Summary
Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.
Abstract
Recentes estudos de associação de genoma-largo visando a fibrilação atrial (FA) têm indicado uma forte associação entre o genótipo e fenótipo eletrofisiológico nas aurículas. Que nos encoraja a utilizar um modelo de rato geneticamente modificado para elucidar o mecanismo de AF. No entanto, é difícil avaliar as propriedades eletrofisiológicas em átrios murino devido ao seu pequeno tamanho. Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios usando um sistema de mapeamento óptico com uma alta resolução temporal e espacial em corações murino Langendorff perfundido. O sistema óptico de mapeamento é montado com dupla de alta velocidade complementares de óxido metálico semicondutor câmeras e lentes objetivas de alta magnificação, para detectar a fluorescência de uma tensão sensível corante e indicador de Ca2 + . Para focalizar a avaliação dos átrios murino, mapeamento óptico é realizado com uma área de 2 mm × 2 mm ou 10 mm x 10 mm, com 100 × 100 resolução (20 µm/pixel ou 100 µm/pixel) e taxa de amostragem de até 10 kHz (0,1 ms) no máximo. Um eletrodo de tamanho 1-francês transvenosos estimulação cateter é colocado no átrio direito através da veia cava superior, evitando qualquer dano mecânico para o átrio, e estimulação de estimulação é entregue através do cateter. Um estudo eletrofisiológico é realizado com estimulação programada, incluindo a estimulação constante, estourou o marca-passo e até extrastimuli triplo de estimulação. Com uma espontânea ou ritmo de estimulação, o mapeamento óptico gravou a duração do potencial de ação, mapa de ativação, velocidade de condução e Ca2 + transitória individualmente nas aurículas direita e esquerdas. Além disso, a estimulação programada também determina o inducibility de taquiarritmias atrial. Mapeamento de ativação precisa é realizado para identificar a propagação de excitação no átrio durante uma taquiarritmia atrial induzida. Mapeamento de óptico com uma configuração especializada permite uma avaliação eletrofisiológica minuciosa do átrio em modelos patológicos murino.
Introduction
O coração é composto por 4 câmaras em mamíferos. As duas câmaras superiores são átrios e as inferiores são ventrículos. Ventrículos funcionam como uma bomba para ejetar o sangue para a circulação sistêmica ou pulmonar. Átrios recebem sangue retornando das veias pulmonares ou sistêmicas e auxiliar no transporte de sangue para os ventrículos para obter uma função de bomba cardíaca eficiente. De um aspecto eletrofisiológico, a importante função dos átrios é para regular o ritmo cardíaco. Os sinais elétricos se originam a partir do nó sinusal localizado na junção entre a veia cava superior (SVC) e o átrio direito (RA), então se propague para o RA e o átrio esquerdo (LA) e conduzir para o ventrículo através do nó atrioventricular e His-Purkinje sistema de condução.
Arritmias, que são perturbações do ritmo cardíaco, são classificadas em atrial e ventricular de acordo com sua origem. Fibrilação atrial (FA) é a forma mais comum de sustentada de uma arritmia, caracterizada por uma excitação rápida e aleatória dos átrios. Análises genéticas recentes e estudos de associação de genoma-larga (GWAS) demonstraram a associação entre AF e mutações genéticas ou monopolymorphisms1,2,3,4. Estes resultados indicam que o AF é pelo menos parcialmente associado com uma causa genética. Portanto, é fundamental para avaliar as interações genótipo-fenótipo nas aurículas usando um modelo animal geneticamente modificadas. É amplamente aceito que o mouse é o mamífero mais estabelecido por modificação genética.
A técnica de mapeamento óptico foi desenvolvida para avaliar a excitação do tecido cardíaco. No entanto, a observação do átrio murino pelo mapeamento óptico é dificultada pelo seu tamanho relativamente pequeno. Tentamos alcançar uma avaliação detalhada do átrio murino com alta resolução temporal e espacial.
Protocol
Este experimento animal foi aprovado e realizado nos termos do Regulamento do cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Tóquio médica e Dental University.
1. preparação
- Soluções conservadas em estoque
- Dissolver os corantes sensíveis à voltagem (di-4-ANEPPS e RH237) e o indicador de Ca2 + (Rhod-2 m) com 100% de Dimetilsulfóxido (DMSO) tornar as soluções com concentrações de 6 mM, 10 mM e 10 mM, respectivamente.
- Dissolva o desacoplador de excitação-contração (E-C), blebbistatin, com 90% DMSO tornar-se uma solução estoque de 50 mM.
- Alíquota as soluções estoque em um 0,2 mL do PCR do tubo em um quarto escuro, em substituir o ar no tubo de estoque usando gás nitrogênio para evitar a oxidação.
- Embrulhe os tubos de ações em papel alumínio individualmente para proteção contra a luz e armazená-los no-20 ˚ c.
- Soluções de trabalho
- Preparar 1 L de solução salina tamponada fosfato (PBS) sem Ca2 + (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4e 1,5 mM KH2PO4, pH 7,40 ajustado pelo NaOH)
- Prepare 1 L de solução de Tyrode (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glicose e 5,0 mM HEPES, pH 7,40 ajustado pelo NaOH).
- Filtrar a solução de Tyrode com uma garrafa de 0,22 µm filtro superior e ventile-o bem por aeração bolha usando uma pedra de ar ligada a um cilindro de gás de2 O.
2. óptico mapeamento em corações de Langendorff-perfundidos
- Montar o sistema óptico de mapeamento usando duas câmeras de complementares de óxido metálico semicondutor (CMOS) (Figura 1ae b)
- Monte as câmeras CMOS, divisor de feixe, lentes objetivas, revólver de lente, fonte de luz, espelhos dicroicos, filtros e outras peças para o sistema de mapeamento óptico como mostrado na Figura 1a& b.
- Selecione a ampliação, alterando a lente objetiva em uma torre, equipada com diferentes ampliações (1.6 X e 5. X).
Nota: O tamanho do sensor CMOS é 10 mm × 10 mm, com uma resolução de 100 × 100, o que significa que, com 5 X da lente objetiva, este sistema fornece uma resolução espacial de 20 µm. - Definir a luz de excitação usando uma lâmpada do diodo emissor de luz (LED) com comprimento de onda de centro de 530 nm, passada por um filtro passa-banda (520/35 nm) e reflecte-se com um espelho dicroico (560 nm).
- Gravar o sinal de emissão dividido por um divisor (665 nm), no qual câmera de configuração 1 com um longo passe filtro (697/75 nm) detecta a fluorescência usando um corante de sensíveis à tensão de membrana (di 4-ANEPPS ou RH237) e câmera de 2 com um filtro passa-banda (572/28 nm) detecta a sinal do indicador de Ca2 + (Rhod2-AM).
- Montar o circuito de perfusão de Langendorff
- Anexe tubos de policloreto de vinila (PVC) para uma bomba peristáltica.
- Coloque o lado de entrada do tubo PVC em solução de Tyrode ventilada com 100% O2 como mencionado na etapa 1.2.3.
- Conecte o lado de descarga do tubo PVC para uma armadilha de ar feitos à mão, em seguida, organizar a 5 µm filtro, torneiras de três vias, transdutor de pressão, aquecimento bobina de vidro e 21 embotada agulha (o tamanho de agulha é mutável de acordo com o tamanho da aorta) sequencialmente , usando outros tubos de PVC.
- Encher o circuito de perfusão com solução de Tyrode, evitando quaisquer bolhas de ar no circuito e parar o fluxo até que o coração está ligado ao circuito.
- Heparinização e anestesia
- Injete heparina unfractionated (200 IU, independentemente do peso de corpo) intraperitonealmente em um mouse usando uma agulha de calibre 25 e seringa de 1 mL.
- Anestesia o mouse por uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (65mg/kg) 10 min após a injeção de heparina.
- Canulação e perfusão
- Posicione o mouse na posição supina. Confirme animais é anestesiados pela falta de resposta aos pés pitada. Abra a parede abdominal abaixo do nível do processo xifoide com uma tesoura. Fazer uma incisão transversa no diafragma, corte ambos os lados das costelas na linha axilar medial, sem nenhum dano ao coração e a parede torácica anterior da aleta para cima. Avançar a pinça curva atrás do coração e mantenha a aorta descendente, esôfago e veia cava inferior. Em seguida, impostos especiais de consumo o coração com uma tesoura rapidamente, juntamente com os vasos sanguíneos e tecidos, tais como a aorta, pulmões, traqueia, esôfago, tecidos adiposo e Timo.
- Lave o coração com 10 mL de PBS gelado em um prato de petri e remover o tecido adjacente.
- Introduzir a ponta da agulha calibre 21 embotada ligada ao circuito de perfusão em aorta ascendente e corrigi-lo com segmento sob um estereomicroscópio.
- Começa a perfundir o coração por 10 min com solução de Tyrode ventilada com 100% O2.
- Monitore continuamente a pressão de perfusão com transdutor de pressão conectado ao amplificador e registrador.
- Manter a pressão de perfusão entre 80-100 mmHg (geralmente correspondente a 2-5 mL/min para a taxa de fluxo) durante todas as etapas a seguir.
- Durante a perfusão inicial (etapa 2.4.4.), insira o tubo fino de polietileno (PE) (diâmetro exterior: 0,8 mm) para o SVC e corrigi-lo com um fio. Em seguida, coloque o coração na câmara de vidro aquecido (Figura 1b& c).
- Perfurar com uma agulha permanência 24 (diâmetro exterior: 0,7 mm) para a cavidade ventricular esquerda de (LV) através do ápice ventricular para evitar danos à aurícula e remova a agulha interna deixando a cânula externa na LV.
- Introduzir um cateter de eletrodo 1-francês tamanho personalizado feito através do tubo de PE no SVC para realizar a estimulação elétrica no RA. Se necessário, avance o cateter no ventrículo direito (RV) para estimulação ventricular.
- Insira um eletrodo de pin no ápice ventricular para gravar continuamente as bipolares eletrocardiogramas (ECG) entre a agulha de pino eletrodo e canulação da aorta ascendente (Figura 1C).
- Continue a acompanhar o ECG e perfusão pressão ao longo do estudo inteiro.
- Apague a luz e realizar o seguinte experimento em um quarto escuro.
- Vá para a etapa 2.5. para uma única gravação da tensão de membrana ou 2.6. para uma gravação dual da voltagem da membrana e transientes de Ca2 + .
- Coloração para uma única gravação da tensão da membrana
- Manter a solução de perfusão aquecida a 37 ˚ c durante este protocolo de coloração para uma única gravação da tensão da membrana.
- Dilua a 8,3 µ l da solução-mãe di-4-ANEPPS (6 mM) com 10 mL de solução de Tyrode (a concentração final é de 5 µM).
- Infundi o volume total (10 mL) da solução diluída di-4-ANEPPS no coração através da rota de perfusão para 2-5 min, seguido por uma lavagem com solução de Tyrode por 5 min.
- Dilua 5 µ l de solução-mãe blebbistatin (50mm) com 1mL de solução de Tyrode (a concentração final é 250 µM).
- Administre o montante total da solução diluída de blebbistatin através da rota de perfusão.
- Ignore o passo 2.6 e avance para o passo 2.7 para desbotar.
- Coloração para uma gravação dual da voltagem da membrana e transientes de Ca2 +
- Manter a solução de Tyrode à temperatura ambiente.
Nota: Esta definição inicial da temperatura é diferente de coloração para uma única gravação da tensão da membrana (etapa 2.5.). - Administre o blebbistatin da mesma maneira como em passos 2.5.4 e 2.5.5.
- Mix 3 µ l de solução-mãe de Rhod2AM (10 mM) e 30 µ l de polioxietileno-polioxipropileno copolímero F-127 (20% em DMSO) em bloco e, em seguida, diluir a mistura com 10 mL de solução de Tyrode.
- Carregar a quantidade total de solução de Rhod2AM (3 µM) mais de 2-5 min, via a mesma rota que o blebbistatin.
- Dilua 7 µ l de solução-mãe de RH237 (10 mM) com 10 mL de solução de Tyrode.
- Administrar a quantidade total de RH237 solução diluída (7 µM) mais de 2-5 min.
- Após a conclusão do procedimento acima, começam a aquecer a solução de Tyrode em 37 ˚ c.
- Manter a solução de Tyrode à temperatura ambiente.
- Esmaecimento
- Mantenha a temperatura da solução de Tyrode 37 ˚ c no experimento seguinte.
- Perfundir o coração com solução de Tyrode pelo menos 5 min lavar as tinturas excessivas.
Nota: Não há nenhuma necessidade de aumentar a taxa de fluxo durante esta lavagem passo (consulte a etapa 2.4.6.) - Confirme o desaparecimento de qualquer artefato de movimento devido as contrações e a coloração homogénea no coração perfundido.
- Amostragem e análise de dados
- Coloque o tampa de vidro (25 mm × 60 mm) sobre o coração perfundido cuidadosamente, para achatar a superfície atrial sem muito estresse mecânico e evitar o artefato de movimento de vibração da solução. Confirme que o atrium anexa ao vidro tampa apropriadamente.
- Recorde a fluorescência pelas câmeras CMOS com uma amostragem taxa até 0,1 ms para di 4-ANEPPS e 1 ms para o RH237 e Rhod2AM de coloração.
- Analise as gravações obtidas usando o software de análise, de acordo com as instruções do fabricante para a operação real do software.
- Crie um mapa de ativação e o filme depois de extrair a região de interesse, remoção de deriva, filtragem temporal e binning53 X 3.
3. eletrofisiológico estudo
- Configuração de eletrodos de estimulação e estimulador
- Confirmar o contato da ponta do eletrodo estimulação sob medida na RA no tecido para estimulação (consulte a etapa 2.4.9.).
- Entrega tudo estimulação estímulos do cateter guia ligado ao estimulador programável.
- Determinação do limiar estimulação
- Conjunto o ritmo intervalo entre 100 e 150 ms (largura de pulso de 0,4 ms), evitando qualquer ritmo intrínseco, ultrapassando a taxa de estimulação.
- Entrega a estimulação de estimulação constante pelo menos 20 batimentos obter uma estimulação atrial estável.
- Definir o ritmo saída em 5 mV, reduzi-la gradualmente até a falha de estimulação entregue para despolarizar o átrio.
- Confirme a excitação atrial pela presença de ondas P no ECG, e/ou um sinal de excitação atrial a gravação óptica.
- Determine o mínimo de estimulação de saída que é capaz de despolarizar o átrio como o limiar de estimulação.
- Defina a saída de estimulação para os estudos a seguir duas vezes no limiar de estimulação.
- Constante e o ritmo de explosão
- Entregar a estimulação constante para 99 batidas, com um intervalo de marca-passo, começando com 150 ms, ou o intervalo mais longo que evita ultrapassando o ritmo intrínseco.
- Reduza o intervalo de estimulação progressivamente com passos de 5 ms, até 40 ms ou até atingir o intervalo que falha ao obter a captura de 1:1 do átrio.
- Único extrastimulus estimulação
- Defina a duração do ciclo estimulação da unidade básica (S1) para 120 ms 100 ms e ms 80 a menos que o ritmo intrínseco supera a unidade básica ou a falha de estimulação para obter excitação atrial 1:1.
- Defina o número de estímulos para 10 batidas para o trem de unidade básica de estimulação.
- Defina o primeiro extrastimulus (S2) para ms-10 para o comprimento do ciclo básico.
- Entrega S2 após o último estímulo estimulação da unidade básica.
- Encurte o intervalo de acoplamento de S2 progressivamente com passos de 5 ms, até o S2 falhar despolarizar o átrio.
- Determine o período refratário efetivo (ERP) como o maior intervalo de S2 falha para despolarizar o átrio.
- Avalie o ERP pelo menos 3 comprimentos diferentes ciclo básico para avaliar a adaptação da taxa do ERP.
- Extrastimuli duplo e triplo, estimulação para induzir taquiarritmias atrial
- Redefina o intervalo de S2 a um ponto 20 ms fora o ERP de S2 se não arritmias são observadas.
- Adicione uma segunda extrastimulus (S3), começando com o mesmo intervalo como S2.
- Diminua o intervalo de acoplamento entre S2 e S3 progressivamente com passos de 5 ms até S3 falhar despolarizar o átrio.
- Redefinir o intervalo de S2 de um ponto de 10 ms fora do ERP e, em seguida, repita a etapa 3.5.3.
- Redefina os intervalos de S2 e S3 para pontos 20 ms fora cada ERP.
- Adicione um terceiro extrastimulus (S4), começando com o mesmo intervalo como S3.
- Diminua o intervalo de acoplamento entre S3 e S4 progressivamente com passos de 5 ms até S4 falhar despolarizar o átrio.
- Redefinir o intervalo S3 de um ponto de 10 ms fora do ERP e, em seguida, repita a etapa 3.5.7.
- Redefinir os intervalos de S2 e S3 para pontos 10 ms fora do ERP e, em seguida, repita a etapa 3.5.7.
- Defina o inducibility de taquiarritmias atrial por indução pode ser reproduzida usando estímulos programados da mesma forma.
- Avaliação do inducibility de taquiarritmias atrial
- Grave continuamente o ECG durante todos os protocolos de estimulação (passo 3.3-3.5.).
- Realize gravações ópticas durante e após cada estímulo, para gravar a indução de taquicardia atrial (AT) ou resposta atrial repetitiva (RAR).
- Confirme a reprodutibilidade aplicando o mesmo protocolo de estimulação quando AF ou um RAR é induzida.
Representative Results
Os experimentos de óptica de mapeamento são executados usando os dispositivos, conforme mostrado na Figura 1a. O esquema do sistema óptico é ilustrado na Figura 1b. O sistema fornece uma análise de alta resolução do potencial de membrana e Ca2 + transitória no átrio.
Conforme representado na Figura 1 c e d, o coração isolado é posicionado em uma câmara de temperatura controlada. Um cateter de eletrodo de tamanho 1-francês é colocado na RA através de um tubo de PE inserido o SVC, e outro tubo de PE de permanência é inserido na cavidade do LV a partir do ápice de LV para evitar pressão excessiva sobre a câmara do coração. Para uma gravação simultânea de ECG, o cátodo (chumbo ECG [-]) é conectado à agulha de punção, e o ânodo (ponta de ECG [+]) é ligado ao eléctrodo de pinos inserido no ápice ventricular. A característica desta assembleia é evitar danos mecânicos dos átrios.
Para a avaliação da tensão da membrana, fluorescência usando di-4-ANEPPS é gravada com até uma taxa de 10.000 quadros/s de amostragem (Figura 2). O mapa de ativação é obtido durante a estimulação constante libertou o RA. O mapeamento fino permite a análise do padrão de condução detalhadas em pequenos átrios murino.
A Figura 3 ilustra traços representativos das tensões de membrana e Ca2 + transitória no LA usando RH237 e Rhod2AM durante a estimulação constante do Ra. Podemos reduzir a taxa de amostragem do mapeamento de 1000 quadros/s para obter uma relação sinal/ruído suficiente do sinal Rhod2AM com a configuração actual. No entanto, o sistema fornece uma qualidade suficiente para analisar a relação entre o potencial de ação e Ca2 + transitória.
Em seguida, executamos uma indução de uma taquiarritmia atrial com estimulação programada usando ratos sob uma condição patológica. A Figura 4 apresenta uma gravação óptica de um induzido AT em um átrio de murino manchado com di-4-ANEPPS. O mouse passa por um procedimento de constrição da aorta transversa para aplicar uma sobrecarga de pressão para o átrio, 10 dias antes do experimento6. Podemos induzir AT pelo triplo extrastimuli estimulação (120/100/100/80) e observar a propagação do circuito reentrante.
Figura 1. Sistema óptico mapeamento. r. Assembleia Geral do sistema de mapeamento de eletrofisiologia/óptico. b. esquema da composição do sistema de mapeamento de óptica: A seta azul indica a excitação luz gerada pela fonte de luz. A lente objetiva pode ser trocada com a torre. A luz emitida do coração manchado é dividida entre a câmera 1 e câmera 2. Câmera 1 detecta os sinais de longo comprimento de onda para a tensão de membrana, e câmera 2 registra os comprimentos de onda com um filtro passa-banda de 580 ± 20 nm para o transiente de Ca2 + . Durante o procedimento, a pressão de ECG e perfusão registam-se continuamente, e o sinal de ECG também é simultaneamente importado para o mapa de óptico software de gravação. c. preparação dos corações isolados: os corações são canulados com uma agulha cega através da aorta ascendente para perfusão. Para gravações simultâneas de ECG, o cátodo é ligado para a agulha de punção, e o ânodo com o eletrodo de pino é inserido no ápice ventricular. d. tubo de canulação e os eletrodos: O coração é canulado com uma agulha de calibre 21 cega para perfusão (agulha de punção). Um tamanho de 1-francês estimulando eletrodo (eletrodo) é colocado no átrio direito através de um tubo de polietileno inserido na veia cava superior. A câmara de vidro é aquecida a 37 ˚ c por água aquecida circula na cavidade da câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Mapa de ativação na aurícula. r. mapas de ativação representativa na vista anterior com uma objectiva de 5 X e b. na vista posterior com um 1.6 X da lente objetiva. (Painel da esquerda) Diagrama esquemático do coração isolada e átrio. (Painel direito) Mapa de ativação do átrio esquerdo obtidos com di-4-ANEPPS, manchando a 10.000 quadros/s. A gravação é executada sob um ritmo constante com o estimulante eletrodo colocado no átrio direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Gravação dual do potencial de ação e Ca2 + transitório na aurícula esquerda. r. esquemático do coração isolado. b. imagem representativa da intensidade da fluorescência na aurícula esquerda, usando o RH237 para a tensão de membrana (Vm) e Rhod2AM para o transiente de Ca2 + . A gravação é realizada com uma lente de objetiva X 5 em 1.000 frames/s. c. Gravação simultânea do ECG (topo), sinal de RH237 (médio) e sinal de Rhod2AM (baixo), durante a estimulação constante com o eletrodo de estimulação na aurícula direita. As setas pretas indicam a estimulação de pontos e setas amarelas a excitação ventricular. Um efeito de espalhamento de luz do ventrículo também pode ser observado (setas amarelas) tanto no sinal de RH237 e Rhod2AM. m. mesclado RH237 e Rhod2AM traço. O potencial de ação e transientes de Ca2 + mudanças são registradas simultaneamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Mapeamento de ativação durante taquicardia atrial. (Painel da esquerda) Diagrama esquemático do coração isolado. (Painel do meio) Mapa de ativação durante uma taquicardia atrial (AT). AT foi induzido pelo ritmo triplo extrastimuli entregues a partir do átrio direito. (Painel direito) Mapa de ativação durante o ritmo sinusal no mesmo coração de rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme complementar 1. Filme representativo da membrana potencial no átrio usando coloração com di-4-ANEPPS. Clique aqui para baixar este arquivo.
Filme complementar 2. Filmes representativos do mapeamento de ativação durante o ritmo sinusal e taquicardia atrial. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Mapeamento de óptico é uma manobra bem estabelecida para estudar a eletrofisiologia cardíaca,7e é uma ferramenta bastante útil para avaliar não só arritmias ventriculares8,9, mas também atrial10,11 . Mapeamento simultâneo do potencial transmembrana e transientes de Ca2 + é útil para compreender os mecanismos subjacentes de arritmias em relação à insuficiência cardíaca e outras doenças cardíacas12,13. Ao comparar os outros métodos de avaliação eletrofisiológica, como aqueles que usam uma única célula ou camada de células, dentre as superioridades absolutas de mapeamento óptico no coração perfundido é a avaliação do padrão de condução no átrio intacto e ventrículo, não só durante o ritmo sinusal, mas também durante as arritmias induzidas14. Uma tentativa de utilizar corações murino, especialmente o átrio, como um substituto dos seres humanos tem encontrado dificuldade principalmente devido ao seu pequeno tamanho, porém, o mouse é um modelo experimental atraente em termos de avaliação em um animal geneticamente modificado modelo e este problema devem ser superado. Nossa abordagem fornece uma direção para resolvê-lo.
Embora nosso aparelho óptico mapeamento foi basicamente semelhante do sistema convencional para corações toda murino15, nosso método tem a vantagem de avaliar o átrio murino fazendo algumas modificações para ele. Primeiro, seguimos para obter uma alta resolução espacial e temporal de até 0.1 ms/frame e 20 µm/pixel e esse mapeamento de alta resolução, contribuído para uma medição mais precisa, o padrão de velocidade e propagação de condução no átrio murino. Em segundo lugar, para evitar danos mecânicos desnecessários ou estiramento do átrio, que poderia alterar as propriedades eletrofisiológicas 16,17, uma permanência agulha é inserida diretamente a LV para reduzir a pressão intracâmara, em vez de inseri-la através do LA como realizado em anterior estudo15. Além disso, o estímulo de estimulação é entregue através de um cateter de tamanho 1-francês feito eletrodo colocado na RA, mas não por um eletrodo de agulha, que pode ferir o átrio. Os pinos são evitados na fixação do apêndice atrial, que foram utilizados no estudo passado15. Em terceiro lugar, em termos de avaliação do mecanismo subjacente das arritmias, um protocolo de estimulação programada para induzir taquiarritmias atrial é crucial18,19. Realizamos estimulação programada idêntico em Estudos eletrofisiológicos clínicos, incluindo a explosão de estimulação e até triplo extrastimuli ritmo, com uma modificação do intervalo de estimulação para o coração de rato. Assim, além dos parâmetros de medição da linha de base, o protocolo poderia avaliar o inducibility de AT. Quando necessário, o inducibility do AT é avaliada com a administração de isoproterenol ou outras drogas. Em nossa experiência, os ratos do selvagem-tipo quase não mostram qualquer ATs mesmo após um protocolo de estimulação completa. Assim, o inducibility de AT deve ser uma informação importante para avaliar a contribuição de diversas condições patológicas, tais como mutações genéticas, procedimentos cirúrgicos e a administração de drogas11. Essas modificações podem otimizar a avaliação eletrofisiológica precisa na aurícula murino intacta.
Esse método também tem algumas limitações. Primeiro, usando uma resolução espacial máxima com um 5 X da lente objetiva, o campo de visão (FOV) é limitado a uma parte do átrio (i. e. apenas o apêndice atrial esquerdo como mostrado na Figura 2a). Para obter o FOV maior do átrio, um 1.6 X da lente objetiva é às vezes preferível (Figura 2b). Em segundo lugar, sem fixação do átrio com pinos, às vezes é difícil medir as propriedades de condução atrial corretamente, porque a superfície atrial é curvo. Então, colocamos o tampa de vidro em sua superfície para achatá-lo em vez de corrigi-lo por pinos. Esse método também é benéfico para a prevenção de artefato de movimento de vibrações da solução. Em terceiro lugar, com o nosso método, é muito difícil obter o FOV inteira, então, usar a exibição anterior e posterior corretamente é mais importante em nossa abordagem do que a outra abordagem, como mostrado na Figura 2. A vantagem do modo de exibição anterior seria a observação clara de reentrada no caso de condições patológicas, especialmente no apêndice (Figura 4). Por outro lado, a vista posterior tem uma vantagem de se obter uma boa visão da parede posterior atrial e pode haver uma gravação detalhada de desencadear a atividade da manga do miocárdio. Quando é difícil obter uma visualização apropriada e achatar sua superfície curvada com nosso método, o átrio pode ser corrigido com tensão mínima por pinos.
Com nosso método, existem 3 possíveis problemas, falha de coloração, estimulação e indução de arritmia. Por falta de coloração, se não ou ligeira fluorescência é observada, você deve verificar se o aparelho óptico mapeamento esteja montado corretamente, e se o reagente é adequadamente armazenado e usado. A condição da solução de perfusão também é crucial, que também pode afetar as propriedades eletrofisiológicas do coração em si, então, as condições da solução, incluindo o pH, temperatura, e se houve suficiente arejamento deve ser rigorosamente monitorados. Também é importante evitar qualquer embolia no coração. Para estimulação falha, se a estimulação estímulos não podem excitar o átrio, pesquisadores devem verificar se a fiação está correta usando um testador de circuitos. Quando os estimulação estímulos serão emitidos corretamente, o problema é o contato do eletrodo com o tecido. Reposicionamento dos eléctrodos pode resolver o problema, e nossa abordagem usando o cateter guia torna mais fácil. Para a dificuldade na indução de arritmia, RV estimulação pode ser usado para a indução de um AT em alguns casos limitados. Usando um cateter de eletrodos transvenosos do que a distais dois eletrodos e eletrodos proximais podem ser localizados no RV e RA, respectivamente, é fácil alterar o site estimulação da RA para a caravana. Este cateter também é útil para deslocamento a excitação ventricular quando um sinal de ativação ventricular simultânea mascara o sinal de excitação atrial.
Este método irá contribuir para avaliar o genótipo-fenótipo interações no AF relacionados genes encontrados recentemente por estudos de romance como GWAS, especialmente para os genes com que a investigação não conseguiu mostrá-los por outras abordagens. Com o progresso das técnicas e dispositivos, as propriedades eletrofisiológicas da manga veia pulmonar, que é a fonte importante de AF20, podem ser avaliadas no coração intacto, com esta abordagem.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo programa para melhoria do ambiente de pesquisa para jovens investigadores de fundos especiais de coordenação para promover a ciência e tecnologia (SCF) (para T.S.), Grants-in-Aid para investigação científica (n. º 16K 09494, T.S., n. º 26293052, a T.F.) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão. Agradecemos a Brainvision e Mr. Kenji Tsubokura pela assistência técnica, e também agradecemos Sr. John Martin por sua assistência linguística.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
- Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
- Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
- Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
- Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
- Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
- Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
- Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
- Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
- Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
- Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
- Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
- Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
