Synaptic strömmar kan spelas in focally från visualiserade synaptic knappar på den Drosophila tredje instar larver neuromuskulära förbindelsen. Denna teknik gör det möjligt att övervaka aktiviteten hos en enda synaptic bouton.
Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är en utmärkt modell att studera glutamatergic synaptisk transmission. Vi beskriva tekniken av fokal macropatch inspelningar av synaptic strömmar från visualiserade knappar på den Drosophila larval NMJ. Denna teknik kräver anpassad fabrication inspelning Mikropipetter, liksom förening Mikroskop utrustat med en hög förstoring, långdistans vatten nedsänkning mål, differentiell störningar kontrast (DIC) optik och en fluorescerande bifogad fil. Inspelning elektroden placeras på toppen av en valda synaptic bouton visualiseras med DIC optik, påljusfluorescens eller båda. Fördelen med denna teknik är att det tillåter att övervaka synaptic aktiviteten hos ett begränsat antal platser för övergång. Inspelning elektroden har en diameter på flera mikrometer och release webbplatser placeras utanför elektrod fälgen påtagligt påverkar inte de inspelade strömmarna. Inspelade synaptic strömmarna har snabb kinetik och kan lösas lätt. Dessa fördelar är särskilt viktigt för studier av muterade fluglinor med ökad spontan eller asynkron synaptisk aktivitet.
Drosophila är en utmärkt modell att studera de molekylära mekanismer som styr synaptisk transmission. Det neuromuskulära systemet i Drosophila är glutamaterg och därför den Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ) kan användas för att studera bevarade funktioner i glutamaterg release. Sedan Jan och Jans studie1tredje instar larverna har använts mycket att studera evoked och spontana synaptisk transmission genom övervakning av excitatoriska junction potentialer (EJPs) eller strömmar (EJCs). EJPs registreras vanligen intracellulärt med en skarp mikro-glaselektrod, och de speglar aktiviteten av den hela NMJ, inklusive alla de knappar att göra synapser på given muskelfibern.
Däremot kan aktiviteten hos ett begränsat antal platser för release registreras focally genom att placera en mikropipett spets nära neuronala terminaler eller synaptic varicosities. Denna teknik användes ursprungligen av Katz och Miledi2och fokal extracellulära inspelningar har lyckat använts på flera NMJ preparat, inklusive grodan3,4,5, mus6 , 7 , 8, kräftdjur9,10,11,12,13,14,15,16och Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Denna metod utvecklades ytterligare av Dudel, som optimerade macropatch omkodning elektroder24,25. Dudels genomförande matchade denna teknik noga lös-patch-clamp metod26.
Den Drosophila larval NMJ har klart definierade synaptic knappar och transgena linjerna med genetiskt kodade neuronala fluorescerande Taggar (se Tabell för material) är lätt tillgängliga. Dessa fördelar aktiverat oss att spela in EJCs och mEJCs från en vald synaptic bouton20,21,22. Här beskriver vi denna teknik i detalj.
Drosophila representerar en fördelaktiga modellorganism att studera synaptisk transmission. Flera inspelning konfigurationer har använts vid de larver NMJ, inklusive intracellulära inspelningar av synaptic potentialer, inspelningar av synaptic strömmar med två elektrod spänningen klämman33,34, och fokal macropatch inspelningar av synaptic strömmar som beskrivs här. Den sistnämnda tekniken tillåter exakt kvantifiering av synaptisk transmission …
The authors have nothing to disclose.
Stöds av NIH bidraget R01 MH 099557
Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |