Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.
Den letzten genomweite Assoziationsstudien targeting Vorhofflimmern (AF) haben darauf hingewiesen, dass eine starke Assoziation zwischen dem Genotyp und elektrophysiologische Phänotyp in den Vorhöfen. Das ermutigt uns, nutzen Sie ein gentechnisch Mausmodell um den Mechanismus der AF zu erhellen. Es ist jedoch schwierig, die elektrophysiologischen Eigenschaften in murinen Vorhöfe aufgrund ihrer geringen Größe zu bewerten. Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der Vorhöfe mit einer optischen Mapping-System mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in murinen Herzen Langendorff durchblutet. Die optische Mapping-System setzt sich dual High-Speed-komplementäre Metalloxid-Halbleiter-Kameras mit hoher Vergrößerung objektive Objektive, um die Fluoreszenz der Spannung-empfindlichen Farbstoff und Ca2 + Kennzeichen zu erkennen. Um konzentrieren sich auf die Beurteilung der murinen Atrien, ist mit einer Fläche von 2 mm × 2 mm oder 10 mm x 10 mm, mit 100 × 100 Auflösung (20 µm/Pixel oder 100 µm/Pixel) und Sampling-Rate von bis zu 10 kHz (0,1 ms) bei maximaler optische Zuordnung durchgeführt. Eine 1-Französisch Größe vierpolige Elektrode pacing Katheter befindet sich in den rechten Vorhof durch die Vena Cava superior eine mechanische Beschädigung in den Vorhof zu vermeiden, und Tempo Stimulation wird durch den Katheter geliefert. Eine elektrophysiologische Untersuchung erfolgt mit programmierte Stimulation einschließlich konstanten Tempo, platzen, Tempo, und bis zu dreifache Extrastimuli Tempo. Die optische Abbildung aufgenommen unter eine spontane oder Tempo, Rhythmus der Dauer des Aktionspotentials, Aktivierung Karte Leitgeschwindigkeit und Ca2 + vorübergehend einzeln in der rechten und linken Herzvorhof. Darüber hinaus bestimmt die programmierte Stimulation auch die Inducibility atrialen Tachyarrhythmien. Präzise Aktivierung Zuordnung wird durchgeführt, um die Ausbreitung der Erregung im Vorhof während einer induzierten atrialen Tachykardien zu identifizieren. Optische Abbildung mit einer speziellen Einstellung ermöglicht eine gründliche elektrophysiologische Bewertung des Atriums in murinen pathologischen Modelle.
Das Herz besteht aus 4 Kammern bei Säugetieren. Die oberen zwei Kammern sind Atrien und die unteren Herzkammern sind. Herzkammern arbeiten als Pumpe Blut in die systemische oder pulmonaler Kreislauf auswerfen. Atria Blut Rückkehr aus der systemischen oder pulmonalen Venen zu erhalten, und helfen beim Transport von Blut in die Ventrikel, eine effiziente kardiale Pumpfunktion zu erhalten. Von einer elektrophysiologischen Aspekt ist die wichtige Funktion der Vorhöfe, den Herzrhythmus zu regulieren. Die elektrischen Signale stammen aus der Sinusknoten befindet sich an der Kreuzung zwischen der Vena Cava superior (SVC) und rechten Vorhof (RA), dann verbreiten die RA und den linken Vorhof (LA) und führen um die Ventrikel durch die Atrioventricular-Knoten und His-Purkinje Wärmeleitung-System.
Behandlung von Herzrhythmusstörungen, die Herzrhythmusstörungen sind, werden in Vorhofflimmern und ventrikuläre entsprechend ihrer Herkunft klassifiziert. Vorhofflimmern (AF) ist die häufigste anhaltende Form eine Arrhythmie, zeichnet sich durch eine zufällige und schnelle Erregung der Vorhöfe. Neuere genetische Analysen und genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben die Verbindung zwischen AF und genetische Mutationen oder Monopolymorphisms1,2,3,4gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass AF zumindest teilweise eine genetische Ursache zugeordnet ist. Daher ist es wichtig, die Genotyp-Phänotyp-Interaktionen in die Vorhöfe mit einer gentechnisch Tiermodell zu bewerten. Es ist weithin anerkannt, dass die Maus die etabliertesten Säugetier für gentechnische Veränderung ist.
Die optische Mapping-Technik wurde entwickelt, um die Anregung von Herzgewebe zu bewerten. Allerdings ist die Beobachtung des murinen Atriums durch optische Zuordnung von seiner relativ geringen Größe behindert. Wir versuchen, eine detaillierte Bewertung der murinen Atrium mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu erreichen.
Optische Abbildung ist ein gut etabliertes Manöver für das Studium der kardialen Elektrophysiologie7und ist ein sehr nützliches Werkzeug, um nicht nur ventrikuläre Arrhythmien8,9, sondern auch Vorhofflimmern beurteilen10,11 . Gleichzeitige Zuordnung der transmembranen Potenzial und Ca2 + Transienten ist hilfreich für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von Rhythmusstörungen bei Herzinsuffizienz und anderen Herzerkrankungen12,13. Vergleicht man die andere elektrophysiologische Bewertungsmethoden, wie z. B. die Verwendung einer einzelnen Zelle oder Zellen Blatt, einer der absoluten Vorteile der optischen Abbildung in der perfundierten Herzen ist die Bewertung des Musters Wärmeleitung im intakten Atrium und Ventrikel, nicht nur bei Sinusrhythmus, sondern auch während der induzierten Arrhythmien14. Versuch, murine Herzen, vor allem das Atrium als Surrogat des Menschen nutzen aufgetreten Schwierigkeiten vor allem aufgrund ihrer geringen Größe, aber die Maus ist ein attraktives experimentellen Modell im Hinblick auf die Beurteilung in einem gentechnisch veränderte Tier Modell, und dieses Problem überwunden werden müssen. Unser Ansatz bietet eine Richtung um es zu beheben.
Obwohl unser optische Zuordnung Apparat im Grunde ähnlich wie das konventionelle System für ganze murinen Herzen15war, hat unsere Methode den Vorteil der murine Atrium durch einige Änderungen an es zu bewerten. Zunächst verfolgten wir um eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung von bis zu 0,1 ms/Rahmen und 20 µm/Pixel und diese hochauflösende Abbildung dazu beigetragen, eine genauere Messung der Wärmeleitung Geschwindigkeit und Vermehrung Muster im murinen Atrium zu erhalten. Zweitens wird zur Vermeidung von unnötigen mechanischen Schäden oder Dehnung des Atriums, die elektrophysiologischen Eigenschaften 16,17verändern könnte, eine innewohnende Nadel direkt in das LV zur Druckreduzierung der Intra-Kammer eingefügt, statt durch die LA einzufügen, wie in der vorherigen Studie15. Darüber hinaus der Tempo Reiz wird durch eine Sondergröße gemacht 1-Französisch Elektrode Katheter platziert in der RA geliefert, aber nicht durch eine Nadelelektrode, die das Atrium verletzen könnte. Alle Pins werden bei der Festsetzung der atrial Appendage vermieden, die verwendet wurden in der letzten Studie15. Drittens ist ein programmierte Stimulation Protokoll atriale Tachyarrhythmien induzieren in Bezug auf die Bewertung des zugrunde liegenden Mechanismus der die Arrhythmien, entscheidende18,19. Wir führen identisch mit der programmierten Anregung elektrophysiologische Studien, einschließlich Burst Stimulation und bis zu dreifache Extrastimuli Tempo, mit einer Änderung des Schrittmachers Intervalls für die Maus-Herz. So konnte neben der Grundlinie Messparameter, das Protokoll Inducibility des AT bewerten. Im Bedarfsfall wird die Inducibility des AT mit der Verwaltung von Isoproterenol oder anderen Drogen bewertet. Nach unserer Erfahrung zeigen die Wildtyp Mäusen kaum irgendwelche ATs auch nach eine vollständige Stimulation-Protokoll. So sollten die Inducibility AT wichtige Informationen für die Bewertung des Beitrags von mehreren pathologischen Zuständen wie genetische Mutationen, chirurgische Eingriffe und die Gabe von Medikamenten11sein. Diese Änderungen konnten die genaue elektrophysiologische Bewertung im intakten murinen Atrium optimieren.
Diese Methode hat auch einige Einschränkungen. Erstens mit einer maximalen räumlichen Auflösung mit einer 5 X Objektiv, das Sichtfeld (FOV) beschränkt sich auf einen Teil des Atriums (zB. nur die linken atrial Anhängsel wie dargestellt in Abbildung 2a). Ein 1,6 X-Objektiv ist für den Erhalt der größeren FOV des Atriums, manchmal vorzuziehen (Abb. 2 b). Zweitens ist es ohne Befestigung des Atriums mit Stiften, manchmal schwierig die atriale Wärmeleitung Eigenschaften richtig messen da Vorhofflimmern Fläche gekrümmt ist. Also legten wir das Deckglas auf seiner Oberfläche zu glätten es statt der Festsetzung es durch Stifte. Diese Methode ist auch vorteilhaft für Bewegung Artefakt aus Schwingungen der Lösung zu verhindern. Drittens: mit unserer Methode, es ist ziemlich schwierig, die gesamte FOV, zu erhalten, die vordere und hintere Ansicht richtig zu verwenden ist also wichtiger in unserem Ansatz als in den anderen Ansatz wie in Abbildung 2dargestellt. Der Vorteil der anterioren Ansicht wäre die klare Beobachtung der Wiedereintritt bei pathologischen Zuständen, vor allem in die Anhängsel (Abbildung 4). Auf der anderen Seite die hintere Ansicht hat einen Vorteil erlangen eine gute Sicht auf das Vorhofflimmern hinteren Wand, und möglicherweise eine detaillierte Erfassung der Aktivität aus der myokardialen Hülse auslösen. Wenn es schwierig ist, eine entsprechende Ansicht zu erhalten und mit unserer Methode die gekrümmte Oberfläche glätten, kann das Atrium mit minimalen Spannung durch Stifte fixiert werden.
Mit unserer Methode gibt es 3 mögliche Probleme, mangelnde Färbung, Tempo und Arrhythmie Induktion. Für das Scheitern der Färbung, wenn keine oder leichte Fluoreszenz beobachtet, sollten Sie überprüfen, ob der optische Zuordnung Apparat richtig montiert ist, und ob das Reagenz entsprechend gespeichert und verwendet. Der Zustand der Perfusion Lösung ist auch entscheidend, das kann auch Auswirkungen auf die elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzens selbst, also den Zustand der Lösung einschließlich den pH-Wert, Temperatur, und ob gab es genügend Belüftung muss streng überwacht werden. Es ist auch wichtig, eine Luft-Embolie im Herzen zu vermeiden. Für Tempo scheitern, wenn das Tempo Reize das Atrium begeistern können nicht überprüfen Forscher, ob die Verdrahtung korrekt mit einem Schaltkreis-Tester ist. Wenn das Tempo Reize richtig ausgegeben werden, ist das Problem der Kontakt der Elektrode mit dem Gewebe. Neupositionierung der Elektroden kann das Problem beheben, und unser Ansatz, mit dem Tempo Katheter erleichtert. Für Schwierigkeiten bei der Arrhythmie Induktion RV Tempo für die Induktion von einem AT in einigen wenigen Fällen einsetzbar. Verwenden einen vierpolige Elektrode Katheter, von dem die distalen zwei Elektroden und proximalen Elektroden in der RV und RA, bzw. gefunden werden können, ist es einfacher Wechsel des Schrittmachers Website von RA zu RV. Dieser Katheter ist auch nützlich für die ventrikuläre Erregung zu verlagern, wenn eine gleichzeitige ventrikuläre Aktivierungssignal das Vorhofflimmern Anregungssignal Masken.
Diese Methode trägt zur Beurteilung des Genotyp-Phänotyps-Interaktionen in der AF im Zusammenhang mit Gene neu durch die neuartige Studien wie GWAS, vor allem für die Gene mit denen die Untersuchung konnte nicht zeigen, durch andere Ansätze gefunden. Mit dem Fortschritt von Geräten und Techniken können der elektrophysiologischen Eigenschaften der Pulmonalvene Hülse, die die wichtige Quelle des AF20, in der intakten Herz mit diesem Ansatz bewertet werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit ist unterstützt das Programm zur Verbesserung der Forschungslandschaft für junge Forscher aus Sondermitteln Koordination für die Förderung von Wissenschaft und Technik (SCF) (zu T.S), Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschung (Nr. 16 K 09494, T.S, Nr. 26293052, zu T.F) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan. Wir freuen uns über Brainvision und Herrn Kenji Tsubokura für die technische Unterstützung, und wir schätzen auch Mr. John Martin für seine sprachliche Unterstützung.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |