Ce protocole décrit l’évaluation électrophysiologique des oreillettes murins utilisant un système de cartographie optique à haute résolution temporelle et spatiale, y compris les enregistrements doubles de la tension de la membrane et Ca2 + transitoire sous programmé stimulation au moyen d’une sonde électrode spécialisés.
Des études récentes de liaison pangénomique ciblant la fibrillation auriculaire (FA) indiquent une forte association entre le génotype et le phénotype électrophysiologique dans les oreillettes. Qui nous incite à utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées afin d’élucider le mécanisme de l’AF. Toutefois, il est difficile d’évaluer les propriétés électrophysiologiques dans les oreillettes murines en raison de leur petite taille. Ce protocole décrit l’évaluation électrophysiologique des oreillettes en utilisant un système de cartographie optique avec une haute résolution temporelle et spatiale dans les murins coeurs perfusés. Le système de cartographie optique est assemblé avec des caméras à semi-conducteurs double oxyde de métal complémentaire à grande vitesse et fort grossissement lentilles de l’objectif, pour détecter la fluorescence d’un colorant sensibles à la tension et indicateur de Ca2 + . Se pour concentrer sur l’évaluation de l’oreillette murine, cartographie optique est réalisée avec une superficie de 2 × 2 mm ou 10 mm x 10 mm, avec une résolution × 100 (20 µm/pixel ou 100 µm/pixel) et les taux d’échantillonnage de jusqu’à 10 kHz (0,1 ms) au maximum 100. Une électrode quadripolaire de taille 1-Français stimulation cathéter est placée dans l’oreillette droite par l’intermédiaire de la veine cave supérieure, en évitant des endommagements mécaniques à l’atrium, et stimulation de la stimulation est livrée par le cathéter. Une étude électrophysiologique est réalisée avec une stimulation programmée y compris une stimulation constante, éclater la stimulation et jusqu’à extrastimuli triple stimulation. Sous une spontanée ou à l’amble rythmique, la cartographie optique enregistre la durée du potentiel d’action, carte d’activation, la vitesse de conduction et Ca2 + transitoire individuellement dans les oreillettes droite et gauche. En outre, la stimulation programmée détermine également la capacité d’induction des tachyarythmies auriculaires. Cartographie précise d’activation est réalisée afin d’identifier la propagation de l’excitation dans l’atrium au cours d’une tachyarythmie auriculaire induit. Une cartographie optique avec un cadre spécialisé permet une évaluation approfondie et électrophysiologique de l’atrium dans les modèles murins pathologiques.
Le cœur est composé de 4 chambres chez les mammifères. Les deux chambres supérieures sont les oreillettes, et les inférieures sont les ventricules. Ventricules fonctionnent comme une pompe pour éjecter le sang vers la circulation systémique ou pulmonaire. Les oreillettes reçoivent le sang revenant de venas systémiques ou pulmonaires et aider à transporter le sang dans les ventricules pour obtenir une fonction de pompe cardiaque efficace. L’aspect d’électrophysiologiques, la fonction importante de l’oreillette est de réguler le rythme cardiaque. Les signaux électriques proviennent du nœud sinusal, situé à la jonction entre la veine cave supérieure (SVC) et l’oreillette droite (RA), puis propagent à l’AR et l’oreillette gauche (LA) et procéder au ventricule à travers le nœud auriculo-ventriculaire et His-Purkinje système de conduction.
Arythmie, qui est des troubles du rythme cardiaque, est classés en auriculaires et ventriculaires selon leur origine. La fibrillation auriculaire (FA) est la forme la plus commune soutenue d’une arythmie, caractérisée par une excitation aléatoire et rapide des oreillettes. Des analyses génétiques récentes et les études d’association pangénomique (GWAS) ont montré l’association entre AF et mutations génétiques ou monopolymorphisms1,2,3,4. Ces résultats indiquent QU’AF est au moins partiellement associée à une cause génétique. Par conséquent, il est essentiel d’évaluer les interactions génotype-phénotype dans les oreillettes à l’aide d’un modèle animal génétiquement. Il est largement admis que la souris est le mammifère le plus établi pour la modification génétique.
La technique de cartographie optique a été développée pour évaluer l’excitation du tissu cardiaque. Cependant, l’observation de l’atrium murin par cartographie optique est entravée par sa taille relativement petite. Nous tentons de parvenir à une évaluation détaillée de l’atrium murine avec une haute résolution temporelle et spatiale.
Cartographie optique est une manœuvre bien établie pour l’étude de l’ électrophysiologie cardiaque7et est un outil très utile pour évaluer non seulement les arythmies ventriculaires8,9, mais aussi celles auriculaires10,11 . La cartographie simultanée du potentiel transmembranaire et transitoires de Ca2 + est utile pour comprendre les mécanismes sous-jacents des arythmies en ce qui concerne l’insuffisance cardiaque et autres maladies cardiaques12,13. Lorsque l’on compare les autres méthodes d’évaluation électrophysiologique, tels que ceux qui utilisent une seule cellule ou feuille de cellules, d’entre les supériorités absolues de cartographie optique dans le coeur perfusé est l’évaluation au modèle de conduction dans l’atrium intact et ventricule, non seulement pendant un rythme sinusal, mais aussi pendant les arythmies induites14. Une tentative d’utiliser les cœurs murine, surtout l’atrium, comme substitut de l’homme a rencontré des difficultés, principalement en raison de leur petite taille, mais la souris est un modèle expérimental attrayant sur le plan de l’évaluation chez des animaux modifiés par génie génétique modèle et ce problème doivent être surmontée. Notre approche fournit une direction pour le résoudre.
Bien que nos appareils de cartographie optique était essentiellement semblable au système conventionnel pour cœurs ensemble murine15, notre méthode a l’avantage d’évaluer l’atrium murine en faisant quelques modifications. Tout d’abord, nous avons entrepris pour obtenir une haute résolution spatiale et temporelle de cette cartographie à haute résolution ont contribué à une mesure plus précise du motif vitesse et propagation conduction dans l’atrium murine jusqu’à 0,1 ms/cadre et 20 µm/pixel. En second lieu, afin d’éviter tout endommagement mécanique inutile ou étirement de l’atrium, qui pourrait altérer les propriétés électrophysiologiques 16,17, une aiguille à demeure est insérée directement dans le LV pour réduire la pression intra-chambre, au lieu d’introduisant par la LA interprété lors de la précédente étude de15. En outre, le stimulus de stimulation est livré dans un taille faite sur commande de Français-1 électrode cathéter placé dans le RA, mais pas par une électrode à aiguille, qui risquent de se blesser l’atrium. Les broches sont évités lors de la fixation de l’auricule, qui ont été utilisés dans l’étude des dernières15. Troisièmement, en ce qui concerne l’évaluation du mécanisme sous-jacent de l’arythmie, un protocole de stimulation programmée pour induire des tachyarythmies auriculaires est crucial18,19. Nous effectuons une stimulation programmée identique à celui dans des études cliniques et électrophysiologiques, incluant la stimulation de l’éclater et jusqu’à extrastimuli triple stimulation, avec une modification de l’intervalle de stimulation pour le coeur de souris. Ainsi, en plus des paramètres de mesure de base, le protocole permettrait d’évaluer la capacité d’induction de l’AT. Au besoin, la capacité d’induction de l’AT est évaluée avec l’administration de l’isoprotérénol ou d’autres drogues. Dans notre expérience, les souris de type sauvage a peine montrent tout ATs même après un protocole de stimulation complet. La capacité d’induction d’AT devrait donc être une information importante pour l’évaluation de la contribution de plusieurs conditions pathologiques telles que les mutations génétiques, interventions chirurgicales et l’administration de médicaments,11. Ces modifications pourraient optimiser l’évaluation électrophysiologique précise dans l’atrium murine intact.
Cette méthode a également quelques limitations. Tout d’abord, utilisez une résolution spatiale maximale avec un objectif de 5 X, le champ de vision (FOV) est limitée à une partie de l’oreillette (i.e. seulement l’auricule gauche comme illustré à la Figure 2 a). Pour obtenir le champ de vision plus grand de l’atrium, un objectif de 1,6 X est parfois préférable (Figure 2 b). Deuxièmement, sans fixation de l’atrium avec broches, il est parfois difficile de mesurer les propriétés de conduction auriculaire correctement, car la surface auriculaire est courbée. Ainsi, nous avons placé le couvercle en verre sur sa surface pour l’aplatir au lieu de fixation par des goupilles. Cette méthode est également bénéfique pour la prévention des artéfacts de mouvement contre les vibrations de la solution. Troisièmement, avec notre méthode, il est assez difficile d’obtenir le champ de vision complet de celui-ci, alors, d’utiliser la vue antérieure et postérieure correctement est plus importante dans notre démarche que dans l’autre approche, comme illustré à la Figure 2. L’avantage de la vue antérieure serait l’observation claire de rentrée dans le cas de pathologies, en particulier dans l’appendice (Figure 4). En revanche, la vue postérieure a l’avantage d’obtenir une bonne vision de la paroi auriculaire postérieure et pourrait être un enregistrement détaillé de déclencher l’activité de la gaine du myocarde. Lorsqu’il est difficile d’obtenir une vision appropriée et d’aplatir la surface incurvée avec notre méthode, l’atrium peut être fixé avec une tension minimale de pins.
Avec notre méthode, il y a 3 problèmes possibles, échec de la coloration, la stimulation et l’induction de l’arythmie. Pour défaut de coloration, si non ou légère fluorescence est observée, vous devriez vérifier si l’appareil de cartographie optique est monté correctement, et si le réactif est convenablement stocké et utilisé. La condition de la solution de perfusion est également cruciale, qui peut également affecter les propriétés électrophysiologiques du cœur lui-même, par conséquent, la condition de la solution dont le pH, la température, et s’il y avait suffisamment d’aération doit être strictement surveillés. Il est également important d’éviter toute embolie au cœur. Rythme d’échec, si les stimuli stimulation ne peuvent exciter l’atrium, chercheurs doivent vérifier si le câblage est correct à l’aide d’un testeur de circuit. Lorsque les stimuli de stimulation sont émis correctement, le problème est le contact de l’électrode avec le tissu. Repositionnement des électrodes peut résoudre le problème, et notre approche à l’aide de la sonde de stimulation, il est facile. Difficulté dans l’induction de l’arythmie, RV stimulation peut être utilisée pour l’induction d’un AT, dans certains cas limitativement énumérés. À l’aide d’une sonde d’électrode quadripolaire dont le distales deux électrodes et électrodes proximales peuvent se trouver dans le RV et RA, respectivement, il est facile de changer le site de stimulation de la RA à la RV Ce cathéter est également utile pour déplacer l’excitation ventriculaire lorsqu’un signal d’activation ventriculaire simultanée masque le signal d’excitation auriculaire.
Cette méthode va contribuer à l’évaluation du génotype-phénotype interactions dans l’AF associés gènes nouvellement découverts par les études roman comme GWAS, surtout pour les gènes dont l’enquête n’a pas pu leur montrer par d’autres approches. Avec les progrès des dispositifs et techniques, les propriétés électrophysiologiques de l’enveloppe de la veine pulmonaire, qui est la source importante de AF20, peuvent être évaluées dans le coeur intact grâce à cette approche.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par le programme pour l’amélioration du milieu de la recherche pour les jeunes chercheurs de fonds spéciaux de Coordination pour la promotion de la Science et technologie (SCF) (à T.S.), subventions pour la recherche scientifique (n ° 16K 09494, T.S., no 26293052, à T.F.) du ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT) du Japon. Nous apprécions Brainvision et M. Kenji Tsubokura pour l’assistance technique, et nous remercions également M. John Martin pour son aide linguistique.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |