Synaptic धाराओं के Drosophila तीसरे instar लार्वा neuromuscular जंक्शन पर visualized Synaptic बूटोंस से फोकल दर्ज किया जा सकता है । यह तकनीक एक एकल synaptic bouton की गतिविधि की निगरानी में सक्षम बनाता है ।
Drosophila neuromuscular जंक्शन (NMJ) glutamatergic synaptic ट्रांसमिशन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है । हम Drosophila लार्वा NMJ में visualized बूटोंस से synaptic धाराओं के फोकल macropatch रिकॉर्डिंग की तकनीक का वर्णन । इस तकनीक रिकॉर्डिंग micropipettes के निर्माण अनुकूलित की आवश्यकता है, साथ ही एक यौगिक एक उच्च इज़ाफ़ा, लंबी दूरी के पानी विसर्जन उद्देश्य, विभेदक हस्तक्षेप इसके विपरीत (उद्योग) प्रकाशिकी, और एक फ्लोरोसेंट से सुसज्जित माइक्रोस्कोप अनुलग्नक. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक चयनित synaptic के शीर्ष पर तैनात किया गया है bouton के साथ visualized, महामारी-प्रतिदीप्ति, या दोनों । इस तकनीक का लाभ यह है कि यह रिहाई की साइटों की एक सीमित संख्या के synaptic गतिविधि की निगरानी की अनुमति देता है । रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड कई माइक्रोन का एक व्यास है, और जारी इलेक्ट्रोड रिम के बाहर तैनात साइटों काफी रिकॉर्ड किए गए धाराओं को प्रभावित नहीं करते. दर्ज synaptic धाराओं तेजी से कैनेटीक्स है और आसानी से हल किया जा सकता है । इन लाभों को बढ़ाया सहज या अतुल्यकालिक synaptic गतिविधि के साथ उत्परिवर्ती फ्लाई लाइनों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं ।
Drosophila एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली के लिए आणविक synaptic संचरण को नियंत्रित करने के तंत्र का अध्ययन है । Drosophila में neuromuscular प्रणाली glutamatergic है, और इसलिए Drosophila neuromuscular जंक्शन (NMJ) glutamatergic रिलीज के संरक्षित सुविधाओं का अध्ययन किया जा सकता है । जनवरी और जनवरी के अध्ययन के बाद से1, तीसरे instar लार्वा मोटे तौर पर उत्तेजक जंक्शन क्षमता (EJPs) या धाराओं (EJCs) की निगरानी के द्वारा पैदा की और सहज synaptic संचरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । EJPs आमतौर पर एक तेज गिलास माइक्रो इलेक्ट्रोड के साथ intracellularly दर्ज की गई हैं, और वे सभी बूटोंस दिया मांसपेशी फाइबर पर synapses बनाने सहित पूरे NMJ की गतिविधि को प्रतिबिंबित ।
इसके विपरीत, रिलीज की साइटों की एक सीमित संख्या की गतिविधि फोकल स्थिति द्वारा एक micropipette टिप के पास ंयूरॉन टर्मिनलों या synaptic varicosities दर्ज की जा सकती है । इस तकनीक को मूल रूप से Katz और Miledi2द्वारा नियोजित किया गया था, और फोकल extracellular रिकॉर्डिंग सफलतापूर्वक मेंढक3,4,5, माउस6 सहित कई NMJ तैयारी में कार्यरत किया गया है , 7 , 8, जलीय9,10,11,12,13,14,15,16, और Drosophila17,18,19,20,21,22,23. इस दृष्टिकोण आगे Dudel, जो अनुकूलित macropatch reकोडिंग इलेक्ट्रोड24,25द्वारा विकसित किया गया था । Dudel के कार्यांवयन में, इस तकनीक को बारीकी से मिलान ढीला-पैच-क्लैंप विधि26।
Drosophila लार्वा NMJ स्पष्ट रूप से synaptic बूटोंस परिभाषित किया गया है, और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ंयूरॉन फ्लोरोसेंट टैग के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों ( सामग्री की तालिकादेखें) आसानी से उपलब्ध हैं । ये फायदे हमें एक चयनित synaptic bouton20,21,22से EJCs और mEJCs रिकॉर्ड करने में सक्षम । यहां, हम विस्तार से इस तकनीक का वर्णन ।
1. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का निर्माण ग्लास इलेक्ट्रोड्स microelectrode खींचने के लिए निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग करें (देखें सामग्री की तालिका ): लाइन 1: हीट ५१० Pull-वेग 30 समय २५०; लाइन 2: हीट ४?…
Drosophila synaptic ट्रांसमिशन का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद मॉडल जीव का प्रतिनिधित्व करता है । कई रिकॉर्डिंग विन्यास लार्वा NMJ में इस्तेमाल किया गया है, synaptic क्षमता की intracellular रिकॉर्डिंग सहित, दो इलेक्ट्रोड वोल…
The authors have nothing to disclose.
NIH अनुदान R01 MH ०९९५५७ द्वारा समर्थित
Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |