Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.
Recentes estudos de associação de genoma-largo visando a fibrilação atrial (FA) têm indicado uma forte associação entre o genótipo e fenótipo eletrofisiológico nas aurículas. Que nos encoraja a utilizar um modelo de rato geneticamente modificado para elucidar o mecanismo de AF. No entanto, é difícil avaliar as propriedades eletrofisiológicas em átrios murino devido ao seu pequeno tamanho. Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios usando um sistema de mapeamento óptico com uma alta resolução temporal e espacial em corações murino Langendorff perfundido. O sistema óptico de mapeamento é montado com dupla de alta velocidade complementares de óxido metálico semicondutor câmeras e lentes objetivas de alta magnificação, para detectar a fluorescência de uma tensão sensível corante e indicador de Ca2 + . Para focalizar a avaliação dos átrios murino, mapeamento óptico é realizado com uma área de 2 mm × 2 mm ou 10 mm x 10 mm, com 100 × 100 resolução (20 µm/pixel ou 100 µm/pixel) e taxa de amostragem de até 10 kHz (0,1 ms) no máximo. Um eletrodo de tamanho 1-francês transvenosos estimulação cateter é colocado no átrio direito através da veia cava superior, evitando qualquer dano mecânico para o átrio, e estimulação de estimulação é entregue através do cateter. Um estudo eletrofisiológico é realizado com estimulação programada, incluindo a estimulação constante, estourou o marca-passo e até extrastimuli triplo de estimulação. Com uma espontânea ou ritmo de estimulação, o mapeamento óptico gravou a duração do potencial de ação, mapa de ativação, velocidade de condução e Ca2 + transitória individualmente nas aurículas direita e esquerdas. Além disso, a estimulação programada também determina o inducibility de taquiarritmias atrial. Mapeamento de ativação precisa é realizado para identificar a propagação de excitação no átrio durante uma taquiarritmia atrial induzida. Mapeamento de óptico com uma configuração especializada permite uma avaliação eletrofisiológica minuciosa do átrio em modelos patológicos murino.
O coração é composto por 4 câmaras em mamíferos. As duas câmaras superiores são átrios e as inferiores são ventrículos. Ventrículos funcionam como uma bomba para ejetar o sangue para a circulação sistêmica ou pulmonar. Átrios recebem sangue retornando das veias pulmonares ou sistêmicas e auxiliar no transporte de sangue para os ventrículos para obter uma função de bomba cardíaca eficiente. De um aspecto eletrofisiológico, a importante função dos átrios é para regular o ritmo cardíaco. Os sinais elétricos se originam a partir do nó sinusal localizado na junção entre a veia cava superior (SVC) e o átrio direito (RA), então se propague para o RA e o átrio esquerdo (LA) e conduzir para o ventrículo através do nó atrioventricular e His-Purkinje sistema de condução.
Arritmias, que são perturbações do ritmo cardíaco, são classificadas em atrial e ventricular de acordo com sua origem. Fibrilação atrial (FA) é a forma mais comum de sustentada de uma arritmia, caracterizada por uma excitação rápida e aleatória dos átrios. Análises genéticas recentes e estudos de associação de genoma-larga (GWAS) demonstraram a associação entre AF e mutações genéticas ou monopolymorphisms1,2,3,4. Estes resultados indicam que o AF é pelo menos parcialmente associado com uma causa genética. Portanto, é fundamental para avaliar as interações genótipo-fenótipo nas aurículas usando um modelo animal geneticamente modificadas. É amplamente aceito que o mouse é o mamífero mais estabelecido por modificação genética.
A técnica de mapeamento óptico foi desenvolvida para avaliar a excitação do tecido cardíaco. No entanto, a observação do átrio murino pelo mapeamento óptico é dificultada pelo seu tamanho relativamente pequeno. Tentamos alcançar uma avaliação detalhada do átrio murino com alta resolução temporal e espacial.
Mapeamento de óptico é uma manobra bem estabelecida para estudar a eletrofisiologia cardíaca,7e é uma ferramenta bastante útil para avaliar não só arritmias ventriculares8,9, mas também atrial10,11 . Mapeamento simultâneo do potencial transmembrana e transientes de Ca2 + é útil para compreender os mecanismos subjacentes de arritmias em relação à insuficiência cardíaca e outras doenças cardíacas12,13. Ao comparar os outros métodos de avaliação eletrofisiológica, como aqueles que usam uma única célula ou camada de células, dentre as superioridades absolutas de mapeamento óptico no coração perfundido é a avaliação do padrão de condução no átrio intacto e ventrículo, não só durante o ritmo sinusal, mas também durante as arritmias induzidas14. Uma tentativa de utilizar corações murino, especialmente o átrio, como um substituto dos seres humanos tem encontrado dificuldade principalmente devido ao seu pequeno tamanho, porém, o mouse é um modelo experimental atraente em termos de avaliação em um animal geneticamente modificado modelo e este problema devem ser superado. Nossa abordagem fornece uma direção para resolvê-lo.
Embora nosso aparelho óptico mapeamento foi basicamente semelhante do sistema convencional para corações toda murino15, nosso método tem a vantagem de avaliar o átrio murino fazendo algumas modificações para ele. Primeiro, seguimos para obter uma alta resolução espacial e temporal de até 0.1 ms/frame e 20 µm/pixel e esse mapeamento de alta resolução, contribuído para uma medição mais precisa, o padrão de velocidade e propagação de condução no átrio murino. Em segundo lugar, para evitar danos mecânicos desnecessários ou estiramento do átrio, que poderia alterar as propriedades eletrofisiológicas 16,17, uma permanência agulha é inserida diretamente a LV para reduzir a pressão intracâmara, em vez de inseri-la através do LA como realizado em anterior estudo15. Além disso, o estímulo de estimulação é entregue através de um cateter de tamanho 1-francês feito eletrodo colocado na RA, mas não por um eletrodo de agulha, que pode ferir o átrio. Os pinos são evitados na fixação do apêndice atrial, que foram utilizados no estudo passado15. Em terceiro lugar, em termos de avaliação do mecanismo subjacente das arritmias, um protocolo de estimulação programada para induzir taquiarritmias atrial é crucial18,19. Realizamos estimulação programada idêntico em Estudos eletrofisiológicos clínicos, incluindo a explosão de estimulação e até triplo extrastimuli ritmo, com uma modificação do intervalo de estimulação para o coração de rato. Assim, além dos parâmetros de medição da linha de base, o protocolo poderia avaliar o inducibility de AT. Quando necessário, o inducibility do AT é avaliada com a administração de isoproterenol ou outras drogas. Em nossa experiência, os ratos do selvagem-tipo quase não mostram qualquer ATs mesmo após um protocolo de estimulação completa. Assim, o inducibility de AT deve ser uma informação importante para avaliar a contribuição de diversas condições patológicas, tais como mutações genéticas, procedimentos cirúrgicos e a administração de drogas11. Essas modificações podem otimizar a avaliação eletrofisiológica precisa na aurícula murino intacta.
Esse método também tem algumas limitações. Primeiro, usando uma resolução espacial máxima com um 5 X da lente objetiva, o campo de visão (FOV) é limitado a uma parte do átrio (i. e. apenas o apêndice atrial esquerdo como mostrado na Figura 2a). Para obter o FOV maior do átrio, um 1.6 X da lente objetiva é às vezes preferível (Figura 2b). Em segundo lugar, sem fixação do átrio com pinos, às vezes é difícil medir as propriedades de condução atrial corretamente, porque a superfície atrial é curvo. Então, colocamos o tampa de vidro em sua superfície para achatá-lo em vez de corrigi-lo por pinos. Esse método também é benéfico para a prevenção de artefato de movimento de vibrações da solução. Em terceiro lugar, com o nosso método, é muito difícil obter o FOV inteira, então, usar a exibição anterior e posterior corretamente é mais importante em nossa abordagem do que a outra abordagem, como mostrado na Figura 2. A vantagem do modo de exibição anterior seria a observação clara de reentrada no caso de condições patológicas, especialmente no apêndice (Figura 4). Por outro lado, a vista posterior tem uma vantagem de se obter uma boa visão da parede posterior atrial e pode haver uma gravação detalhada de desencadear a atividade da manga do miocárdio. Quando é difícil obter uma visualização apropriada e achatar sua superfície curvada com nosso método, o átrio pode ser corrigido com tensão mínima por pinos.
Com nosso método, existem 3 possíveis problemas, falha de coloração, estimulação e indução de arritmia. Por falta de coloração, se não ou ligeira fluorescência é observada, você deve verificar se o aparelho óptico mapeamento esteja montado corretamente, e se o reagente é adequadamente armazenado e usado. A condição da solução de perfusão também é crucial, que também pode afetar as propriedades eletrofisiológicas do coração em si, então, as condições da solução, incluindo o pH, temperatura, e se houve suficiente arejamento deve ser rigorosamente monitorados. Também é importante evitar qualquer embolia no coração. Para estimulação falha, se a estimulação estímulos não podem excitar o átrio, pesquisadores devem verificar se a fiação está correta usando um testador de circuitos. Quando os estimulação estímulos serão emitidos corretamente, o problema é o contato do eletrodo com o tecido. Reposicionamento dos eléctrodos pode resolver o problema, e nossa abordagem usando o cateter guia torna mais fácil. Para a dificuldade na indução de arritmia, RV estimulação pode ser usado para a indução de um AT em alguns casos limitados. Usando um cateter de eletrodos transvenosos do que a distais dois eletrodos e eletrodos proximais podem ser localizados no RV e RA, respectivamente, é fácil alterar o site estimulação da RA para a caravana. Este cateter também é útil para deslocamento a excitação ventricular quando um sinal de ativação ventricular simultânea mascara o sinal de excitação atrial.
Este método irá contribuir para avaliar o genótipo-fenótipo interações no AF relacionados genes encontrados recentemente por estudos de romance como GWAS, especialmente para os genes com que a investigação não conseguiu mostrá-los por outras abordagens. Com o progresso das técnicas e dispositivos, as propriedades eletrofisiológicas da manga veia pulmonar, que é a fonte importante de AF20, podem ser avaliadas no coração intacto, com esta abordagem.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado pelo programa para melhoria do ambiente de pesquisa para jovens investigadores de fundos especiais de coordenação para promover a ciência e tecnologia (SCF) (para T.S.), Grants-in-Aid para investigação científica (n. º 16K 09494, T.S., n. º 26293052, a T.F.) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão. Agradecemos a Brainvision e Mr. Kenji Tsubokura pela assistência técnica, e também agradecemos Sr. John Martin por sua assistência linguística.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |