Anvendelsen af højhastigheds super-resolution hastighed mikroskopi i Live primære Cilium
Summary
For nylig kortlagt vi tre-dimensionelle (3D) rumlige placeringen af transportveje for forskellige proteiner translocating inde primære cilier i levende celler. Dette papir beskriver den eksperimentelle setup, processen med biologiske prøver og dataanalyse til 3D super-resolution fluorescens imaging tilgang nyligt anvendt i live her primære cilier.
Abstract
Den primære cilium er en mikrotubulus-baserede fremspring på overfladen af mange eukaryote celler og indeholder et enestående supplement af proteiner der fungerer kritisk i celle motilitet og signalering. Da cilia er stand til at syntetisere deres egen protein, skal næsten 200 unikke ciliaere proteiner være smugles mellem cytosol og primære cilier. Men det er stadig en teknisk udfordring at kortlægge tredimensionale (3D) steder af transport veje for disse proteiner i levende primære cilier på grund af begrænsninger i øjeblikket eksisterende teknikker. For at erobre udfordringen, har for nylig vi udviklet og ansat en højhastigheds virtuelle 3D super-resolution mikroskopi, såkaldte single-point kant-excitation sub diffraktion (hastighed) mikroskopi, for at bestemme den 3D fysisk placering af transport veje for begge cytosole og Membranproteiner i primære cilier af levende celler. I denne artikel, vil vi vise detaljerede opsætningen af hastighed mikroskopi, fremstilling af celler, der udtrykker fluorescens-protein-mærket ciliaere proteiner, sporing af individuelle proteiner i levende cilium realtid enkelt-molekyle og opnåelsen af 3D rumlige betafordelingen kort af transportveje til ciliaere proteiner.
Introduction
Da anført af Ernst abbed i 1873, har opløsning af konventionelle lysmikroskopi været menes at være begrænset til ca. 200 nm på grund af lyset diffraction fra objektive1,2. I øjeblikket super-resolution lysmikroskopi teknikker bryde denne begrænsning og tillade fangst af dynamiske billeder med sub diffraktion (< 200 nm) opløsning. Teknikkerne generelt opdeles i to hovedkategorier: stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi baserede tilgange, som genererer sub diffraktion belysning volumen på grund af ulineære optiske svar af fluorophores i prøver3; og photoactivated lysmikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)-baseret super-resolution teknikker, der anvender matematiske funktioner for at lokalisere centroids af fluorophores og derefter rekonstruere disse centroids at danne super-resolution billeder4,5. I øjeblikket, på grund af den relativt ukompliceret optisk setup, PALM og STORM er udførligt ansat ved at kun aktivere en lille delmængde af fluorophores i hver ramme af en lang video af en biologisk forberedelse. Dette giver mulighed for mere nøjagtig lokalisering af 2D Gaussisk montering af fluorescerende stedet kaldes funktionen punkt spredt (PSF), af fluorescently mærket proteiner i hver ramme af videoen. 2D placeringen af hver fluorescently mærket molekyle kan derefter overlejret på et enkelt tænkelig plan at producere en super-opløsning billede af biologiske forberedelse1,2. Mens disse enkelt-molekyle lokalisering, super-resolution tilgange til mikroskopi helt sikkert revolutioneret hvordan billeddannelse af biologiske prøver blev udført, der er stadig udfordringer skal overvindes. For eksempel kan STORM og PALM opnå deres bedste rumlige beslutninger efter fiksering af biologiske prøver og således til stede en statisk repræsentation af fluorescently mærket proteiner, som er en lignende begrænsning af Elektron Mikroskopi. Derudover for at opnå høj rumlige opløsning for hver fluorescently mærket protein i levende celler, skal prøver være afbildet på meget lange framerates, som ikke er i stand til at fange protein dynamics. Det er derfor nødvendigt at overvinde disse vigtigste tekniske forhindringer.
For at opnå en høj spatiotemporelle opløsning, der er velegnet til påvisning af hurtige proteiner eller RNA’er i levende celler, har vi udviklet super-resolution hastighed mikroskopi i vores laboratorium (figur 1)6,7, 8. flere store tekniske fremskridt i hastigheden mikroskopi har tidligere gjort det muligt at kunne spore nucleocytoplasmic transport af små molekyler, proteiner, mRNA og virus via indfødte nukleare pore komplekser (NPC’ere)6, 7 , 8. kort, følgende funktioner hastighed mikroskopi vil blive brugt til at spore hurtige makromolekyler gennem sub mikrometer rotationsstøbt symmetriske strukturer i levende celler, såsom NPCs og primære cilier: (1) en skrå eller en lodret belysning PSF giver mulighed for excitation af enkelt molekyler i en lille diffraktion-limit volumen i brændplanet (figur 1); (2) den skrå polyesterfibre kan stærkt undgå out-of-fokus fluorescens og dermed forbedre signal-støj-forhold. (3) den optisk tæthed på 100-500 kW / cm2 i belysning PSF giver mulighed for tusindvis af fotoner vil blive indsamlet fra enkelt fluorophores med hurtig påvisning hastigheder (> 500 Hz). (4) hurtigt registrering af hastighed reducerer også i høj grad den enkelt-molekyle geografiske lokalisering fejl (< 10 nm) ved fastsættelsen af de rumlige baner af bevægelige fluorescerende molekyler i levende celler, fordi molekylære diffusion er en af vigtigste faktorer forårsager mangler af enkelt-molekyle lokalisering for at flytte molekyler. (5) almindelig 2D til 3D transformation algoritmer gør det muligt at give 3D rumlige betafordelingen kort af transportveje for molekyler i NPC eller den primære cilium. Det er bemærkelsesværdigt, at vores konverteringen mellem de kartesiske og cylindriske koordineringssystem bruges til at generere en 3D rumlige betafordelingen-kort i stedet for 3D enkelt-molekyle-tracking (figur 2). Elektronmikroskopi data har tidligere afsløret, at NPC9,10 og primære cilium11 begge har en rotationsstøbt symmetrisk struktur. I princippet bør tilfældigt spreder molekyler bevæger sig gennem NPC eller primære cilium også have rotationsstøbt symmetrisk distributioner. Som vist i figur 2, et stort antal tilfældigt spreder molekyler inde i cylinderen ville generere rotationsstøbt symmetrisk distributioner på visningen tværsnit som i NPC, yderligere resulterer i en omtrent ensartet rumlige fordeling inden for hver meget små subregion mellem to tilstødende ringe (figur 2E). Dette ensartet fordeling medfører, at den geografiske fordeling langs θ dimension i den cylindriske system er konstant. Derefter kan 3D-koordinater (R, θ, X) forenkles for at være 2D-koordinater (R, X, konstant). Faktisk, vores konverteringen mellem de kartesiske og cylindriske systemer er fra 2D (X, Y) til 2D (R, X, konstant). Den konstante θ, refererer til den rumlige tæthed Pedersen i figur 2E, beregnes ved hjælp af ligningen A
.
I sidste ende, enkelt-molekyle tracking har bred anvendelse i biologisk forskning, derfor er det naturligt, at et utal af teknikker vil blive udviklet for at udfylde særlige biologiske nicher12,13,14. Det er tilfældet med hastighed mikroskopi. Tidligere, når kombineret med en 3D transformation algoritme, denne teknik blev udviklet for at løse 3D transportruter i transit molekyler gennem NPCs, en sub-diffraction mellemstore og rotationsstøbt symmetrisk biologiske struktur6. I dette papir, er primære cilier vist sig at være fremragende model organeller som godt. Primære cilier er cylindrisk, antenne-lignende organeller (~ 125 nm radius), projekt fra overfladen af mest mammale celler15,16,17. De er ansvarlige for at modtage eksterne signaler og sender en intracellulær reaktion typisk forbundet med vækst og stofskifte15,16. Derfor, flux af strukturelle proteiner, genanvendelse af transmembrane receptorer, og transmission af intracellulære budbringere er afgørende ansvar for primære cilier. På tidspunkt mellem de primære cilie og cellen kroppen er en kritisk selektivitet barriere, kaldet overgangszone eller TZ, hvorigennem alle dette protein transport skal forekomme11,18,19, 20. Ud over TZ gating funktion der mindst to processer, transport, intraflagellar transport og passive diffusion, menes at være ansvarlig for bevægelse af protein gennem denne region16,21, 22. ud fra en menneskelig sundhed synspunkt, tab af primære cilier og efterfølgende deregulering af downstream signalering er karakteristisk for mange kræftformer. Derudover er mange genetiske sygdomme, såsom Bardet-Biedl syndrom og polycystisk nyresygdom, forbundet med defekte protein transport23. Både sub diffraktion grænse størrelse og den komplekse proces i selektiv protein transport gennem TZ gør de primære cilie primære mål for denne teknik. I denne metoder papir, vil vi vise sporing af en ciliaere transmembrane protein, somatostatin receptor 3 (SSTR3)24, mærket eksternt med Alexa Fluor 647 og en komponent af IFT, IFT2025, mærket med en smeltet normal god landbrugspraksis molekyle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver anvendelsen af hastighed mikroskopi til den primære cilium, en cellulær signalering organelle, der er stærkt afhængig af effektiv protein transport. HASTIGHED mikroskopi kan give høj opløsning (< 10 nm) steder for fluorescently mærket molekyler som de passerer gennem enkelt punkt belysningen centreret om TZ. Det er tidligere blevet anvendt til at undersøge protein handel gennem NPC6,7,8. Det kan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke Dr. Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) og Dr. Gregory Pazour (University of Massachusetts Medical School) for at give nogle plasmider. Projektet blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 og GM122552 til W.Y.).
Materials
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25×36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -. W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell’s antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
