Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii murini che utilizza un sistema di mappatura ottico con un’alta risoluzione temporale e spaziale, tra cui registrazioni duale della tensione della membrana e Ca2 + transitoria sotto programmato stimolazione tramite un catetere elettrodo specializzato.
Recenti studi di associazione genome-wide targeting per la fibrillazione atriale (AF) hanno indicato una forte associazione fra il genotipo ed il fenotipo elettrofisiologico negli atrii. Che ci incoraggia ad utilizzare un modello di topo geneticamente per delucidare il meccanismo di AF. Tuttavia, è difficile valutare le proprietà elettrofisiologiche in atri murini grazie alle loro piccole dimensioni. Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii utilizzando un sistema di mappatura ottico con un’alta risoluzione temporale e spaziale nei cuori murini Langendorff irrorati. Il sistema di mappatura ottico è assemblato con ossido di metallo complementare ad alta velocità dual semiconductor fotocamere e lenti dell’obiettivo ad alto ingrandimento, per rilevare la fluorescenza di un colorante tensione-sensibili e Ca2 + indicatore. Per concentrarsi sulla valutazione degli atrii murini, ottico mapping viene eseguito con una superficie di 2 × 2 mm o 10 mm x 10 mm, con un 100 × 100 ad alta risoluzione (20 µm/pixel o 100 µm/pixel) e frequenza di campionamento fino a 10 kHz (0.1 ms) al massimo. Un elettrodo quadripolar 1-francese dimensioni catetere di stimolazione è collocato nell’atrio destro attraverso la vena cava superiore evitando danni meccanici all’atrio, e la cadenza di stimolazione è trasportata attraverso il catetere. Uno studio elettrofisiologico viene eseguito con stimolazione programmata tra cui cadenza costante, burst pacing e fino a tripla extrastimuli stimolazione. In modo spontaneo o cadenza ritmica, la mappatura ottica registrata la durata del potenziale d’azione, mappa di attivazione, velocità di conduzione e Ca2 + transitoria individualmente negli atri destro e sinistro. Inoltre, la stimolazione programmata determina anche la 270ms dei tachyarrhythmias atriali. Mappatura precisa attivazione viene eseguita per identificare la propagazione dell’eccitazione nell’atrio durante una tachiaritmia atriale indotta. Ottica mapping con un ambiente specializzato consente un’approfondita valutazione elettrofisiologica dell’atrio in modelli murini di patologie.
Il cuore è costituito da 4 camere in mammiferi. Le due camere superiori sono atri e quelle inferiori sono i ventricoli. Ventricoli funzionano come una pompa per espellere sangue alla circolazione sistemica o polmonare. Atri ricevono il sangue che ritorna dalle vene polmonari o sistemiche e assistono al trasporto del sangue nei ventricoli per ottenere una funzione di pompa cardiaca efficiente. Da un aspetto elettrofisiologico, l’importante funzione degli atrii è di regolare il ritmo cardiaco. I segnali elettrici hanno origine dal nodo del seno che si trova alla giunzione fra la vena cava superiore (SVC) e l’atrio destro (RA), quindi propagano il RA e l’atrio sinistro (LA) e conducono al ventricolo attraverso il nodo atrioventricolare e il suo-Purkinje sistema di conduzione.
Aritmia, che sono disturbi del ritmo cardiaco, sono classificate in atriali e ventricolari secondo la loro origine. La fibrillazione atriale (AF) è la forma più comune sostenuta di un’aritmia, caratterizzata da un’eccitazione rapida e casuale degli atrii. Recenti analisi genetiche e studi di associazione genome-wide (GWAS) hanno dimostrato l’associazione tra AF e mutazioni genetiche o monopolymorphisms1,2,3,4. Questi risultati indicano che AF è almeno in parte associato con una causa genetica. Pertanto, è fondamentale per valutare le interazioni genotipo-fenotipo negli atrii utilizzando un modello animale geneticamente. È ampiamente accettato che il mouse è il mammifero più affermato per la modificazione genetica.
La tecnica di mappatura ottico è stata sviluppata per valutare l’eccitazione del tessuto del cuore. Tuttavia, l’osservazione dell’atrio murino da ottico mapping è ostacolata dalla sua dimensione relativamente piccola. Tentiamo di realizzare una valutazione dettagliata dell’atrio murino con un’alta risoluzione temporale e spaziale.
Mappatura ottico è una manovra ben consolidata per studiare l’ elettrofisiologia cardiaca7ed è uno strumento molto utile per valutare non solo le aritmia ventricolari8,9, ma anche quelli atriale10,11 . Simultanea mappatura del potenziale transmembrana e transitori di Ca2 + è utile per comprendere i meccanismi alla base delle aritmie in relazione di infarto e altre malattie di cuore12,13. Quando si confrontano gli altri metodi di valutazione elettrofisiologica, come quelli che usano una singola cella o strato di cellule, uno della superiorità assoluta della mappatura ottico nel cuore irrorato è la valutazione del modello di conduzione nell’atrio intatta e ventricolo, non solo durante il ritmo sinusale, ma anche durante aritmie indotte14. Un tentativo di utilizzare cuori murini, soprattutto l’atrio, come un surrogato degli esseri umani ha incontrato difficoltà principalmente a causa del loro di piccola dimensione, tuttavia, il mouse è un modello sperimentale interessante in termini di valutazione in un animale geneticamente modello e questo problema deve essere superata. Il nostro approccio fornisce una direzione per risolverlo.
Anche se il nostro apparato ottico mappatura era sostanzialmente simile al sistema convenzionale per intero murino cuori15, il nostro metodo ha il vantaggio di valutare l’atrio murino apportando alcune modifiche ad esso. In primo luogo, abbiamo perseguito per ottenere un’elevata risoluzione spaziale e temporale di fino a 0.1 ms/telaio e 20 µm/pixel e questa mappatura ad alta risoluzione ha contribuito a una misura più precisa del modello di velocità e propagazione di conduzione nell’atrio murino. In secondo luogo, per evitare inutili danni meccanici o tratto dell’atrio, che poteva alterare le proprietà elettrofisiologiche 16,17, un interiore dell’ago viene inserito direttamente nel LV per ridurre la pressione intra-alloggiamento, invece di inserirlo attraverso la LA interpretato nel precedente studio15. Inoltre, lo stimolo di stimolazione viene recapitato attraverso un custom made 1-francese dimensioni elettrodo catetere disposto nella RA, ma non da un elettrodo ad ago, che potrebbero ferire l’atrio. I pin sono evitati nel fissare l’annesso atriale, che sono stati usati nel passato Studio15. In terzo luogo, in termini di valutazione del meccanismo sottostante delle aritmie, un protocollo di stimolazione programmate per indurre tachyarrhythmias atriali è cruciale18,19. Eseguiamo identico a quello stimolo programmato negli studi clinici elettrofisiologici, tra cui burst pacing e fino a extrastimuli tripla stimolazione, con una modifica dell’intervallo di stimolazione per il cuore del mouse. Così, oltre ai parametri di misurazione della linea di base, il protocollo potrebbe valutare la 270ms della AT. Quando necessario, 270ms della AT è valutato con l’amministrazione di isoproterenolo o altri farmaci. Nella nostra esperienza, i topi wild-type appena mostrano qualsiasi ATs anche dopo un protocollo di stimolazione completo. Così, il 270ms di AT dovrebbero essere informazioni importanti per valutare il contributo di diverse condizioni patologiche quali mutazioni genetiche, le procedure chirurgiche e la somministrazione di farmaci11. Tali modifiche potrebbero ottimizzare la valutazione elettrofisiologica precisa nell’atrio murino intatto.
Questo metodo ha anche alcune limitazioni. In primo luogo, con una massima risoluzione spaziale con una lente di obiettivo X 5, il campo visivo (FOV) è limitato ad una parte dell’atrio (cioè. solo l’auricola sinistra come mostrato in Figura 2a). Per ottenere il FOV più grande dell’atrio, un obiettivo X 1,6 è a volte preferibile (Figura 2b). In secondo luogo, senza l’atrio di fissaggio con perni, a volte è difficile misurare le proprietà di conduzione atriale correttamente, perché la superficie atriale è curvo. Così, abbiamo messo il vetro di copertura sulla sua superficie per appiattirla invece di risolverlo tramite perni. Questo metodo è anche utile per prevenire artefatto movimento dalle vibrazioni della soluzione. In terzo luogo, con il nostro metodo, è abbastanza difficile ottenere il FOV intero di esso, quindi, di utilizzare correttamente la vista anteriore e posteriore è più importante nel nostro approccio rispetto all’altro approccio, come mostrato nella Figura 2. Il vantaggio della vista anteriore sarebbe la chiara osservazione di rientro in caso di condizioni patologiche, soprattutto nell’annesso (Figura 4). D’altra parte, la vista posteriore ha un vantaggio di ottenere una buona vista della parete atriale posteriore e potrebbe essere una registrazione dettagliata di innescare attività dal manicotto del miocardio. Quando è difficile ottenere una visualizzazione appropriata e per appiattire la sua superficie curva con il nostro metodo, l’atrio può essere fissato con tensione minima di perni.
Con il nostro metodo, ci sono 3 possibili problemi, errore di colorazione, la cadenza e induzione di aritmia. Per errore di colorazione, se nessuna o lieve fluorescenza si osserva, si dovrebbe verificare se l’apparecchiatura di mappatura ottica è montata correttamente, e se il reagente è adeguatamente memorizzato e utilizzato. La condizione della soluzione perfusione è anche cruciale, che può colpire anche le proprietà elettrofisiologiche del cuore stesso, così, la condizione di soluzione incluso il pH, temperatura, e se c’era sufficiente aerazione deve essere strettamente monitorati. È inoltre importante evitare qualsiasi aria gli emboli nel cuore. Per stimolazione fallimento, se gli stimoli pacing non possono eccitare l’atrio, i ricercatori dovrebbero verificare se il cablaggio è corretto con un tester di circuito. Quando gli stimoli pacing outputted correttamente, il problema è il contatto dell’elettrodo con il tessuto. Riposizionamento degli elettrodi in grado di risolvere il problema, e il nostro approccio utilizzando il catetere stimolazione lo rende facile. Per difficoltà nell’induzione di aritmia, RV stimolazione può essere utilizzato per l’induzione di un AT in alcuni casi limitati. Utilizzando un catetere elettrodo quadripolar di cui l’elettrodi prossimali e distali due elettrodi possono trovarsi nel RV e RA, rispettivamente, è facile cambiare il sito di stimolazione da RA per il camper. Questo catetere è inoltre utile per l’eccitazione ventricolare di spostamento quando un segnale di attivazione ventricolare simultanea maschera il segnale di eccitazione atriale.
Questo metodo contribuirà alla valutazione il genotipo-fenotipo interazioni in AF relativi geni trovati di recente dagli studi romanzo come GWAS, soprattutto per i geni con cui l’indagine non è riuscito a mostrare loro di altri approcci. Con il progresso dei dispositivi e delle tecniche, le proprietà elettrofisiologiche del manicotto della vena polmonare, che è la fonte importante di AF20, possono essere valutate nel cuore intatto con questo approccio.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato dal programma per il miglioramento dell’ambiente di ricerca per giovani ricercatori provenienti da fondi speciali di coordinamento per promuovere la scienza e tecnologia (SCF) (per T.S.), localizzativi per la ricerca scientifica (n. 16K 09494, a T.S., n. 26293052, a T.F.) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone. Apprezziamo Brainvision e Mr. Kenji Tsubokura per l’assistenza tecnica, e apprezziamo anche Mr. John Martin per la sua assistenza linguistica.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |