Synaptiske strømmer kan registreres focally fra visualisert synaptic boutons i Drosophila tredje skikkelsen Larvene nevromuskulær krysset. Denne teknikken gjør det mulig å overvåke aktiviteten til en enkelt synaptic bouton.
Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ) er en utmerket modell å studere glutamatergic synaptic overføring. Vi beskrive teknikken av fokal macropatch opptak av synaptic strøm fra visualisert boutons på Drosophila larver NMJ. Denne teknikken krever tilpasset fabrikasjon av opptak Mikropipetter, samt en satt mikroskop utstyrt med en høy forstørrelse, langdistanse vann nedsenking mål, differensial forstyrrelser kontrast (DIC) optikk og en fluorescerende vedlegg. Innspillingen elektroden er plassert på en valgt synaptic bouton visualisert med DIC optikk, epi-fluorescens eller begge. Fordelen med denne teknikken er at det tillater overvåking synaptic aktiviteten til et begrenset antall steder av utgivelsen. Innspillingen elektroden har en diameter på flere mikrometer, og release nettsteder utenfor elektrode felgen påvirker ikke betydelig innspilte strøm. Innspilte synaptic strøm har rask kinetics og kan lett løst. Disse fordelene er spesielt viktig for studier av mutant fly linjer med forbedret spontan eller asynkron synaptic aktivitet.
Drosophila er en utmerket modell å studere molekylære mekanismer kontrollerer synaptic overføringen. Det nevromuskulære systemet Drosophila er glutamatergic, og derfor Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ) kan brukes til å studere bevarte funksjonene i glutamatergic utgivelse. Siden Jan og Jans studie1, tredje skikkelsen Larvene har blitt bredt brukt å studere vakte og spontan synaptic overføring ved å overvåke eksitatoriske krysset potensialer (EJPs) eller strøm (EJCs). EJPs registreres vanligvis intracellulært med en skarp glass mikro-elektrode, og de gjenspeiler aktiviteten til hele NMJ, inkludert alle boutons gjør synapser på gitt muskel fiber.
Derimot kan aktiviteten til et begrenset antall nettsteder av utgivelsen registreres focally ved å plassere en brønnene tips nær neuronal terminaler eller synaptic varicosities. Denne teknikken ble opprinnelig brukt av Katz og Miledi2og fokal ekstracellulære innspillinger har vært vellykket ansatt ved flere NMJ preparater, inkludert frosk3,4,5, musen6 , 7 , 8, krepsdyr9,10,11,12,13,14,15,16og Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Denne tilnærmingen ble videreutviklet av Dudel, som optimalisert macropatch recoding elektroder24,25. I Dudels implementeringen samsvar denne teknikken tett løs-patch-klemme metoden26.
Drosophila larver NMJ har klart definerte synaptic boutons transgene linjer med genetisk kodet neuronal fluorescerende koder (se Tabell for materiale) er lett tilgjengelig. Disse fordelene gitt oss til å registrere EJCs og mEJCs fra en valgt synaptic bouton20,21,22. Her beskriver vi denne teknikken i detalj.
Drosophila representerer en fordelaktig modell organisme å studere synaptic overføring. Flere opptak konfigurasjoner er brukt på den larver NMJ, inkludert intracellulær opptak av synaptic potensialene, opptak av synaptic strøm med to elektrode spenning klemme33,34og fokus macropatch opptak av synaptic strøm beskrevet her. Sistnevnte teknikken tillater presis kvantifiseringen synaptic overføring på visualisert boutons.
…
The authors have nothing to disclose.
Støttet av NIH stipendet R01 MH 099557
Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |