该协议描述了利用具有高时间和空间分辨率的光学映射系统对小鼠心房的电生理评价, 包括膜电压的双记录和 Ca2 +瞬态的编程通过专门的电极导管进行刺激。
最近针对心房颤动 (AF) 的全基因组联合研究表明, 心房的基因型和电生理表型之间有很强的联系。这鼓励我们利用基因工程的老鼠模型来阐明 AF 的机制。然而, 由于小鼠心房的体积较小, 很难评价其电生理特性。该协议描述了在 Langendorff 灌注小鼠心脏的高时间和空间分辨率的光学映射系统心房的电生理评价。光学映射系统采用双高速互补金属氧化物半导体相机和高放大物镜组合, 检测电压敏感染料和 Ca2 +指示器的荧光。专注于对小鼠心房的评估, 光学映射的面积为2毫米 x 2 毫米或10毫米 x 10 毫米, 有 100 x 100 分辨率 (20 µm/像素或100µm/像素), 最大值为10赫 (0.1 毫秒) 的采样速率。1-法国大小 quadripolar 电极起搏导管放置在右心房通过上腔静脉避免任何机械损伤心房, 和起搏刺激通过导管传递。采用程控刺激进行电生理研究, 包括恒定起搏、爆裂起搏和高达三重 extrastimuli 起搏。在自发或起搏的节奏下, 光学映射在右、左心房分别记录动作电位持续时间、活化图、传导速度和 Ca2 +瞬态。此外, 程序化刺激也决定了心房失常的 inducibility。在诱导心房快速心律失常过程中, 进行精确的活化映射, 以确定心房的兴奋传播。具有专门设置的光学映射可以对小鼠病理模型中心房进行彻底的电生理评估。
心脏包括4个室在哺乳动物。上两室为心房, 下部为心室。心室作为泵排出血液到全身或肺循环。心房接受血液从全身或肺静脉返回, 并协助将血液输送到心室以获得有效的心脏泵功能。从电生理方面来说, 心房的重要功能是调节心率。电信号来源于位于上腔静脉 (SVC) 与右心房 (ra) 交界处的窦节点, 然后传播到 RA 和左心房 (LA), 通过房室结和他的浦肯野进行心室传导。传导系统。
心律失常是心脏节律紊乱, 根据其来源分为心房和心室。心房颤动 (AF) 是最常见的心律失常的持续形式, 其特点是随机和快速兴奋的心房。最近的基因分析和全基因组联合研究 (GWAS) 显示了 AF 与基因突变或 monopolymorphisms1、2、3、4之间的关联。这些发现表明 AF 至少部分与遗传原因有关。因此, 用基因工程动物模型评价心房的基因型与表位相互作用是至关重要的。人们普遍认为, 老鼠是最成熟的基因改良哺乳动物。
为评价心脏组织的兴奋性, 研制了光学制图技术。然而, 光测图观察小鼠心房的大小相对较小。我们试图对小鼠心房进行详细的评估, 具有较高的时间和空间分辨率。
光学制图是研究心脏电生理学的一个很好的方法7, 是一个非常有用的工具, 不仅评估室性心律失常8,9, 但也心房一个10,11.同时映射跨膜电位和 Ca2 +瞬变有助于了解心律失常的基本机制与心力衰竭和其他心脏病的关系12,13。当比较其他的电生理评估方法, 如使用单个细胞或细胞片, 在灌注心脏的光学映射的绝对优势之一是评估在完整的心房传导模式和心室, 不仅在窦节律, 而且在诱发心律失常的14。试图利用小鼠的心脏, 特别是中庭, 作为人类的替代品遇到了困难, 主要是由于其体积较小, 然而, 老鼠是一个有吸引力的实验模型, 在评估的基因工程动物模型, 这个问题必须克服。我们的方法为解决这一目标提供了一个方向。
虽然我们的光学测绘仪器基本上与常规的小鼠心脏系统相似15, 但我们的方法具有对小鼠心房进行一些修改的优势。首先, 我们追求获得高达0.1 毫秒/帧和20µm/像素的高空间和时间分辨率, 这种高分辨率的映射有助于更精确地测量小鼠心房的传导速度和传播模式。第二, 为了避免任何不必要的机械损伤或心房伸展, 这可能改变电生理特性16,17, 留置针直接插入 LV 以减少腔内压力,而不是在前面的研究15中执行时将其插入到 LA 中。此外, 起搏刺激是通过一个定制的 1-法国大小电极导管放置在 RA, 但不是由针电极, 这可能会损害心房。在修复心房附属物时, 避免使用任何引脚, 在过去的研究中采用了15。第三, 在对心律失常的基本机制进行评估时, 诱导心房失常的程序性刺激协议至关重要18,19。我们执行编程刺激相同的临床电生理研究, 包括爆裂起搏和高达三重 extrastimuli 起搏, 改变了起搏间隔的鼠标心脏。因此, 除了基线测量参数外, 该协议还可以评估 AT 的 inducibility。在需要时, inducibility 的使用是用异丙肾上腺素或其他药物进行评估的。在我们的经验, 野生型小鼠几乎没有显示任何 ATs, 即使在一个完整的刺激协议。因此, inducibility 应该是评估多种病理条件的贡献的重要信息, 如基因突变、手术程序和药物管理11。这些修改可以优化完整的小鼠心房的精确电生理评估。
该方法也有一定的局限性。首先, 使用具有5X 物镜的最大空间分辨率, 视场 (FOV) 仅限于中庭的一部分 (i. e. 只有左心房附属物, 如图 2a所示)。为了获得中庭较大的 FOV, 1.6X 物镜有时更可取 (图 2b)。其次, 不用针固定心房, 有时很难正确测量心房传导特性, 因为心房表面弯曲。所以, 我们把盖子玻璃放在它的表面, 以使其平整, 而不是用别针固定。这种方法也有利于防止运动工件的振动的解决方案。第三, 用我们的方法, 很难获得它的整个 FOV, 因此, 在我们的方法中使用前和后视图比在图 2中所示的其他方法更重要。前视图的优点是在病理条件下, 特别是在附属物 (图 4) 中对再入的清楚观察。另一方面, 后视的优点是获得良好的心房后壁的看法, 可能是一个详细的记录触发活动的心肌袖。当难以获得合适的视图, 并以我们的方法使其曲面平坦时, 中庭可以通过引脚的最小张力固定。
用我们的方法, 有3可能的问题, 染色失败, 起搏, 心律失常诱导。对于染色失败, 如果没有或轻微荧光被观察, 你应该检查是否正确组装光学测绘仪器, 以及试剂是否适当储存和使用。灌注液的条件也是至关重要的, 这也会影响心脏本身的电生理特性, 因此, 溶液中的 pH 值、温度以及是否有足够的曝气条件必须严格监测。避免心脏的空气栓塞也很重要。对于起搏失败, 如果起搏刺激不能激发心房, 研究人员应检查线路是否正确使用电路测试仪。当起搏刺激正确输出时, 问题是电极与组织的接触。电极的重新定位可以解决这个问题, 我们使用起搏导管的方法很容易。对于心律失常诱导的困难, RV 起搏可用于在一些有限的情况下的诱导。使用 quadripolar 电极导管, 其中远端两电极和近端电极可以位于 rv 和 RA, 分别是很容易改变的起搏地点从 RA 到 rv。当同时心室活化信号遮盖心房激发信号时, 该导管也可用于转移心室兴奋。
这一方法将有助于评估新发现的 AF 相关基因, 如 GWAS, 特别是对于调查未能通过其他方法显示的基因表型之间的相互作用。随着设备和技术的进步, 肺静脉袖的电生理特性是 AF20的重要来源, 可以用这种方法对完整的心脏进行评估。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了改善研究环境的项目的支持, 从促进科学技术的特别协调基金 (16K09494), 为科学研究提供援助 (no, 26293052 号,到 T.F.)来自日本教育、文化、体育、科学技术部 (下个)。我们感谢 Brainvision 和 Tsubokura 先生的技术援助, 我们也感谢约翰. 马丁先生提供的语言帮助。
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |