Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.
Recente studies van de genoom-brede vereniging gericht op atriale fibrillatie (AF) hebben een sterke associatie tussen het genotype en fenotype van de elektrofysiologische in de atria aangegeven. Dat stimuleert ons om te gebruiken van een genetisch gemanipuleerde muismodel om te verhelderen van het mechanisme van AF. Het is echter moeilijk te evalueren van de elektrofysiologische eigenschappen in lymfkliertest atria vanwege hun kleine omvang. Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in Langendorff geperfundeerd lymfkliertest harten. De optische mapping systeem wordt gemonteerd met dubbele high-speed aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor camera’s en objectieven van hoge vergroting, om te ontdekken de fluorescentie van een spanning-gevoelige kleurstof en Ca2 + indicator. Om zich te concentreren op de beoordeling van lymfkliertest atria, wordt optische toewijzing uitgevoerd met een oppervlakte van 2 mm × 2 mm of 10 mm x 10 mm, met een 100 × 100 resolutie (20 µm/pixel of 100 µm/pixel) en een sampling rate van maximaal 10 kHz (0.1 ms) op maximum. Een 1-Franse grootte quadripolar elektrode pacing katheter wordt geplaatst in de juiste atrium door de superieure vena cava vermijden van mechanische schade aan het atrium en pacing stimulatie wordt beschikbaar gesteld via de katheter. Een elektrofysiologische studie wordt uitgevoerd met geprogrammeerde stimulatie met inbegrip van constante pacing, burst pacing, en tot de drievoudige extrastimuli ijsberen. Onder een spontane of pacing ritme, boekte de optische toewijzing de actiepotentiaal duur, activering kaart geleiding snelheid en Ca2 + individueel in de linker- en atria van voorbijgaande aard. De geprogrammeerde stimulatie bepaalt daarnaast ook de inducibility van atriale tachyarrhythmias. Precieze activering toewijzing wordt uitgevoerd om de verspreiding van de excitatie in het atrium tijdens een geïnduceerde atriale tachyarrhythmia vast te stellen. Optische toewijzing met een gespecialiseerde instelling in staat stelt een grondige elektrofysiologische evaluatie van het atrium in lymfkliertest pathologische modellen.
Het hart bestaat uit 4 kamers in zoogdieren. De bovenste twee holten zijn atria, en de lagere zijn ventrikels. Ventrikels werken als een pomp uitwerpen van bloed naar de systemische of pulmonaire circulatie. Atria ontvangen bloed uit de systemische of pulmonaire aders als resultaat geven en helpen bij het transport van bloed in de ventrikels te verkrijgen van een efficiënte cardiale pomp functie. Vanuit een elektrofysiologische aspect is de belangrijke functie van de atria om het hartritme te reguleren. De elektrische signalen zijn afkomstig uit de sinusknoop die zich bevindt op het kruispunt tussen de superieure vena cava (SVC) en de juiste atrium (RA), dan doorgeven aan de RA en de linkerboezem (LA), en voeren naar de ventrikel via de atrioventriculaire knoop en zijne-Purkinje geleidingssysteem.
Hartritmestoornissen, die hart ritme stoornissen zijn, worden ingedeeld in atriale en ventriculaire volgens hun afkomst. Atriale fibrillatie (AF) is de meest voorkomende duurzame vorm van een aritmie, gekenmerkt door een willekeurige en snelle excitatie van de atria. Recente genetische analyses en studies van het genoom-brede vereniging (GWAS) hebben aangetoond dat de associatie tussen AF en genetische mutaties of monopolymorphisms1,,2,,3,4. Deze bevindingen wijzen erop dat af is ten minste gedeeltelijk gekoppeld aan een genetische oorzaak. Daarom is het van cruciaal belang voor het evalueren van het genotype-fenotype-interacties in de atria met behulp van een genetisch gemanipuleerde diermodel. Het is algemeen aanvaard dat de muis de meest gevestigde zoogdier voor genetische modificatie is.
De optische mapping-techniek is ontwikkeld om te evalueren van de excitatie van het hartweefsel. De waarneming van het lymfkliertest atrium door optische toewijzing wordt echter belemmerd door de relatief kleine omvang. Wij proberen te verwezenlijken van een gedetailleerde beoordeling van het lymfkliertest atrium met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Optische mapping is een gevestigde manoeuvre voor het bestuderen van de cardiale electrofysiologie7, en is een vrij nuttig hulpmiddel om te beoordelen niet alleen Ventriculaire ritmestoornissen8,9, maar ook atriale10,11 . Gelijktijdige toewijzing van de transmembrane potentieel en Ca2 + transiënten is nuttig voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van ritmestoornissen in verband met hartfalen en andere hart-en vaatziekten12,13. Bij het vergelijken van de andere elektrofysiologische beoordelingsmethoden, zoals die met behulp van een enkele cel of een cel blad, een van de absolute superioriteit van optische toewijzing in het perfused hart is de beoordeling van het patroon van de geleiding in het intact atrium en ventrikel, niet alleen tijdens de sinus ritme, maar ook tijdens geïnduceerde aritmieën14. Een poging om te gebruiken lymfkliertest harten, vooral het atrium, als een surrogaat van de mens is opgetreden problemen voornamelijk te wijten aan hun kleine omvang, maar de muis is een aantrekkelijke experimenteel model op het gebied van de evaluatie in een genetisch gemanipuleerde dieren model, en dit probleem moet worden opgelost. Onze aanpak biedt één richting om het te lossen.
Hoewel onze optische toewijzing apparaat eigenlijk vergelijkbaar met het conventionele systeem voor hele lymfkliertest hart15 was, heeft onze methode het voordeel van de beoordeling van het lymfkliertest atrium doordat enkele wijzigingen aan. Eerst, we voortgezet om het verkrijgen van een hoge ruimtelijke en temporele resolutie van maximaal 0,1 ms/frame en 20 µm/pixel, en deze hoge resolutie toewijzing bijgedragen tot een meer nauwkeurige meting van de geleiding snelheid en vermeerdering patroon in het lymfkliertest atrium. Ten tweede, om te voorkomen dat geen onnodige mechanische schade of stuk van het atrium, die de elektrofysiologische eigenschappen 16,17 veranderen kan, een inwonende naald wordt ingevoegd direct de LV te verminderen van de druk van de intra-kamer, studeren in plaats van het invoegen via de LA zoals uitgevoerd in de vorige15. Bovendien, de pacing stimulus wordt geleverd via een aangepaste maakte 1-Franse grootte elektrode katheter geplaatst in de RA, maar niet door een naald elektrode, die het atrium kunnen verwonden. Alle pennen worden vermeden bij de vaststelling van de atriale aanhangsel, die werden gebruikt in de afgelopen studie15. Ten derde, in termen van de beoordeling van het onderliggende mechanisme van de ritmestoornissen, een geprogrammeerde stimulatie-protocol voor het opwekken van atriale tachyarrhythmias is cruciaal18,19. Wij voeren geprogrammeerde stimulatie identiek is aan die in klinische elektrofysiologische studies, met inbegrip van burst pacing en maximaal triple extrastimuli pacing, met een wijziging van de pacing interval voor het hart van de muis. Dus, naast de basislijn meting parameters, het protocol kunt het evalueren van de inducibility van het AT. Wanneer nodig, wordt de inducibility van het AT beoordeeld met de administratie van isoproterenol of andere drugs. In onze ervaring tonen de wild-type muizen nauwelijks een ATs zelfs na een volledige stimulatie-protocol. Zo moet de inducibility van AT belangrijke informatie voor de evaluatie van de bijdrage van verscheidene pathologische condities zoals genetische mutaties, chirurgische ingrepen, en het beheer van drugs11. Deze wijzigingen kunnen de nauwkeurige elektrofysiologische beoordeling in het intact lymfkliertest atrium optimaliseren.
Deze methode heeft ook enkele beperkingen. Ten eerste, met een maximale ruimtelijke resolutie met een 5 X-objectief, het beeldveld (FOV) is beperkt tot een deel van het atrium (dwz. alleen de linker atriale aanhangsel als aangegeven in Figuur 2a). Voor het verkrijgen van de grotere FOV van het atrium, is een 1.6 X-objectief soms beter (Figuur 2b). Ten tweede, zonder de vaststelling van het atrium met pinnen, soms is het moeilijk om te meten de atriale geleiding eigenschappen correct, omdat het atriale oppervlak is gebogen. Dus, wij het glas cover op arbied aan het afvlakken in plaats van vaststelling van het door de pinnen geplaatst. Deze methode is ook gunstig voor de preventie van beweging artefact trillingen van de oplossing. Ten derde, met onze methode, het is heel moeilijk te verkrijgen van de gehele FOV, dus, de voorste en achterste weergave om goed te gebruiken is belangrijker in onze aanpak dan in de andere benadering zoals afgebeeld in Figuur 2. Het voordeel van de voorste weergave zou de duidelijke waarneming van terugkeer in het geval van pathologische voorwaarden, met name in het aanhangsel (Figuur 4). Aan de andere kant, de achterste weergave heeft een voordeel voor het verkrijgen van een goede weergave van de atriale achterste muur, en misschien wel een gedetailleerde opname van de activiteit van de myocardiale mouw startconditie. Wanneer is het moeilijk om een passend beeld te krijgen en om het gebogen oppervlak plat met onze methode, kan het atrium met minimale spanning worden vastgesteld door de pinnen.
Met onze methode zijn er 3 mogelijke problemen, gebrek aan kleuring, ijsberen en aritmie inductie. Voor falen van kleuring, als geen of lichte fluorescentie wordt waargenomen, moet u controleren of de toewijzing van de optische apparatuur voor het correct is gemonteerd, en of het reagens op de juiste manier wordt opgeslagen en gebruikt. De voorwaarde van de perfusie-oplossing is ook cruciaal, ook kunnen beïnvloeden de elektrofysiologische eigenschappen van het hart zelf, dus, de conditie van de oplossing met inbegrip van de pH, temperatuur, en of er voldoende beluchting moet streng worden gecontroleerd. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat eventuele lucht emboli in het hart. Voor de pacing mislukking, als de pacing prikkels kunnen niet het atrium wekken, moeten onderzoekers controleren of de bedrading correct met behulp van een circuit tester is. Wanneer de pacing prikkels correct output zijn, is het probleem de contactpersoon van de elektrode met het weefsel. Herpositionering van de elektroden, kan het probleem oplossen, en onze aanpak met behulp van de pacing katheter maakt het gemakkelijk. Voor problemen in aritmie inductie, kan RV pacing worden gebruikt voor de inductie van een AT in bepaalde beperkte gevallen. Met behulp van een quadripolar elektrode katheter waarvan de distale twee elektroden en de proximale elektroden kunnen worden gesitueerd in de RV en RA, respectievelijk, is het gemakkelijk om te wijzigen de pacing site van de RA de RV. Deze katheter is ook handig voor het verschuiven van de ventriculaire excitatie, wanneer een gelijktijdige ventriculaire activering signaal het atriale excitatie-signaal maskeert.
Deze methode zal bijdragen tot de beoordeling van het genotype-fenotype interacties in de AF gerelateerde genen nieuw gevonden door de roman studies zoals GWAS, met name voor de genen die niet het onderzoek aan te tonen hen door andere benaderingen. Met de vooruitgang van apparaten en technieken, kunnen het elektrofysiologische eigenschappen van de longader mouw, oftewel de belangrijke bron van AF20, worden beoordeeld in het intact hart met deze aanpak.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door het programma voor verbetering van onderzoeksomgeving voor jonge onderzoekers uit speciale coördinatie fondsen voor de bevordering van wetenschap en technologie (SCF) (naar T.S.), Grants-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (nr. 16K 09494, T.S., No. 26293052, op T.F.) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan. Wij waarderen Brainvision en Mr. Kenji Tsubokura voor de technische bijstand, en wij waarderen ook de heer John Martin voor zijn taalkundige hulp.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |