Summary
Synaptic stromingen kunnen focally worden opgenomen van de gevisualiseerde synaptic los op de Drosophila derde instar larven motorische eindplaat. Deze techniek maakt het mogelijk de activiteiten van een enkele synaptic bouton worden gecontroleerd.
Abstract
Drosophila motorische eindplaat (NMJ) is een uitstekend modelsysteem te bestuderen van glutamaterge synaptische transmissie. We beschrijven de techniek van focal macropatch opnames van synaptic stromingen van de gevisualiseerde los op de Drosophila larvale NMJ. Deze techniek vereist aangepaste fabricage van opname micropipetten, evenals een samengestelde microscoop uitgerust met een hoge vergroting, interlokale water onderdompeling doelstelling, differentiële interferentie contrast (DIC) optica en een TL bijlage. De opname-elektrode is geplaatst op de top van een geselecteerde synaptic bouton gevisualiseerd met DIC optica, epi-fluorescentie, of beide. Het voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor de opvolging van de synaptische activiteit van een beperkt aantal sites van release. De opname-elektrode heeft een diameter van enkele microns en de release-sites geplaatst buiten de elektrode velg niet noemenswaardig verstoord de opgenomen stromingen. De opgenomen synaptic stromingen hebben snel kinetiek en kunnen gemakkelijk worden opgelost. Deze voordelen zijn vooral belangrijk voor de studies van mutant vliegen lijnen met versterkte spontane of asynchrone synaptic activiteit.
Introduction
Drosophila is een uitstekend modelsysteem te bestuderen van de moleculaire mechanismen beheersen van synaptische transmissie. Het neuromusculaire systeem in Drosophila is glutamaterge, en daarom de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) kan worden gebruikt voor het bestuderen van de geconserveerde eigenschappen van glutamaterge versie. Sinds Jan en Jan zijn studie1, de derde instar-larven in het algemeen gebruikt om te bestuderen evoked en spontane synaptische transmissie door het toezicht op de excitatory kruising potentieel (EJPs) of stromen (EJCs). EJPs vaak opgenomen intracellulair met een scherpe glas micro-elektrode en worden ze weerspiegelen de activiteit van de gehele NMJ, met inbegrip van alle de los maken van synapsen in de gegeven spiervezel.
Daarentegen kan de activiteit van een beperkt aantal van de sites van release focally worden opgenomen door het plaatsen van een tip van de micropipet in de buurt van neuronale terminals of synaptische varicosities. Deze techniek werd oorspronkelijk gebruikt door Katz en Miledi2, en focale extracellulaire opnames hebben gewerkt op verschillende NMJ preparaten, met inbegrip van kikker3,4,5, muis6 , 7 , 8, schaaldieren9,10,11,12,13,14,15,16, en Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Deze aanpak werd verder ontwikkeld door Dudel, die geoptimaliseerd macropatch elektroden24,25te hercoderen. In Dudel van de uitvoering, en deze techniek toelichtingen de los-patch-clamp methode26.
De Drosophila larvale NMJ heeft duidelijk omschreven synaptic los en transgene lijnen met genetisch gecodeerde neuronale fluorescerende labels (Zie Tabel van materialen) beschikbaar zijn. Deze voordelen ons in staat gesteld om EJCs en mEJCs van een geselecteerde synaptic bouton20,21,22te registreren. Hier beschrijven we deze techniek in detail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van opname elektroden
- trekken de elektroden glas
- gebruik het volgende protocol voor de micro-elektrode trekker (Zie Tabel van materialen):
- lijn 1: warmte 510 Trek - snelheid 30 keer 250; Lijn 2: Warmte 490 Pull - snelheid 30 keer 250.
Opmerking: Tijdseenheden overeen met 0.5 ms per eenheid; de andere eenheden zijn relatief. De waarde van de warmte moet worden aangepast voor elke gloeidraad nadat de helling proef wordt verricht.
- lijn 1: warmte 510 Trek - snelheid 30 keer 250; Lijn 2: Warmte 490 Pull - snelheid 30 keer 250.
- Een microscoop (35 x vergroting) gebruiken om ervoor te zorgen dat de binnendiameter van de getrokken elektrode in het bereik van 7-10 µm ( figuur 1A). Opslaan van de haarvaten in gesloten containers om te voorkomen dat stof accumulatie.
- gebruik het volgende protocol voor de micro-elektrode trekker (Zie Tabel van materialen):
- Fire polijsten
- brand Pools haarvaten (80-90% van de waarde van de maximale warmte voor 1-2 s) met behulp van een micro-forge (Zie Tabel van materialen). De definitieve binnendiameter van de gepolijste elektrode er 5 µm ( figuur 1A) 27.
- Buigmachines
Opmerking: twee bochten zijn gemaakt om de positie van de elektrode op de bovenkant van de spier onder de doelstelling van een hoge vergroting.- Gebruik het apparaat weergegeven in figuur 1B. Vaststellen van de elektrode in de manipulator en plaatst u de tip op de gloeidraad, niet aanraken van IT
- Set waarde tot 60-70% van de maximale warmte en druk op de pedaal voor de micro-forge voor 1-2 s (Zie Tabel of Materials) voor het verwarmen van de gloeidraad. Gebruik een L-vormige naald voorzichtig om neer te trekken het puntje van de elektrode ( figuur 1B vergroot). Maak de bocht bij ongeveer 90 o ( Figuur 1 c).
- Houden de elektrode in de vlam van de fakkel door hand met pincet en maken de tweede bocht op een afstand van 7-10 mm vanaf de eerste bocht en onder een hoek van ongeveer 120 o ( Figuur 1 c).
Figuur 1. Eindstadia van micropipet fabricage. (A) elektrode tips na trekken en fire polijsten. (B.1) de setup voor het buigen van de tip. (B.2) de boxed gebied wordt uitgebreide weergegeven aan de rechterkant. De elektrode en de gloeidraad zijn bevestigd, zodat de elektrode tip gepositioneerd iets boven de draad en niet aanraken is. (C.1) de opname-elektrode. (C.2) de boxed gebied wordt uitgebreide weergegeven aan de rechterkant. De eerste bocht heeft een hoek van ongeveer 90°, en de afstand tussen de eerste bocht en de tip van de elektrode is ongeveer 1 mm. schaal bar = 3 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
2. aanvullende voorbereidende stappen
- voorbereiden heamolymph-achtige (HL3) oplossing (in mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO, 3, 5 trehalose, 115 sacharose, 5 HEPES en 1 mM CaCl 2; Breng de pH op 7.3 - 7.4. Bewaar de oplossing in de koelkast en maak het verse wekelijks.
- Maken stimulatie pipets de zelfde manier als opname glas pipets, maar er is geen behoefte om te buigen ze.
Opmerking: De voorbereiding van stimulatie elektroden is in detail beschreven in 28 en 27. De definitieve diameter na brand polijsten in het bereik van 5-7 µm moet. - Invoegen een stimulatie pipet in een micro-elektrode-houder met een injectiespuit verbonden.
- Vervaardiging dissectie platen van kleine petrischaaltjes (35 x 10 mm) gecoat met siliconen rubber epoxy (Zie Tabel van materialen) zoals beschreven in 28.
Opmerking: Silicone rubber moet vóór gebruik volledig geharde. - Plukken van een dolende derde-instar-larven en het ontleden, zoals beschreven in 27 , 28 , 29 , 30.
Opmerking: Om te visualiseren los, gebruik de vliegen stam CD8-GFP (Zie Tabel van materialen)- met pincet (Zie Tabel of Materials), kies de 3 rd instar-larven uit een flesje.
- Pin van de larven, plaatsen van de eerste pin posterior en andere pin anterior (dicht bij de mond haken).
- Oplossing toevoegen HL3.
- Maken van een verlaging met behulp van voorjaar schaar (Zie Tabel van materialen) helemaal vanaf de bovenste pin aan de onderkant een aan de dorsale zijde van de larven.
- Pin de larven filet, plaatsen van 2 extra pinnen aan de linker- en rechterkant van de larven.
- Verwijderen van de ingewanden en de tracheas met behulp van de verlostang.
- Knippen van de zenuwen net buiten het ventrale zenuw snoer met behulp van voorjaar schaar.
3. Elektrische opnames van EJCs
Figuur 2. De opname setup. Het monster NMJ vastgemaakt aan het silicium gecoate petrischaal (pijl) op de roerende fase van de rechtop samengestelde microscoop uitgerust met mogelijkheden voor epifluorescence, de doelstelling van een hoge vergrotingsfactor en twee micromanipulators wordt geplaatst. De Microscoop is gestationeerd op de tafel van een anti-trillingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Opname
- plaats de petrischaal met de voorbereiding op het stadium van de Microscoop ( Figuur 2). Invoegen van de referentie-elektrode in het bad.
- Vullen de opname-elektrode met HL3 oplossing. Kader van de doelstelling van 10 x (Zie Tabel of Materials), de elektrode onderdompelen in het bad en plaats deze over de spieren 6 en 7 van de abdominale segmenten, 2, 3 of 4 met behulp van de micromanipulator () (Zie Tabel van materialen) Figuur 3 A.1 en A.2).
- Schakelen de doelstelling tot 60 x (Zie Tabel van materialen). Focus op het gebied van belang met epi-fluorescentie of DIC optica. Plaats het uiteinde van de elektrode bovenop synaptic bouton ( Figuur 3 B.1-3).
- Druk op de elektrode zeer voorzichtig naar de spier. Overmatige druk kan beschadigen de NMJ of een verhoging induceren in spontane synaptic activiteit. Zorg ervoor dat het uiteinde van de elektrode niet verstopte - als het is, vervang it.
- Schakelen op de computer, de versterker en A/D bestuur.
- De spanning klem kiezen op de versterker.
- Start acquisitie software en kies de ' kloof-vrije ' modus.
- Observeren van het uiterlijk van mEJCs op het computerscherm.
- Zorg ervoor dat de amplitude van de mEJCs in het bereik van 0,2 is - 0,7 nA.
Opmerking: De kleinere EJCs geven aan dat de opname-elektrode gebreken heeft of dat het niet goed is gepositioneerd.
Figuur 3. Visualisatie van synaptische boutons. (A) A helderveld afbeelding van een hemi-segment jonger dan 10 x vergroting (A.1) en het uitgebreide boxed gebied tonen spieren 6 en 7 (A.2, de pijl markeert de elektrode van de opname). Schaal bar = 50 µm. (B) Synaptic los worden gevisualiseerd in een Drosophila lijn met een genetisch gecodeerde neuronale marker (CD8-GFP) met behulp van epi-fluorescentie imaging (B.1) of DIC optica (B.2). Images zijn geschoten met de 60 x doelstelling en de filter kubus voor GFP beeldvorming (Zie Tabel van materialen). Synaptic los zijn gemarkeerd met pijlen, en een deken van TL en DIC afbeeldingen wordt weergegeven in B.3. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- stimulatie
- met behulp van een micromanipulator, onder een visuele controle, plaatst u de stimulatie-elektrode in de buurt van de axon abdominale segmenten 2-4 innervating.
- De negatieve druk toepassen door te trekken van de zuiger van de spuit aangesloten op de elektrode-houder, zodat het axon wordt getrokken binnenkant van de elektrode ( Figuur 2).
- Zet de stimulator. Draai de knop op de isolatieinrichting (Zie Tabel van materialen) een nul huidige instellen en dan zachtjes toenemen, totdat EJCs verschijnen (of totdat de drempel is bereikt).
- Uitvoeren de stimulatie in een regime van suprathreshold, met de huidige stimulatie steeg ongeveer tweemaal, in vergelijking met de drempel voor de observatie van EJCs.
Opmerking: In onze ervaring is de intensiteit van dergelijke stimulatie optimaal actiepotentiaal mislukkingen en actiepotentiaal bakken te voorkomen. Bijvoorbeeld, als EJCs verschijnen op het huidige stimulatie van 0.2 mA, gebruiken een stroom van 0,4 mA gedurende het gehele experiment.
- Zegel weerstand
- meten van de weerstand van de zegel van de opname macropatch elektrode door te draaien aan de elektrode weerstand schakelaar van de versterker aan " zegel test " positie. Observeren dat de waarde van de zegel weerstand in GΩ wordt getoond de " huidige " venster.
- Zorg ervoor dat de zegel weerstand is in het bereik van 0.5 - 2 M Ω. Waarden buiten dit bereik aangeven dat de elektrode niet goed gepolijst of niet goed gepositioneerd.
- Het zegel verzet gedurende de opname te controleren, om ervoor te zorgen het blijft constant gedurende het gehele experiment.
4. Analyse
- analyseren opnamen dienst aangepaste software voor analyse (Zie Tabel of Materials).
Opmerking: Onze afwerkcentrale gebruikt in-house software Quantan 31, die is aangepast voor de detectie van EJCs en mEJCs focally geregistreerd ( Figuur 4). Deze software bevat een Gaussiaanse digitaal filter en maakt de detectie van quantal pieken in overlappende multi quantal evenementen ( figuur 4A). Andere benaderingen worden beschreven in 17.
Figuur 4. Quantal analyse. Detectie van mEJCs (A) en EJCs (B) door Quantan software. De gebeurtenis gebied wordt gemarkeerd in het groen, en pieken zijn gekenmerkt door rode pijlpunten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Focal macropatch opnames inschakelen synaptic bewakingsactiviteiten van geselecteerde synaptic los (Figuur 5). Wanneer de elektrode is geplaatst op de top van een synaptic bouton (figuur 5A, site 1), de opgenomen mEJCs (figuur 5C, site 1) hebben een aanzienlijk meer dan het geluidsniveau amplitudes en scherpe stijgende fasen (bij een Sub millisecond bereik). Wanneer de opname-elektrode is afgestapt van de synaptische bouton door verschillende micron (figuur 5A, site 2), de amplitudes van de daling van de opgenomen mEJCs bijna het geluidsniveau (figuur 5B, site 2). De opgenomen EJCs kunnen nauwelijks worden onderscheiden van het lawaai en zij hebben verlengd stijgende fasen (figuur 5C, site 2 versus site 1).
Het beperkte aantal release sites bij te dragen tot de opgenomen EJCs en mEJCs, evenals snelle kinetiek van synaptic stromingen focally opgenomen, waardoor nauwkeurige detectie van release gebeurtenissen in mutanten met verhoogde synaptic activiteit. Dit kan duidelijk worden geïllustreerd door de opnames van mEJCs van complexin null mutant (figuur 6A). Spontane activiteit is drastisch verhoogd in deze mutant32, en daarom mEJPs opgenomen intracellulair overlappen en kan niet duidelijk worden onderscheiden van elkaar (figuur 6B), focal opnames22 kunnen weliswaar nauwkeurige detectie van spontane release gebeurtenissen (figuur 4A).
Figuur 5. Opnames van EJCs en mEJCs van een geselecteerde bouton. (A) plaatsing van de elektrode via een geselecteerde bouton (site 1) en het afgestapt van de bouton (plaats 2). De afbeeldingen tonen de CD8-GFP tagged NMJ gevisualiseerd met epi-fluorescentie (A.1), elektrode opnemen over de spiervezel (A.2), en overlays (A.3, A.4), met de elektrode geplaatst over site 1 (A.3) of site 2) A.4). schaal bar = 10 µm. (B) mEJCs die vanuit de bouton (site 1) duidelijk worden onderscheiden van het lawaai van de opname en hebben snel stijgende fasen. In tegenstelling, mEJCs opgenomen van site 2 niet op betrouwbare wijze worden onderscheiden van het lawaai van de opname, hun amplitudes several-fold worden verlaagd, en ze hebben een langzamer tijd-cursus. (C) de Amplitudes van EJCs die vanuit de bouton (site 1) overschrijden met veel-vouwen die de amplitudes van EJCs opgenomen van site 2, en ze hebben ook een snellere kinetiek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Focal macropatch versus intracellulaire opnames. Focal opnames maken nauwkeurige detectie van mEJCs in de complexin null mutant (A), terwijl de intracellulaire opnamen (B) van deze mutant tentoonstelling vrij gebeurtenissen die elkaar overlappen en kunnen niet worden betrouwbaar gedetecteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila vertegenwoordigt een voordelige model-organisme te bestuderen van synaptische transmissie. Verschillende configuraties van de opname zijn gebruikt bij de larvale NMJ, met inbegrip van intracellulaire opnames van synaptic potentiëlen, opnames van synaptic stromingen met twee elektrode spanning klem33,34, en focale macropatch opnames van synaptic stromingen die hier worden beschreven. De laatste techniek staat de precieze kwantificering van synaptische transmissie bij gevisualiseerde los.
Het succes van de beschreven protocol is kritisch afhankelijk van het vermogen om duidelijk visualiseren het interessegebied en aanpassen van de voorbereiding van het opnemen van elektroden. Dus, kwaliteit DIC optiek, een hoge vergroting water onderdompeling doelstelling met een lange afstand, en aangepaste apparatuur voor fire polijsten en buigen van de opname van de elektroden zijn kritisch belangrijk.
Het voordeel van deze aanpak is dat het zorgt voor de opvolging van de activiteit van een paar synapsen die zijn geplaatst onder de opname-elektrode. Hierbij moet worden opgemerkt, echter los geplaatst in de buurt van de rand van de elektrode kunnen ook bijdragen aan opgenomen activiteit. Het is daarom van kritisch, dat de positie van de elektrode, evenals de weerstand van de zegel, niet in de loop van het experiment verandert.
De mogelijkheid om de activiteiten van een enkele bouton controleren kan mogelijk worden gecombineerd met recente imaging-technologieën. Bijvoorbeeld, optische detectie van activiteit op afzonderlijke actieve zones35 kan gecombineerd worden met focal opnames van EJCs en mEJC, en dit kan paar de ruimtelijke resolutie van optische detectie met temporele resolutie van elektrische opnamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ondersteund door de NIH-subsidie R01 MH 099557
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | - | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | - | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
- Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
- Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
- Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
- Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. Localization of active zones. Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).
- Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
- Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
- Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
- Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
- Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
- Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
- Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
- Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
- Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
- Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
- Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
- Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
- Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
- Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
- Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
- Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
- Marrero, H. G., Lemos, J. R. Loose-Patch-Clamp method. , 2 ed, Humana Press. (2007).
- Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
- Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
- Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
- Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
- Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
- Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).
