיד עם תוויות. צילום-אקונומיקה למתחם עם תאורה לייזר mW 1 20 s או עד עוצמת קרינה פלואורסצנטית הוא קרוב לזה של רקע זריחה.
הערה: כאשר ריכוז מדויק יכול להיות נשלט, 0.1-1 ננומטר שכותרתו מולקולות יחיד משמשים. - כדי להתכונן מעקב מולקולה בודדת, להפחית את עוצמת תאורה הלייזר ~0.15 mW עבור מולקולות יחיד עם GFP תוויות או ~0.5 mW עבור מולקולות המסומנת Alexa647.
- ברגע את עוצמת הלייזר והדמיה פרמטרים מוגדרים, רווח מרבי, התעצמות, 2 מילי-שניות מסגרת שיעור, עבור הדמיה מולקולה בודדת, לעסוק הלייזר תאורה המתאימה ולהקליט הלא-photobleached, שכותרתו מולקולות יחיד כפי הם מועברים דרך אזור photobleached למתחם על-ידי לחיצה על לחצן "זרם" בכרטיסיה "המצלמה" חלון "המוקד שולט".
הערה: לא יותר מ 2 דקות של וידאו צריך להילכד כדי למזער את ההשפעות של סחיפה ciliary לרמה זניחה. - לאחר לכידת וידאו מולקולה בודדת, לעבד את קטעי וידאו באמצעות אלגוריתם 2D התאמה לפי עקומת גאוס, כגון מבט חטוף על ידי המעבדה גלס, אשר רגישה בדיוק את centroid של עירור כל מולקולה אחת של PSF באזור המקיף של עניין (AOI).
- בחר כל המיקומים מולקולה בודדת עם דיוק < 10 ננומטר ולתקן במרכז cilia בהתבסס על התפלגות של מולקולה בודדת מיקומים מצויד פונקציה גאוסיאנית 2D.
הערה: באמצעות 2D שינוי תלת-ממד בעזרת אלגוריתם, נתיבי תחבורה תלת-ממד של נתיבי IFT20-GFP ו- AP-SSTR3 מוצגים באופן ברור ciliary קרום axonemal או ciliary, בהתאמה.
3. 2D ל 3D המרה
- לאחר מספר localizations אלף עבור הם מגיעים מולקולות (אות לרעש יחס > 11) ב- ריסי נאספים, בחר לציר הארוך של ריסי הממד X. ליצור היסטוגרמה ממד Y של המיקומים והשג את הסכומים סל ב- nm 10 דרגות.
הערה: 2D ל 3D המרה עשוי להיות מוערך על ידי היד או כל תוכנה או שפת תכנות. המחברים יישמו בהצלחה את הטרנספורמציה Matlab והן 2.7 פייתון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מדגים את הנתונים המתקבלים ביצוע מהירות מיקרוסקופיה-למתחם של cilia העיקרי ללמוד תוואי התחבורה SSTR3 מחובר באמצעות ~ 15 ננומטר מקשר חיצוני כדי Alexa647 (איור 3א). היא מגישה את המטרה הכפולה של אימות האלגוריתם שינוי תלת-ממדית. Alexa647 צריך רק תווית המשטח החיצוני של ריסי העיקרי ולכן, תוואי תחבורה 3D אמורים לגלות נתיב התחבורה בצפיפות גבוהה במיקום זה. NIH-3T3 לבטא stably NPHP3-mCherry-למתחם חייב להיות transfected עם AP-SSTR3-GFP, מודגרות לפי הפרוטוקול הנ עם Alexa647 streptavidin מצומדת. שדה רחב הדמיה של התווית mCherry משמש כדי להתאים לשפה למתחם בזמן GFP משמש כדי להבטיח כי תא הביעה הבונה SSTR3 הרצוי. בנוסף, שדה רחב הדמיה של התווית Alexa647 באמצעות תאורה nm 633 יש צורך לאשר התא כראוי הביעה את פלסמיד בירה ספגה מספיק ביוטין מאמצעי התקשורת. אישור מאופיין עם ריסי הגלויים נבדל ידי קרינה פלואורסצנטית רקע (איור 3ב). תיוג יעיל של הבונה AP-SSTR3-GFP עם Alexa647 streptavidin מצומדת יכול להתרחש רק בתנאים אלה. לאחר אישור של תיוג סלקטיבי של ריסי הראשי על-ידי Alexa647 התקבל, photobleaching, תאורה בנקודה אחת של למתחם עם לייזר nm 633 יאפשר מולקולות יחיד, ניתן לאבחן. לפני ניתוח נתונים, superimposing הווידאו מולקולה בודדת ההארה שדה רחב היא צעד שימושי אימות (איור 3ג'). לדוגמה, אם הלייזר לא מיושר כראוי, אין מולקולות יחיד יופיע כדי להתאים לשפה משותפת עם למתחם. צעד אימות ניתוח נתונים קדם נוסף על מנת להבטיח יחס אות לרעש נאותה היא לבדוק את עוצמת ב למתחם על אורך מולקולה בודדת וידאו (איור 3E). ניתוח כזה יכול להתבצע במהירות תוך שימוש בפונקציה 'מגרש פרופיל ציר z' ImageJ. הפסגות איור 3F תואמות המראה של מולקולה בודדת ב למתחם עם אות לרעש של ~ 5.0. הגרף הזה הוא גם מסוגל להבטיח כי מספיק photobleaching אירעה כפי שמעידים התדר מופרדים היטב של מולקולות יחיד. איור 3 G מדגים יחס אות לרעש נמוכה של < 0.5. הסבר אחד יהיה הלייזר לא מיושר ישירות על למתחם. סיבה אחרת ייתכן כי עוצמת תאורה הלייזר הוא נמוך מדי. הן ההסברים לגרום עירור נמוך ו, לכן, נמוך פליטת fluorophores-למתחם. לאחר בדיקות אלה נעשו, התאמה לפי עקומת גאוס 2D של מולקולות יחיד יהיה לייצר שלהם מסלולים ב למתחם (איור 3H). Superimposing מסלולים רבים ייצרו תוואי התחבורה של החלבון שכותרתו עניין בלמתחם (איור 3אני). מאז ההתאמה לפי עקומת גאוס 2D מקביל ערכי הפיקסלים על הגלאי, ה-x, y מולקולה בודדת נתונים ניתן למזג עם תמונת שדה רחב של צ', ראשי cilia להמחשה נוספת החלבון של הלוקליזציה של הריבית (איור 3J ).
IFT20 הוא רכיב של: אי מורכבות, אשר נושאת מטען לאורך microtubules בתוך cilia הראשי25. Arl13b-mCherry, חלבון הנמצא בשימוש נרחב סמן ciliary שימש לה תווית cilia העיקרי19. מיקרוסקופיית שדה רחב epi-זריחה היה פעם תמונה של ריסי הראשית המבטאת Arl13b-mCherry וגם IFT20-GFP, ואחר כך הוא החליף את מהירות מיקרוסקופ כדי לעקוב אחר חלבונים בודדים IFT20-GFP ב- cilia הראשי לאחר טרום-photobleaching של ה-GFP קרינה פלואורסצנטית לרמה מולקולה בודדת בתחום תאורה מהירות מיקרוסקופ (איור 4A-4 C).
בסופו של דבר, ניתן להשיג מאות של מולקולה יחידה IFT20-GFP מיקומים עם דיוק לוקליזציה שיטתית של < 16 nm ריסי העיקרי של תא חי (איור 4D). על-פי שלנו סימולציה, 250 יחיד מולקולה מיקומים עם רדיוס של 95 nm היה מספיק כדי ליצור נתיב התחבורה 3D אמין (איור 5). הקביעה הסופית של נתיב תחבורה IFT20-GFP מבוסס על אלפי מיקומים IFT20-GFP מולקולה בודדת שנאסף cilia עשר (איור 4E). מאז cilia ראשי בעל מבנה עם סימטריה סיבובית, 2D ל 3D המרה אלגוריתם הוחל על הנתונים המתוכננת 2D. מעניין, מפות צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד של IFT20 ציינו כי רק אזור בצפיפות גבוהה בודד עם רוחב ~ 60 ננומטר לשיאה ב ~ 95 nm לאורך הרדיוס של cilia הראשי (איור 4E). אזור בעל צפיפות גבוהה זה סביר רגישה במשותף עם microtubules axonemal, מסכים עם המיקום הידוע של המסלול: אי (איור 4F).
איור 1 . פשוטה סכמטית מהירות מיקרוסקופ. אנכי (נתיב 1) או תפקיד התפשטות נקודה נוטה (נתיב 2) משמש כדי להאיר מולקולות fluorophore יחיד ב מישור מוקד. "d" מתייחס המרחק בין קרן לייזר תאורה אנכי העובר דרך מרכז המטרה בזווית תאורה אשר מושגת על-ידי התמקדות הלייזר תאורה הקצה של המטרה. לייזרים שניים או יותר מוסדר על ידי המסוק אופטי יש מצב ב- off עירור משמשים כדי לעקוב אחר מולקולות יחיד או מועבר דרכה של NPC או את ריסי העיקרי. הפעם כבוי היא לפחות בוודאי יותר מאשר הזמן photobleaching של התווית fluorophore על מולקולות יישוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . הפגנה גרפי של 2D ל 3D המרה תהליך. שרטוט מדגימים את 2D ל 3D המרה אלגוריתם עבור מולקולות, לדוגמה, אם הם מפוזר בתוך מרכזי לומן (A-F) או אזור פריפריאלי (G-L) של שפופרת. (א) אידיאלי מיקומים מרחבי תלת-ממד של אקראי לשדר מולקולות בתוך צינור תתואם במערכת תיאום גלילי (R, X, θ באמצעות). ב. מהירות, רק את מפת צפיפות 3D מחושבת בסופו של דבר מהמיקומים המרחבי 2D. עם זאת, זה מקרה אידאלית כדי להמחיש כי מפת צפיפות 3D הוא שווה ערך אם המיקומים המרחבי 2D או 3D ידועים. (ב) את מיקומי מולקולרית 3D אצבע הם מוקרנת מטוס דו-מימדית בתוך מערכת קרטזית תיאום (X, Y, Z) על ידי הדמיה במיקרוסקופ. (ג) פרוסה דק מאוד (Δx) גזור מן הגליל א' לאורך x ממד. (ד) את מיקומי מרחבית תלת-ממד הפרוסה שמוצג C ניתן להקרין בתוך אזור 2D צרים. (ה) חתך הרוחב תצוגה של כל המיקומים בפרוסה דקה באיור ג מיקומים אלה, ניתן לקבץ את האזורים משנה בין טבעות קונצנטריות. בהתחשב גבוהה-מספר מולקולות מפוזרות באקראי את הצילינדר, הפרוסה לחתוך דק מאוד, הצפיפות המרחבי של מיקומים (pאני) בכל אזור המשנה (Si) בין שתי טבעות השכנות יהיה סימטרי rotationally ובעל מראה אחיד. מיקומים אלה יכולים להיות עוד יותר המוקרנים אל 1 י לאורך הממד Y. אם המיקומים לאורך ממד Y מקובצים בהיסטוגרמה עם j עמודות. המספר הכולל של מיקומים בכל עמודה (Aj) שווה ל- 
, אשר ניתן השפעול למדוד כפי שמוצג (נ). (G-L) בדומה כמו לעיל, תהליך הטרנספורמציה מוצג עבור מולקולות לשדר בתוך אזור הפריפריה של שפופרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . תלת-ממד מרחבי מיקום של תוואי תחבורה עבור SSTR3 על חיים cilia העיקרי ממופים באמצעות מיקרוסקופ מהירות. (א) ייצוג גרפי של מהירות מיקרוסקופ מיושמים על מעקב של GFP מתויג SSTR3 דרך למתחם, המסומנת באמצעות NPHP4-mCherry. (ב) Epifluorescence תמונה של NPHP4-mCherry (אדום), AP-SSTR3-GFP (ירוק), Alexa647 נהגו תווית חיצונית AP-SSTR3-GFP (לבן), את התמונה הממוזגת הסופי. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. מעקב אחר (ג) יחיד התווית על-ידי אלקסה 647 AP-SSTR3-GFP (לבן) העובר דרך נקודת תאורה השדה עבור ארבע מסגרות (2 ms/מסגרת). סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. (ד) מולקולה בודדת מסלול (לבן) מ (ג) יונחו על דמותה epifluorescence של NPHP4-mCherry (אדום) ו- AP-SSTR3-GFP (ירוק). סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. לבן (E) מקווקו מדגיש ריבוע ממורכז אזור ההארה בנקודה אחת על למתחם. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. (נ) פוטון ספירת לעומת המסגרת מספר גרף עבור מולקולה בודדת וידאו עם קליטה גבוהה יחס הרעש נקבע על-ידי חלוקת של זריחה המרבי של המולקולה יחיד מחולק על-ידי קרינה פלואורסצנטית הרקע. (ז) פוטון ספירת לעומת מסגרת גרף מספר עבור מולקולה בודדת וידאו עם קליטה נמוכה יחס הרעש. (ח) מסלול מ- (E) (D) לשפות אחרות בכל מסגרת על ידי התאמה לפי עקומת גאוס 2D, יונחו על ייצוג גרפי מדויק של למתחם, גם לשפות אחרות על ידי התאמה לפי עקומת גאוס 2D. תהליך התאמה לפי עקומת גאוס 2D מתאים פונקציה לפי עקומת גאוס, הממדים X ו- Y של הפרופיל בעוצמה של אזור התעניינות (AOI) המקיף של מולקולה יחידה PSF.(I) סופר-רזולוציה 2D התפוצה המרחבית של 220 בודדים התווית על-ידי אלקסה עבור חיל הים 647 AP-SSTR3-GFP מיקומים שנאסף ריסי ראשי יחיד. (י) סופר רזולוציה מולקולה בודדת מיקומים (I) יונחו על דמותה epifluorescence של NPHP4-mCherry (אדום) ו- AP-SSTR3-GFP (ירוק). סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. (K) על ידי 2D שינוי תלת-ממד בעזרת אלגוריתם, התפלגות מרחבית צפיפות ההסתברות של התווית על-ידי אלקסה עבור חיל הים 647 AP-SSTR3-GFP-cilia העיקרי לאורך הממד R הושג. מבוסס על הפונקציה גאוסיאנית מתאים, התווית על-ידי אלקסה עבור חיל הים 647 AP-SSTR3-GFP נמצא בעיקר על קרום ciliary-רדיוס של 131±3 nm עם מלא רוחב חצי מקסימום (FWHM) של 24±1 ננומטר. (יב) חתך נוף של התפלגות מרחבית צפיפות ההסתברות (ענן ירוק) של התווית על-ידי אלקסה עבור חיל הים 647 AP-SSTR3-GFP cilia העיקרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . תלת-ממד מרחבי מיקום של תוואי תחבורה עבור IFT20 בתוך חיים cilia העיקרי ממופים באמצעות מיקרוסקופ מהירות. (א-ג) תמונה ייצוגית של Arl13b-mCherry (א) ו- IFT20-GFP (ב') לידי שיתוף תא NIH3T3, "ממוזג" (C). המעגל (ציאן) מציין שהמיקום של נקודה אחת תאורה של מהירות מיקרוסקופ על ריסי העיקרי גדל בצד של תא (קווים מקווקווים לבן) קצוות אשר נקבעים על-ידי קרינה פלואורסצנטית IFT20-GFP שדה בהיר תאורה ובגוף התא (לא מוצג). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (ד) סופר-רזולוציה 2D התפוצה המרחבית של 286 המיקומים IFT20-GFP בודדים שנאסף ריסי ראשי יחיד. (ה) על-ידי 2D שינוי תלת-ממד בעזרת אלגוריתם, התפלגות מרחבית צפיפות ההסתברות IFT20-GFP בתוך ראשי cilia לאורך הממד R מתקבל. על סמך התאמה פונקציה לפי עקומת גאוס, IFT20-GFP בעיקר לאתר ב רדיוס של 95±1 nm עם מלא רוחב חצי מקסימום (FWHM) של 56±5 ננומטר. (ו) חתך תצוגה של צפיפות ההסתברות המרחבי ההתפלגות (עננים ירוק) של IFT20-GFP ב- cilia העיקרי, ועליהן בתרשימים בר ה סולם: 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . סימולציה שימש כדי להעריך את המספר המינימלי של מיקומים 2D מולקולה בודדת כדי ליצור מפה אמינה צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד עבור 2D ל 3D טרנספורמציה אלגוריתמים. (א) 100 שהמפתחות שנוצרו על-ידי מיקומים מולקולה בודדת לדגום באופן אקראי בהתפלגות רגילה צפיפות מעגל שמרכזו בנקודה 95 nm (תואם לתוואי תחבורה ראשי IFT20 נחוש בניסויים שלנו). דיוק לוקליזציה של 16 nm מדומה עבור כל מיקום יחיד מולקולה על ידי דגימה מתוך התפלגות נורמלית עם σ = 16 ננומטר. כפי שמוצג באיור 2C, פרוסה דק מאוד (Δx) הממד X משמש עבור שינוי אלגוריתמים, לכן הממד X אינה מוצגת במיקומים שנוצר שהמפתחות 2D מולקולה בודדת. (ב) טרנספורמציה בין נתוני פרוייקט Y-ממדי וצפיפות R-ממדי 3D להפיק היסטוגרמות של צפיפויות R-ממדי 3D עבור חמש שונים מדומים ערכות נתונים (כל אחד עם 100 נקודות). המספר לעיל הוא ± מיקום השיא הולם שגיאה. (C-D) תוצאות הדמיה המבוסס על 250 מקומות מולקולה בודדת. (E-F) תוצאות הדמיה המבוסס על 500 מקומות מולקולה בודדת. (G-אני) ממוצע צפיפות 3D היסטוגרמות של סימולציות 100 - 250 -, 500-נקודות בהתאמה. קווי שגיאה מייצגים השתנות הגולן סל היסטוגרמה בזמן המספר מעל השיא הוא עמדה השיא הממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את היישום של מהירות מיקרוסקופ ריסי העיקרי, אברון איתות סלולרי זה מאוד מסתמך על תחבורה יעילה חלבון. מיקרוסקופ מהירות יכול לספק ברזולוציה גבוהה (< 10 ננומטר) מיקומים עבור מולקולות עם התווית fluorescently כפי שהם עוברים ההארה בנקודה אחת שבמרכזה למתחם. בעבר זה הוחל ללמוד החלבון סחר דרך NPC6,7,8. עם זאת, זה יורחב כדי ללמוד סחר דרך חלל הסלולר בכל עקיפה משנה. טכניקה זו יש יתרון על פני שאר טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה בכך שהוא מסוגל לתפוס את הדינמיקה של חלבון יחיד תחבורה במערכות תא חי ברזולוציה יכולות של < 10 ננומטר, < 2 מילי-שניות, בהתאמה. יתרון נוסף הוא אחד חייב רק fluorescently תווית חלבון עניין ולבטא את הבונה באמצעות תרביות תאים, גישה ביולוגיה מולקולרית משותפת ללמוד לוקליזציה חלבון, כדי להתחיל בביצוע מהירות מיקרוסקופ. אחד יש לזכור כי ההארה בנקודה אחת עם לייזר ובעוצמת היא התכונה המספק את מיקומי מולקולה בודדת מופרדים היטב, ברזולוציה גבוהה. עם זאת, זה גם מגביל את האזור תאורה והופכת את הטכניקה אינו מתאים שדה רחב לוקליזציה. למרבה המזל, קיימות שיטות רבות סופר רזולוציה שדה רחב לחוקרים לבחירה, אם רצונך בכך. נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון הוא כי מהירות מיקרוסקופ בלבד לוכדת מיקומים של העברת מולקולות יחיד. לכן, בשילוב עם FRAP, אשר יכול לקבוע את השבר של מולקולות סה כ כי הם ניידים, ייתכן תוספת שימושית ניתוח.
תהליך ההמרה בין את קרטזי לבין מערכת תיאום גלילי הוא ליצור מפת צפיפות 3D מדומה במקום תצוגה תלת-ממדית המבוססת על 3מעקב מולקולה בודדת. בפירוט, מיקרוסקופ אלקטרונים נתונים חשפו cilia העיקרי שיש מבנה סימטרי rotationally אשר יכול ליצור התפלגות אחידה מולקולה לאורך הרדיוס מסוימים. התפלגות אחידה זה מוביל התפוצה המרחבית לאורך ממד θ באמצעות במערכת צירים היא קבועה. לאחר מכן ניתן לפשט את קואורדינטות תלת-ממד (R, X, θ באמצעות) להיות הקואורדינטות 2D (R, X, קבוע). למעשה, תהליך המרה בין קרטזי את המערכות גלילי הוא מ- 2D (X, Y) 2D (R, X, קבוע). Θ באמצעות מתמדת, מתייחס הצפיפות המרחבי p, מחושב באמצעות המשוואה A
(איור 2). משתמש מטריקס מחשבון לחישוב וקטור 
, אשר מתכתב עם האזורים היחסי בין טבעות השכן חתך הרוחב תצוגה6,7Aj s האתרים הכולל אינטראקציה ב j המיקום נמדדו ישירות מן הניסויים; לפיכך, pאני, צפיפות ההסתברות המרחבי של האתרים אינטראקציה-rאני, יכול להיות מחושב על ידי פתרון המשוואה מטריצה של A.
שלב קריטי בפרוטוקול היא למזער את כל ההפרעות של ההתקנה מיקרוסקופ בין התייחסות ייבוא תמונות וידאו מולקולה בודדת. אם כל תנועה מתרחשת, זה לא אפשרי למיפוי בביטחון את מיקומי מולקולה בודדת ultrastructure של cilia ראשי זה הושג באמצעות הדמיה epifluorescence. צעד חיוני נוסף היא photobleach האזור של תאורה מספיק כדי להפחית באופן מקומי את הריכוז של מולקולות בודדת fluorescently המסומנות בתווית, אך לא כך כי האוכלוסיה היא לחלוטין photobleached. במקרה של SSTR3, מקדם דיפוזיה היא איטית לעומת מולקולות מסיסים, תנועת אוכלוסיה של האו ם-photobleached SSTR3 מולקולות חזרה לאזור photobleached יהיה יותר מ 2 דקות, הזמן שמעבר נסחפים ciliary פקטור שעצירת. אם הרמה הנכונה של photobleaching קשה להשיג רמה גבוהה של קרינה פלואורסצנטית רקע עדיין קיימת, לייזר תאורה בזווית עשוי לשמש כדי להפחית את כמות מולקולות יחיד fluorescently שכותרתו מתרגשים מעל ומתחת המטוס הדמיה. זה להפחית את הרקע, לשפר את יחס אות לרעש עבור כל מולקולה בודדת שנתפסו.
לסיכום, מהירות מיקרוסקופ הוא מסוגל בקלות ליישם מיקרוסקופ רגיל כיוונונים על-ידי התוספת של מקור תאורה לייזר, מראות המשויך במהירות גבוהה CCD מצלמה. קידום הראשי על טכניקות דומות אחרות הן הלייזר נוטה אשר מקטינה באופן משמעותי את רקע זריחה האלגוריתם טרנספורמציה 2D ל- 3D אשר משחזר את מפת צפיפות ההסתברות מרחבית תלת-ממד של המולקולה-יחיד 2D מיקומים. מבחינה ביולוגית, אין תיוג נוספות מלבד חלבון fluorophore מצומדת עניין נדרש. מאפיינים אלה מאפשרים מהירות מיקרוסקופ לעקוב אחר מולקולות יחיד עם גבוה ייתכן (5-10 ננומטר, 0.4-2 ms) רזולוציה כפי שהם תעבורה באמצעות מיקרומטר תת ביו-חלל או ביו-ערוץ עם מבנים סימטריים rotationally. בשילוב עם אלגוריתם שינוי צפיפות 3D, נתיבי תחבורה תלת-ממדי של החלבונים מתויג עשוי להיקבע דרך חלל או ערוץ. היישום של טכניקה זו שימש בעבר כדי להבחין בין נתיבי תחבורה תלת-ממדי של חלבונים ושל RNAs דרך NPC ו, הנה, אנחנו מראים כי העברת תלת-ממד של חלבון טראנסממברנלי SSTR3, חלבון cytosolic, IFT20, עשוי להיות מושגת למתחם של cilia העיקרי. סופר רזולוציה טכניקות טיפול נוספות, 3D-סופה, יש להשיג x, y, z מיקומים עבור מולקולות יחיד על-ידי הצבת עדשה גלילית בנתיב אופטי אשר יוצר של עיוות סימטרית של PSF מולקולה בודדת בהתאם את מיקומו מעל או מתחת מטוס מוקד28. התקדמות נוספת עשויים לנסות ליישם טכנולוגיה חריר וירטואלית כדי להפחית את הרוחב של הפליטה PSF, ובכך להגדיל את הרזולוציה עוד יותר. הטכניקות שלעיל ניתן ליישום על מהירות מיקרוסקופ די בקלות. בסך הכל, מיקרוסקופיה מהירות מספקת גישה ייחודית בקביעת בו-זמנית קינטיקה תחבורה-במפת רמת תלת-ממד יחיד מולקולה של תחבורה מסלולים עם רזולוציה ייתכן סופר-גבוהה על סחר מולקולרית אינטר - או אינטרה-אברון בנסיבות מסוימות במערכות תא חי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר קריסטן Verhey (אוניברסיטת מישיגן, אן ארבור) ואת ד ר גרגורי Pazour (בית הספר לרפואה אוניברסיטת מסצ'וסטס) על מתן כמה פלסמידים. הפרויקט נתמך על ידי מענקים המכון הלאומי לבריאות (NIH GM097037, GM116204 ו- GM122552 כדי W.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell's antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
