פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר ניצול מערכת מיפוי אופטי עם הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית רזולוציה גבוהה, כולל הקלטות כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + חולף תחת מתוכנת גירוי דרך קטטר אלקטרודה מיוחדת.
מחקרים שנערכו לאחרונה האגודה הגנום כולו מיקוד פרפור פרוזדורים (AF) הראו קשר חזק בין גנוטיפ פנוטיפ אלקטרופיזיולוגיות בתוך אטריה. זה מעודד אותנו לנצל את מודל העכבר מהונדס התירי את המנגנון של AF. עם זאת, קשה להעריך את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר בשל גודלם הקטן. פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה באמצעות מערכת מיפוי אופטי עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה בליבם מאתר Langendorff perfused. מערכת מיפוי אופטי מורכב עם כפולה במהירות גבוהה משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה מצלמות ועדשות בהגדלה אובייקטיבי, כדי לזהות את זריחה של מתח רגיש צבע ו- Ca2 + מחוון. כדי להתמקד ההערכה של אטריה מאתר, מתבצע מיפוי אופטי עם שטח של 2 מ מ × 2 מ מ או 10 מ”מ x 10 מ מ, עם 100 × 100 רזולוציה (20 מיקרומטר לפיקסל או 100 מיקרומטר לפיקסל), קצב הדגימה של עד 10 קילו-הרץ (0.1 ms) מקסימום. אלקטרודה quadripolar גודל 1-צרפתית צועד קטטר ימוקם אטריום ימין דרך הווריד הנבוב הימנעות נזק מכני האטריום, צועד גירוי מועבר דרך הקטטר. המחקר אלקטרופיזיולוגיות מתבצע באמצעות גירוי מתוכנת כולל צועד קבוע, פרץ צועד, ועד extrastimuli טריפל צועד. תחת ספונטני או צועד קצב, המיפוי אופטי הקליט את פוטנציאל הפעולה משך ההפעלה מפה, מהירות הולכה, Ca2 + ארעי בנפרד בתוך אטריה ימין ועל שמאל. בנוסף, גירוי מתוכנת קובע גם את inducibility של tachyarrhythmias פרפור. מיפוי מדויק ההפעלה מתבצעת כדי לזהות המשכיות עירור באטריום במהלך tachyarrhythmia פרפור המושרה. מיפוי אופטי עם סביבה מיוחדים מאפשרת הערכה אלקטרופיזיולוגיות יסודית של האטריום מאתר דגמים פתולוגיים.
הלב מורכב 4 תאי יונקים. שני התאים העליונה הינם אטריה, התחתונות נמצאות החדרים. החדרים לעבוד משאבה כדי להוציא דם מחזור הדם מערכתית או ריאתי. אטריה לקבל דם שחזר מן הורידים מערכתית או ריאתי, ולסייע בהעברת דם לתוך מתגלה כדי לקבל תפקיד משאבת הלב יעיל. מתוך היבט אלקטרופיזיולוגיות, הפונקציה העיקרית אטריה היא לווסת את קצב הלב. האותות החשמליים מקורן הצומת סינוס ממוקם בצומת בין הווריד הנבוב העליון (SVC) לבין העלייה הימנית (RA), ולאחר מכן להפיץ את רא, אטריום שמאל (LA), לנהל את הנוזלים דרך צומת atrioventricular שלו-Purkinje מערכת הולכה.
הפרעות בקצב הלב, אשר הפרעות קצב בלב, מסווגים לתוך חדרית על פי מוצאם, פרפור. פרפור פרוזדורים (AF) היא הצורה הנפוצה ביותר מתמשכת של הפרעה בקצב הלב, המאופיינת על ידי עירור אקראי ומהיר של אטריה. ניתוח גנטי האחרונות ולימודי הגנום כולו האגודה (GWAS) הראו את הקשר בין AF, מוטציות גנטיות או3,2,1,monopolymorphisms4. ממצאים אלה מצביעים על ש-AF משויכת לפחות חלקית הגורם הגנטי. לכן, חיוני כדי להעריך את האינטראקציות גנוטיפ-פנוטיפ אטריה באמצעות מודל בעלי חיים מהונדס. מקובל כי העכבר הוא היונק ביותר על ההנדסה הגנטית.
הטכניקה אופטי מיפוי פותחה כדי להעריך את עירור של רקמת הלב. עם זאת, התבוננות האטריום מאתר על ידי מיפוי אופטי היא הקשו על ידי גודלו הקטן יחסית. אנו מנסים להשיג הערכה מפורטת של האטריום מאתר עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה.
מיפוי אופטי הוא תרגיל ומבוססת ללמוד את הלב אלקטרופיזיולוגיה7, הוא כלי שימושי למדי להעריך לא רק להפרעה8,9, אלא גם אלה פרפור10,11 . מיפוי סימולטני של פוטנציאל transmembrane ו- Ca2 + שנחשולי שימושי להבנת המנגנון הבסיסי של הפרעות קצב ביחס אי ספיקת לב, מחלות לב אחרות,12,13. כאשר משווים את אלקטרופיזיולוגיות להערכת שיטות אחרות, כגון אלה באמצעות תא בודד או גיליון תא, אחד דברים מוחלטים של מיפוי אופטי בלב perfused הוא ההערכה של התבנית הולכה בפרוזדור ללא פגע, החדר, לא רק במהלך קצב סינוס, אלא גם במהלך induced הפרעות קצב14. ניסיון לנצל מאתר לבבות, במיוחד האטריום, בתור פונדקאית של בני אדם נתקל בקשיים בעיקר בשל גודלם הקטן, עם זאת, העכבר הוא מדגם ניסיוני אטרקטיבי מבחינת ההערכה של חיים מהונדס מודל, בעיה זו להכריעו. הגישה שלנו מספק דיירקשן לפתור אותה.
למרות מכשיר אופטי מיפוי שלנו היה בעיקרון דומה למערכת קונבנציונליים עבור כל מאתר לבבות15, השיטה שלנו יש את היתרון של הערכת האטריום מאתר על ידי ביצוע מספר שינויים אליו. ראשית, אנחנו רדף להשיג רזולוציה יכולות גבוהה של עד 0.1 ms/מסגרת 20 מיקרומטר לפיקסל ואת מיפוי ברזולוציה גבוהה זה תרם מדידה מדויקת יותר של דפוס מהירות והתפשטות של הולכה בפרוזדור מאתר. שנית, כדי למנוע פגיעה מכנית מיותרת או מתיחה של האטריום, אשר יכול לשנות מאפייני אלקטרופיזיולוגיות 16,17, שכנה המחט מוחדרת ישירות לתוך בעירוי כדי להפחית את הלחץ אינטרה-הקאמרית, במקום להכניס את זה דרך לה כפי שבוצע הקודם לומדים15. יתר על כן, הגירוי pacing מועבר דרך קטטר אלקטרודה גודל מותאם אישית 1-צרפתית עשוי להציב את רא, אבל לא על ידי אלקטרודה המחט, אשר עלול לפגוע האטריום. סיכות נחסכים בתיקון הפרוזדור, אשר שימשו את לימוד העבר15. שלישית, מבחינת ההערכה של המנגנון הבסיסי של הפרעות בקצב הלב, פרוטוקול גירוי מתוכנת לזירוז tachyarrhythmias פרוזדורים הוא מכריע18,19. אנו מבצעים זהה לזו מתוכנת גירוי במחקרים קליניים אלקטרופיזיולוגיות, כולל פרץ צועד ועד extrastimuli טריפל צועד, עם שינוי של מרווח הזמן pacing ללב העכבר. לכן, בנוסף הפרמטרים מידה בסיסית, הפרוטוקול יכול להעריך את inducibility של AT. בעת הצורך, inducibility של AT שקובעת עם הממשל של isoproterenol או תרופות אחרות. מניסיוננו, העכברים פראי-סוג בקושי מופיעים כל ATs גם לאחר פרוטוקול גירוי מלאה. לפיכך, inducibility של AT צריך להיות מידע חשוב להערכת התרומה של מספר תנאים פתולוגיים כגון מוטציות גנטיות, ניתוחים הממשל של סמים11. שינויים אלה יכול למטב את ההערכה אלקטרופיזיולוגיות מדויק באטריום מאתר ללא פגע.
בשיטה זו יש גם מספר מגבלות. ראשית, שימוש ברזולוציה המרחבית מקסימלית עם עדשה המטרה X 5, שדה הראייה (FOV) מוגבל לחלק של האטריום (כלומר. רק שמאלה הפרוזדור כמו באיור איור 2a). עבור קבלת של FOV גדול יותר של האטריום, עדשה המטרה X 1.6 הוא לפעמים עדיפה (איור 2b). שנית, מבלי לתקן את האטריום עם סיכות, לפעמים קשה למדוד את המאפיינים הולכה פרפור כראוי, כי השטח פרפור עקום. אז, אנחנו במקום הזכוכית המכסה על המשטח לשטח זה במקום לתקן אותה על-ידי סיכות. שיטה זו היא גם מועיל למניעת תנועה חפץ מן התנודות של הפתרון. שלישית, בשיטה שלנו, זה די קשה להשיג את FOV כולו, אז להשתמש התצוגה anterior ואת אחורי כראוי חשוב יותר בגישה שלנו יותר בגישה אחרת כפי שמוצג באיור2. היתרון של התצוגה הקדמי יהיה ברור התבוננות לאטמוספרה במקרה של מצבים פתולוגיים, במיוחד התוספתן (איור 4). מצד שני, הנוף האחורי יש יתרון של קבלת תצוגה טובה של הקיר האחורי פרפור, וייתכן הקלטה מפורטת של מפעילה פעילות מן השרוול שריר הלב. כאשר קשה להשיג קובץ תצוגה מתאים, לשטח פני השטח שלו מעוקל עם השיטה שלנו, ניתן לתקן את האטריום עם המתח מינימלי באמצעות סיכות.
בשיטה שלנו, יש 3 בעיות אפשריות, כשל של צביעת, צועד בקצב הלב אינדוקציה. לכישלון של צביעת, אם אין או קרינה פלואורסצנטית קלה הוא ציין, אתה צריך לבדוק האם המנגנון מיפוי אופטי מורכב כראוי, וה -אם הכימית כראוי המאוחסנים בשימוש. התנאי של הפתרון זלוף הוא גם חיוני, אשר יכולים להשפיע גם את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של הלב עצמו, אז המצב של פתרון כולל את ה-pH, טמפרטורה, ויש במציאותם לערבב מספיק להיות במעקב בלבד. חשוב גם להימנע מכל תסחיף אוויר בלב. עבור צועד כשל, אם הגירויים pacing לא יכול לרגש האטריום, חוקרים צריך לבדוק אם החיווט הנכון באמצעות כבודק במעגל. כאשר הגירויים pacing הם outputted כראוי, הבעיה היא הקשר של האלקטרודה עם הרקמה. מיקום מחדש של האלקטרודות ניתן לפתור את הבעיה, הגישה שלנו בעזרת הצנתר pacing מקלה. על הקושי אינדוקציה בקצב הלב, RV צועד יכול לשמש את אינדוקציה של AT במקרים מסוימים המוגבלת. באמצעות צנתר אלקטרודה quadripolar אשר דיסטלי שתי אלקטרודות ואלקטרודות proximal עשויה להימצא ב RV ו רא, בהתאמה, זה קל לשנות את האתר pacing מרה בקרוואן קטטר זה שימושי גם הסטה של עירור חדרית כאשר אות הפעלה בו-זמנית חדרית מסכות האות עירור פרפור.
שיטה זו תורמת כדי לבדוק את ה-גנוטיפ פנוטיפ באינטראקציה AF הקשורים גנים נמצאו לאחרונה על ידי מחקרים חדשניים כגון GWAS, במיוחד על הגנים אשר החקירה נכשל להראות להם על ידי גישות אחרות. עם ההתקדמות של מכשירים וטכניקות, המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של השרוול וריד ריאתי, אשר הוא מקור חשוב של AF20, יכול להיות מוערך בלב שלם עם גישה זו.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמך על ידי התוכנית עבור שיפור של סביבת מחקר לחוקרים צעירים מקרנות תיאום מיוחד לקידום המדע, הטכנולוגיה (SCF) (ל ט. ס), Grants-in-Aid למחקר מדעי (מס 16K. 09494, ל ט. ס, מספר 26293052, אל. טי) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT) של יפן. אנו מעריכים Brainvision ואת מר קנג’י Tsubokura לסיוע טכני, אנחנו מעריכים גם מר ג’ון מרטין לסיוע הלשוני שלו.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |