هذا البروتوكول يصف تقييم مورين اتريا استخدام نظام رسم خرائط بصرية مع ارتفاع قرار الزماني والمكاني، بما في ذلك التسجيلات المزدوجة للجهد غشاء الكهربية و Ca2 + عابرة تحت المبرمجة التحفيز عن طريق قسطرة قطب متخصصة.
قد بينت الدراسات على نطاق الجينوم جمعية الأخيرة استهداف الرجفان الاذيني (AF) رابطة قوية بين النمط الوراثي والنمط الظاهري الكهربية في الاذينين. أن يشجعنا على استخدام نموذج الفأر وراثيا لتوضيح إليه بالعربية. ومع ذلك، من الصعب تقييم الخصائص الكهربية في الاذينين مورين نظراً لصغر حجمها. ويصف هذا البروتوكول الكهربية تقييم استخدام نظام رسم خرائط بصرية مع عالية دقة المكانية والزمانية في قلوب مورين لانجيندورف perfused اتريا. يتم تجميعها نظام رسم الخرائط البصرية مع ثنائي أكسيد المعدن المتمم عالية السرعة أشباه الموصلات الكاميرات والعدسات هدف تضخم عالية، للكشف عن الأسفار صبغة حساسة للجهد ومؤشر Ca2 + . للتركيز على تقييم موريني الاذينين، يتم رسم الخرائط الضوئية تبلغ مساحتها 2 × 2 مم أو 10 مم × 10 مم، 100 × 100 قرار (20 ميكرون/بكسل أو 100 بيكسل ميكرومتر) ومعدل أخذ العينات لتصل إلى 10 كيلوهرتز (0.1 مللي ثانية) كحد أقصى. يوضع قطب كوادريبولار حجم 1-الفرنسية سرعة القسطرة إلى الاذين الأيمن عن طريق الأجوف فينا متفوقة تجنب أية أضرار ميكانيكية للحديقة الشتوية، وسرعة التحفيز يتم تسليمها عن طريق القسطرة. تتم دراسة الكهربية مع تحفيز المبرمجة، بما في ذلك سرعة ثابتة، انفجر سرعة، وتصل إلى سرعة اكستراستيمولي الثلاثي. تحت عفوية أو سرعة إيقاع، سجلت رسم الخرائط البصرية إمكانات العمل مدة وتفعيل خريطة، وسرعة التوصيل و Ca2 + عابرة على حدة في الاذينين الأيمن والأيسر. وباﻹضافة إلى ذلك، يحدد تحفيز المبرمجة كما إيندوسيبيليتي تاتشيارهيثمياس أذينية. يتم تنفيذ التعيين التنشيط دقة تحديد نشر الإثارة في الحديقة الشتوية خلال تاتشيارهيثميا أذينية مستحث. رسم الخرائط البصرية مع إعداد متخصصة يمكن إجراء تقييم شامل الكهربية للحديقة الشتوية في النماذج المرضية مورين.
القلب يتكون من 4 غرف في الثدييات. دائرتي العليا الاذينين، وهم أقل البطينين. البطينين تعمل كمضخة لإخراج الدم إلى الدورة الدموية الجهازية أو الرئوية. اتريا تلقي الدم العودة من الأوردة الجهازية أو الرئوية، والمساعدة في نقل الدم إلى البطينين الحصول على وظيفة كفاءة ضخ القلب. من جانب الكهربية، مهمة هامة الاذينين لتنظيم ضربات القلب. الإشارات الكهربائية التي تنشأ من العقدة الجيوب الأنفية تقع على مفترق الطرق بين أعلى الوريد الأجوف (SVC) والاذين الأيمن (RA)، ثم تنتشر إلى جمهورية أرمينيا والاذين الأيسر (LA)، وإجراء البطين عبر العقدة الأذينية وصاحب بوركنجي نظام التوصيل.
عدم انتظام ضربات القلب، واضطرابات إيقاع القلب، تصنف إلى الرجفان والبطين وفقا لأصلهم. الرجفان الاذيني (AF) هو الأكثر شيوعاً المستمر عدم انتظام ضربات القلب، تتميز بإثارة العشوائية والسريعة الاذينين. وقد أظهرت التحليلات الجينية الحديثة والدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جوس) الرابطة بين AF والطفرات الوراثية أو مونوبوليمورفيسمس1،2،،من34. تشير هذه النتائج إلى AF يرتبط على الأقل جزئيا سبب وراثي. ولذلك، من المهم تقييم التفاعلات الوراثي-النمط الظاهري في الاذينين استخدام نموذج حيوانات المهندسة وراثيا. من المقبول على نطاق واسع أن الماوس هو الثدييات الأكثر رسوخا للتحوير الوراثي.
تقنية رسم الخرائط الضوئية وضعت لتقييم إثارة أنسجة القلب. ومع ذلك، مراقبة اتريوم موريني برسم الخرائط البصرية يعوقها حجمها الصغير نسبيا. ونحن في محاولة لتحقيق تقييم مفصل اتريوم مورين مع عالية دقة المكانية والزمانية.
رسم الخرائط البصرية هو مناورة راسخة لدراسة القلب الكهربية7، وهو أداة مفيدة للغاية لتقييم عدم انتظام ضربات البطين8،9، ليس فقط، بل أيضا منها أذينية10،11 . رسم الخرائط المتزامن إمكانيات transmembrane والعابرين Ca2 + مفيدة لفهم الآليات الكامنة لعدم انتظام ضربات القلب فيما يتعلق بفشل القلب وغيرها من أمراض القلب1312،. عند مقارنة أساليب تقييم الكهربية الأخرى، مثل تلك التي تستخدم خلية مفردة أو خلية ورقة، واحدة من المنفعة المطلقة لرسم الخرائط البصرية في قلب perfused هو تقييم نمط التوصيل في الأتريوم سليمة و بطين، ليس فقط من خلال إيقاع الجيوب الأنفية، بل أيضا من خلال الناجمة عن عدم انتظام ضربات القلب14. محاولة لاستغلال موريني القلوب، لا سيما الأتريوم، كبديل البشر قد واجه صعوبة أساسا بسبب صغر حجمها، إلا أن الفأر نموذج تجريبي جذاب من حيث التقييم في الحيوانات المهندسة وراثيا الطراز، وهذه المشكلة يجب التغلب عليها. ويوفر النهج الذي نتبعه اتجاه واحد لحلها.
على الرغم من أن لدينا جهاز رسم الخرائط البصرية مماثلة أساسا للنظام التقليدي لقلوب أسرة مورين15، مزية لدينا طريقة لتقييم اتريوم مورين بإجراء بعض التعديلات عليه. أولاً، نحن السعي للحصول على قرار المكانية والزمانية عالية تصل إلى 0.1 مللي/الإطار و 20 ميكرومتر/بكسل، وهذا التعيين الاستبانة ساهمت في قياس أكثر دقة لنمط السرعة ونشر التوصيل في الأتريوم مورين. وثانيا، لتجنب أي أضرار ميكانيكية لا داعي لها أو امتداد الحديقة الشتوية، التي يمكن أن تغير خصائص الكهربية 16،17، يتم إدراج إبرة نائحين مباشرة في LV لتقليل الضغط داخل الدائرة، بدلاً من إدراجه من خلال لوس أنجليس كما يؤديها في السابق دراسة15. وعلاوة على ذلك، يتم تسليم التحفيز سرعة عن طريق قسطرة قطب مخصصة حجم 1-الفرنسية صنع وضعت في جمهورية أرمينيا، ولكن لا قبل قطب إبرة، التي قد تصيب الأتريوم. يتم تجنب أي دبابيس في تحديد أطرافهم الرجفان، التي استخدمت في الدراسة السابقة15. ثالثا، من حيث تقييم الآلية الأساسية لعدم انتظام ضربات القلب، هو بروتوكول تحفيز مبرمجة لحمل تاتشيارهيثمياس أذينية الحاسمة18،19. نقوم بتحفيز المبرمجة مماثلة لتلك في الدراسات السريرية الكهربية، بما في ذلك سرعة الاندفاع وحتى اكستراستيمولي ثلاثة إضعاف سرعة، مع تعديل الفاصل الزمني سرعة للقلب الماوس. وهكذا، بالإضافة إلى معلمات قياس خط الأساس، يمكن تقييم البروتوكول إيندوسيبيليتي AT. عند الحاجة، ويتم تقييم إيندوسيبيليتي AT مع إدارة isoproterenol أو غيرها من المخدرات. في تجربتنا، تظهر الفئران البرية من نوع لا يكاد أي المنشطات حتى بعد بروتوكول تحفيز كامل. ولذلك، ينبغي إيندوسيبيليتي على معلومات هامة لتقييم مساهمة العديد من الحالات المرضية مثل الطفرات الوراثية، والعمليات الجراحية، وإدارة المخدرات11. يمكن أن يعظم تلك التعديلات تقييم الكهربية الدقيقة في الأتريوم مورين سليمة.
هذا الأسلوب أيضا على بعض القيود. أولاً، استخدام الحد أقصى قرار مكانية مع عدسة هدف X 5، مجال الرؤية (FOV) يقتصر على جزء من الحديقة الشتوية (أي. أطرافهم أذينية الأيسر فقط كما هو مبين في الشكل 2 ألف). للحصول على أكبر فوف من الأتريوم، عدسة هدف 1.6 X هو أحياناً الأفضل (الشكل 2). ثانيا، دون تحديد الأتريوم مع دبابيس، أحياناً من الصعب قياس خصائص التوصيل الرجفان بشكل صحيح، لأنه منحنى على سطح أذينية. لذا، وضعنا زجاج الغطاء على سطحه تسطيح أنه بدلاً من تحديد ذلك بدبابيس. هذا الأسلوب مفيد أيضا لمنع الحركة قطعة أثرية من اهتزازات الحل. ثالثا، مع أسلوبنا، أنه من الصعب جداً الحصول على كامل فوف، لذلك، لاستخدام العرض الأمامي والخلفي بشكل صحيح أكثر أهمية في نهجنا من النهج الأخرى كما هو مبين في الشكل 2. وميزة العرض الأمامي سيكون الملاحظة واضحة لإعادة الإدخال في حالة الظروف المرضية، خاصة في أطرافهم (الشكل 4). من ناحية أخرى، رأي الخلفي يتمتع بميزة الحصول على عرض جيد للجدار الخلفي الرجفان، وقد يكون تسجيل مفصلة لتحريك النشاط من الأكمام احتشاء عضلة القلب. عندما يصعب الحصول على وجهة نظر مناسبة وتسطيح سطحه المنحنى باسلوبنا، يمكن أن تكون ثابتة الأتريوم مع الحد الأدنى من التوتر بدبابيس.
مع أسلوبنا، وهناك 3 مشاكل محتملة، عدم تلطيخ وسرعة، والحث على عدم انتظام ضربات القلب. لفشل تلطيخ، إذا لم يوجد أو يلاحظ fluorescence طفيف، يجب عليك التحقق من ما إذا كان جهاز رسم الخرائط البصرية، يتم تجميعها بشكل صحيح، وما إذا كان الكاشف هو مناسب المخزنة واستخدامها. شرط الحل التروية أيضا حاسمة، التي يمكن أن تؤثر أيضا على الخصائص الكهربية للقلب نفسها، لذا، الشرط للحل بما في ذلك درجة الحموضة، درجة الحرارة، وعما إذا كان هناك تهوية كافية وقد يكون رصدها بدقة. من المهم أيضا تجنب أي انصمام الهواء في القلب. لسرعة الفشل، إذا كانت لا تثير المنبهات سرعة الأتريوم، يجب التحقق الباحثين سواء الأسلاك بشكل صحيح باستخدام اختبار دوائر. عندما يتم بشكل صحيح أنتج المحفزات سرعة، المشكلة هي جهة الاتصال القطب مع الأنسجة. إعادة وضع أقطاب كهربائية يمكن حل المشكلة، والنهج الذي نتبعه باستخدام القسطرة سرعة يجعل من السهل. لصعوبة في عدم انتظام ضربات القلب الاستقراء، يمكن استخدام سرعة RV لتحريض في بعض الحالات المحدودة. استخدام قسطرة قطب كوادريبولار منها قطبين القاصي واقطاب الدانية يمكن أن يقع في RV وجمهورية أرمينيا، على التوالي، من السهل تغيير الموقع سرعة من جمهورية أرمينيا إلى rv. هذه القسطرة مفيد أيضا لتحويل الإثارة البطين عند إشارة تفعيل البطين متزامنة أقنعة إشارة الإثارة أذينية.
وسوف يسهم هذا الأسلوب لتقييم النمط الوراثي-النمط الظاهري التفاعلات في AF المتصلة بالجينات التي وجدت حديثا بدراسات الرواية مثل جوس، خاصة بالنسبة للجينات التي فشل التحقيق تبين لهم بنهج أخرى. مع التقدم في الأجهزة والتقنيات، ويمكن تقييم الخصائص الكهربية للأكمام الوريد الرئوي، وهو مصدر هام للعربية20، في قلب سليمة مع هذا النهج.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل معتمد من قبل البرنامج “تحسين البيئة البحثية” “الباحثين الشبان” من “صناديق تنسيق خاصة” للنهوض بالعلوم والتكنولوجيا (SCF) (أن ت. س.)، ومعونة “البحث العلمي” (رقم 16 ك 09494، ت. س.، رقم 26293052، لامورنا) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) في اليابان. ونحن نقدر براينفيسيون والسيد كينجي تسوبوكورا للمساعدة التقنية، ونحن نقدر أيضا السيد جون مارتن لمساعدته اللغوية.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |