Det här protokollet beskriver elektrofysiologiska utvärderingen av murina atria utnyttja en optisk kartsystem med en hög temporal och spatial upplösning, inklusive dubbla inspelningar av membran spänningen och Ca2 + övergående under programmerade stimulering genom en specialiserad elektrod kateter.
Senaste genome-wide associationsstudier inriktning förmaksflimmer (AF) har visat ett starkt samband mellan genotyp och elektrofysiologiska fenotyp i förmaken. Som uppmuntrar oss att utnyttja en genetiskt modifierade musmodell för att belysa mekanismen av AF. Det är dock svårt att utvärdera elektrofysiologiska egenskaper i murina atria på grund av sin ringa storlek. Det här protokollet beskriver elektrofysiologiska utvärderingen av atria använder en optisk kartsystem med hög temporal och spatial upplösning i av perfusion murina hjärtan. Optiska kartsystem monteras med dubbla höghastighetståg kompletterande metalloxid semiconductor kameror och objektiv för hög förstoring, att upptäcka fluorescensen av spänningskänsliga färgämne och Ca2 + indikator. För att fokusera på bedömning av murina atria, utförs optisk kartläggning med en yta på 2 mm × 2 mm eller 10 mm x 10 mm, med 100 × 100 upplösning (20 µm/pixel eller 100 µm/pixel) och samplingsfrekvens upp till 10 kHz (0,1 ms) vid maximalt. En 1-franska storlek quadripolar elektrod pacing katetern placeras i höger förmak via den överlägsna vena cava undvika eventuella mekaniska skador till förmak, och pacing stimulering levereras genom katetern. En Elektrofysiologisk undersökning utförs med programmerade stimulering inklusive konstant pacing, brast pacing, och upp till tredubbla extrastimuli pacing. Under en spontan eller pacing rytm, registreras den optiska kartläggningen aktionspotentialens duration, aktivering kartan, överledning hastighet, och Ca2 + övergående individuellt i höger och vänster förmak. Dessutom bestämmer programmerad stimulering också inducibility av förmaksflimmer takyarytmier. Exakta aktivering kartläggning utförs för att identifiera förökningen av magnetiseringen i vinterträdgården under en inducerad förmaksflimmer takyarytmi. Optiska mappning med en specialiserad inställning gör en grundlig elektrofysiologiska utvärdering av atrium i murina patologiska modeller.
Hjärtat består av 4 avdelningar hos däggdjur. De övre två kammarna är atria, och de nedre är ventriklarna. Kamrarna fungerar som en pump för att mata ut blodet till systemisk eller pulmonella cirkulationen. Atria får blodet återvänder från systemisk eller pulmonell venerna och hjälpa transporterar blod till kamrarna att erhålla en effektiv hjärtats pumpfunktion. Från en Elektrofysiologisk aspekt är atria viktig funktion att reglera hjärtrytmen. De elektriska signalerna härstammar från sinusknutan ligger i korsningen mellan den överlägsna vena cava (SVC) och höger förmak (RA), och sedan sprids till RA och vänster förmak (LA), och genomföra till ventrikeln via atrioventrikulärt nod och Hans-Purkinje retledningssystem.
Arytmier, som hjärtrytmrubbningar, indelas i förmaks- och beroende på deras ursprung. Förmaksflimmer (AF) är den vanligaste ihållande formen av en arytmi, kännetecknas av en slumpmässig och snabba excitation av förmaken. Senaste genetiska analyser och genome-wide associationsstudier (GWAS) har visat sambandet mellan AF och genetiska mutationer eller monopolymorphisms1,2,3,4. Dessa fynd Visa AF är åtminstone delvis kopplad till en genetisk orsak. Därför är det kritiskt att utvärdera genotyp-fenotyp interaktioner i förmaken använder en genetiskt modifierade djur modell. Det är allmänt accepterat att musen är det mest etablerade däggdjuret för genetisk modifiering.
Den optiska kartläggning tekniken har utvecklats för att utvärdera excitation av hjärtat. Observation av murina atrium av optiska mappning hämmas dock av sin relativt begränsade storlek. Vi försöker att uppnå en detaljerad bedömning av murina atrium med en hög temporal och spatial upplösning.
Optiska mappning är en väletablerad manöver för att studera hjärtats elektrofysiologi7, och är ett ganska användbart verktyg för att bedöma inte bara ventrikulära arytmier8,9, men även förmaksflimmer de10,11 . Samtidiga kartläggning av transmembrana potential och Ca2 + transienter är användbara för att förstå de underliggande mekanismerna för arytmier i samband med hjärtsvikt och andra hjärtsjukdomar12,13. När man jämför de andra elektrofysiologiska metoderna för riskbedömning, till exempel med en enstaka cell eller cellagret, en av de absoluta superiorities av optisk kartläggning i perfunderade hjärtat är bedömningen av överledning mönstret i intakt atrium och ventrikeln, inducerad inte bara under sinusrytm utan också under arytmier14. Ett försök att utnyttja murina hjärtan, särskilt atrium, som ett surrogat av människor har stött på svårigheter huvudsakligen på grund av sin ringa storlek, men musen är en attraktiv experimentell modell när det gäller bedömningen i ett genetiskt modifierade djur modell, och detta problem måste övervinnas. Vår metod ger en riktning för att lösa problemet.
Även om vår optiska mappning apparater var i grunden liknar det konventionella systemet för hela murina hjärtan15, har vår metod fördelen av att bedöma murina atrium genom att göra några ändringar i den. Först, vi eftersträvade för att erhålla en hög rumsliga och temporal upplösning på upp till 0,1 ms/ram och 20 µm/pixel, och denna högupplösta kartläggning som bidragit till en mer exakt mätning av överledning hastighet och förökning mönstret i murina atrium. För det andra, för att undvika onödig mekanisk skada eller sträcka av vinterträdgården, som kunde förändra den elektrofysiologiska egenskaper 16,17, en inneboende nålen sätts direkt i LV att minska intra-kammare trycket, i stället för att infoga det genom LA som utförs i den tidigare studien15. Dessutom den pacing stimulansen levereras genom en anpassad gjorde 1-franska storlek elektrod katetern placeras i RA, men inte genom en nål elektrod, som kan skada atrium. Alla stift undviks i fastställande av förmak bihang, som användes i tidigare studie15. Tredje, när det gäller bedömningen av den underliggande mekanismen vid arytmier, en programmerad stimulering protokollet att framkalla förmaksflimmer takyarytmier är avgörande18,19. Vi utför programmerade stimulering identisk i kliniska elektrofysiologiska studier, inklusive burst pacing och upp till tredubbla extrastimuli pacing, med en modifiering av pacing intervallet för mus hjärtat. Således, förutom de baslinje mätparametrar, protokollet kunde bedöma inducibility av AT. När det behövs, bedöms inducibility av AT med administrering av isoproterenol eller andra droger. Vår erfarenhet visar vildtyp mössen knappast någon ATs även efter en fullständig stimulering protokoll. Inducibility at bör således vara viktig information för att utvärdera bidraget av flera sjukdomstillstånd såsom genetiska mutationer, kirurgiska ingrepp och administrering av läkemedel11. Dessa ändringar kan optimera den exakt elektrofysiologiska bedömningen i intakt murina atrium.
Denna metod har också vissa begränsningar. Först, med en maximal rumslig upplösning med en 5 X objektiv, synfältet (FOV) är begränsad till en del av atrium (dvs. endast den vänstra förmak bihang som visas i figur 2a). För att erhålla större FOV av atrium, är en 1,6 X objektiv ibland att föredra (figur 2b). För det andra, utan att åtgärda atrium med stift, ibland är det svårt att mäta förmaksflimmer överledning egenskaper korrekt, eftersom förmaksflimmer ytan är krökt. Så, vi placerade skyddsglaset på dess yta att platta det istället för fastskruvning av pins. Denna metod är också fördelaktigt för att förhindra rörelse artefakt från vibrationer av lösningen. För det tredje, med vår metod, det är ganska svårt att få hela FOV av det, så att använda vyn främre och bakre ordentligt är viktigare i vår inställning än i den andra metoden som visas i figur 2. Fördelen med den främre se skulle vara tydlig observation av återinträde när det gäller sjukdomstillstånd, särskilt i bihang (figur 4). Däremot, den bakre uppfattningen har en fördel av att få en bra bild av förmaksflimmer bakre väggen, och kan vara en detaljerad inspelning av utlösande aktivitet från hjärtinfarkt hylsan. När det är svårt att få en passande vy och platta till dess böjda yta med vår metod, kan atrium vara fast med minimal spänning av pins.
Med vår metod finns det 3 möjliga problem, fel på färgning, pacing och arytmi induktion. För om färgning, om ingen eller svag fluorescens observeras, bör du kontrollera huruvida optiska mappning apparaten monteras korrekt och om reagensen lagras på lämpligt sätt och används. Villkora av perfusion lösningen är också avgörande, som också kan påverka hjärtat själv, så, villkora av lösning inklusive pH, temperatur, elektrofysiologiska egenskaper och huruvida det fanns nog luftning måste övervakas strängt. Det är också viktigt att undvika eventuella luftemboli i hjärtat. För pacing misslyckande, om de pacing stimuli inte kan excitera atrium, bör forskare kontrollera om ledningarna är korrekt med hjälp av en krets testare. När de pacing stimuli är korrekt ut, är problemet kontakten mellan elektroden med vävnaden. Ompositionering av elektroderna kan lösa problemet, och vår metod med pacing katetern gör det enkelt. För svårigheter i arytmi induktion, kan RV pacing användas för induktion av en AT i vissa begränsade fall. Använder en quadripolar elektrod kateter som den distala två elektroder och proximala elektroder kan placeras i RV och RA, respektive, är det lätt att ändra webbplatsen pacing från RA till RV. Denna kateter är också användbart för skiftande ventrikulär excitation när en samtidig ventrikulära aktiveringen signal masker förmaksflimmer excitation signalen.
Denna metod kommer att bidra till att bedöma den genotyp-fenotypen interaktioner i AF relaterade gener nyfunna av de nydanande studierna såsom GWAS, särskilt för de gener som utredningen inte visat dem genom andra metoder. Med utvecklingen av enheter och tekniker, kan pulmonell ven hylsan, vilket är en viktig källa till AF20, elektrofysiologiska egenskaper bedömas i intakt hjärtat med detta tillvägagångssätt.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av programmet för förbättring av forskningsmiljö för unga forskare från särskilda samordning medel för att främja vetenskap och teknik (SCF) (till T.S.), Grants-in-Aid för vetenskaplig forskning (nr 16K 09494, att T.S., nr 26293052, att T.F.) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) av Japan. Vi uppskattar Brainvision och Mr. Kenji Tsubokura för tekniskt bistånd, och vi uppskattar också Mr John Martin för hans språkligt stöd.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |