Summary
合成・精製・ ミトコンドリアのカルシウム吸収のルテニウム系阻害剤の特性のためのプロトコルが表示されます。グリセリンの哺乳類細胞に対する有効性を評価するための手順が示されています。
Abstract
我々 は、合成、精製、ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤 [(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)]5 +を詳しく説明します。この化合物の最適化された合成開始 [Ru (NH3)5Cl] Cl2から 1 M で NH4密閉容器、緑のソリューションを降伏ああ。陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製が行われます。この化合物は特徴あり紫外可視・赤外分光によって純粋に確認します。蛍光分光法によるグリセリンの HeLa 細胞におけるミトコンドリアのカルシウム吸収抑制プロパティを検索します。
Introduction
ミトコンドリアのカルシウムは、エネルギー生産、アポトーシスなどの正常な細胞機能に不可欠なプロセスの数の重要な調節因子です。1,2,3ミトコンドリアのカルシウム単一輸送体 (MCU) 内のミトコンドリア膜に存在するイオン運送者蛋白質はミトコンドリアにカルシウム イオンの流入を調節します。4,5,6 MCU の化学阻害剤は、継続関数、この輸送蛋白質とミトコンドリアのカルシウムの細胞の役割を研究するための貴重なツールです。化合物 [(HCO2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +Ru360、7 は、24 μ M の報告 Kd値と MCU の唯一知られている選択的阻害剤の一つです。 ,8,9,10この複合体は一般的な不純物の商業配合ルテニウム赤 (RuRed) ドデカカルボニル ジ-μ-オキソ架橋式 [(NH3) の hexacation5Ru (μ-O) Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +、カルシウム吸収の阻害剤としても使用されています。Ru360 は、市販されている、非常に高価です。また、困難な浄化手順やあいまいな評価方法で合成と Ru360 の分離に挑戦します。
我々 は最近、Ru360 アナログ、[(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5にアクセスする代替手段を報告しています。11この化合物は、親和性の高い、Ru360 のように MCU を阻害します。このプロトコルでは、[Ru (NH3)5Cl] Cl2から開始の化合物は、私たちの最も効果的な合成を説明します。この手順の一般的な落とし穴と、強酸性陽イオン交換樹脂を用いた製品の精製の詳細です。また特性と化合物の純度の評価の手法を提示し、ミトコンドリアのカルシウム吸収をブロックでその有効性をテストするための単純なアプローチの輪郭を描きます。
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Protocol
注: 集中された酸と塩基が用いられる。工学的制御 (ドラフト)、安全眼鏡、手袋、白衣、フルの長さのズボン、閉じてつま先の靴を含む個人保護用具 (PPE) の使用を含む反応を実行するときに、すべての適切な安全対策を使用します
。1 ですの準備 [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
[Ru (NH 3) 5 Cl] Cl- 合成。2 12
- RuCl 3 · n H 2 O の
- 溶解 1.00 g (40% 重量 Ru、4.1 モル) H 2 o. クール氷浴で 0 の ° C に暗い茶色ソリューション 5 ml。滴状に 80% ヒドラジン水和物溶液 11 mL (0.23 mol) を追加します。最初の反応は積極的な茶色のソリューションで、その結果、進化ガスになります。得られた溶液; 16 時間室温で攪拌ができます。最終的な解決策は、暗い赤になります
注意: ヒドラジンは鋭く有毒で発がん性です。また、この試薬の無水形態が爆発です。いつものように、処理するときは、適切な PPE とヒューム フードを使用します。乾燥するこれらのソリューションを集中しないでください 。
- このソリューションに 2 pH 調整に濃塩酸の約 5-10 mL を追加。この時点で、ソリューションは、黄褐色になります色で 。
- 熱の 1-2 時間攪拌しながら 105 ° C でこのソリューション。黄色の固体が析出します。多くの沈殿物無しに見えてフォーム、暑さから削除します 。
- エタノールとジエチル エーテルの室温に冷却し、0 ° C の氷浴 10 分収集吸引ろ過及び 5 mL で洗浄で黄色の固体のために反応混合物を許可します 。
- は、15-25 mL のお湯に粗製品を完全に溶解します。氷浴に置くことでフィルターのフラスコの中の濃塩酸溶液の 10 mL を冷やします。淡い黄色の純粋な固体の析出を誘発するチルドの塩酸水溶液に黄色の溶液をフィルターします。この沈殿物をフィルター処理し、0.5 M 塩酸、エタノールとエーテルのそれぞれ 5 mL で洗うです 。
- 特性の複合使用して IR の分光学。3226 cm -1、1604 cm -1、1297 cm -1 に、801 cm -1 にストレッチ頻度の同定、純度を確認します。2069 cm -1 に一般的なマイナーな不純物は [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3 に割り当てられます 。
- 溶解 1.00 g (40% 重量 Ru、4.1 モル) H 2 o. クール氷浴で 0 の ° C に暗い茶色ソリューション 5 ml。滴状に 80% ヒドラジン水和物溶液 11 mL (0.23 mol) を追加します。最初の反応は積極的な茶色のソリューションで、その結果、進化ガスになります。得られた溶液; 16 時間室温で攪拌ができます。最終的な解決策は、暗い赤になります
- [(OH 2) (NH 3) 4 とらぶる (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 の合成
- 100 mg (0.34 mmol) を解散 [Ru (NH 3) 5 Cl]1 M NH 4 200 mL 重い壁丸底圧力容器中の OH の 50 mL の Cl 2。緩く、ストッパー付きフラスコのキャップ 6 h 削除暑さから 75 ° C で反応混合物を熱し、暗い緑色のソリューションを生成するため 4 日間室温で攪拌します
。 注意!圧力上昇により密閉された容器を加熱します。適切な圧力安全ガラスを使用することを確認します。この反作用のため容器のシールの目的はガスの NH 3 の損失を最小限に抑えることです。したがって、過剰な圧力のリリースでは、大まかにストッパーを配置します 。
- 100 mg (0.34 mmol) を解散 [Ru (NH 3) 5 Cl]1 M NH 4 200 mL 重い壁丸底圧力容器中の OH の 50 mL の Cl 2。緩く、ストッパー付きフラスコのキャップ 6 h 削除暑さから 75 ° C で反応混合物を熱し、暗い緑色のソリューションを生成するため 4 日間室温で攪拌します
- 陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
- 25 mL のビーカーに 5 g 陽イオン交換樹脂を中断 (例えば、ダウエックス 50WX2 200-400 メッシュ (H + フォーム) 10 mL 0.1 M HCl 。
- は、50 mL の溶媒貯水池を貼付したもの (直径 10 mm、高さ 15 cm) 10 mL 列にこのスラリーをロードします。溶出液が無色になるまでに約 20-30 ml の 0.1 M HCl の樹脂を洗浄します 。
- は 1.2.1 の手順で分離された緑の反応液に戻ります。このソリューションでは、2 は、その時点でソリューション色が茶色に変化する pH 調整に濃塩酸を追加します 。
- は、1.3.2 の手順で優しく樹脂上にピペッティングにより作製した陽イオン交換樹脂カラムにこの酸性のソリューションを読み込みます。溶出液は完全にドレインし、ソリューションの読み込みを続行できます。ソリューション全体が追加されるまで、このプロセスを繰り返します。樹脂の上部はダークブラウン/ブラックになります。樹脂が少し減少 in ボリューム 。
- 樹脂の上部をカバーするガラス製のビーズを使用。これらの新しいソリューションが追加されたときに邪魔されてから樹脂が防ぐされます 。
- 20 ml 1 M HCl の列を溶出します 。
- 溶出 1.5 M の塩酸濃度の増加の列 (≈ 50 mL)。黄色の溶液は、列をオフに来て開始されます。2 m HCl 濃度を増加し、続ける溶出溶出液が無色になるまでまたは非常に薄い緑、黄色。150-200 mL の容量は、このプロセスに必要になります 。
- は、2.5 メートル (20-50 mL) 塩酸濃度を高めます。溶出液を試験管内の分数として収集します。3 M HCl に増加します。製品は、緑褐色のソリューションとして列から溶出が。赤茶色の分数列オフ来ても始めます。これらの画分は酸化ルテニウム赤不純物、行うプール緑茶色分数ありません 。
- 特性と [(OH 2) (NH 3) 4 とらぶる (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 の純度検証
- すべてから分数のテスト1.3.8 のステップ。紫外可視分光法による。このタスクを達成するために 3 M NH3 の mL の 2 に与えられた分数の 100 μ L を追加し、紫外可視分光法による分析します。純粋な製品を含む分数大吸光度バンドが 360 nm と 600 以下の強烈な吸光度 nm。480 または 533 nm における吸光度はそれぞれ酸化ルテニウム赤とルテニウム赤不純物を示す 。
- は純粋なプロダクトを含む画分をプール、回転蒸発によって乾燥を解決を蒸発させます。製品は、緑褐色の固体として分離されます。利回りは、5-15 mg (10-20% の利回り) は通常およそ。単結晶 x 線回折に適した化合物の水溶液にエタノールの水蒸気拡散によって取得できます 。 純度を確認する
- は、溶液 pH 7.4 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 紫外可視分光法による化合物を分析します。純度の 360 の強度の比で評価がある nm と 600 nm ピーク。この比率は、純粋な化合物の 31 です。不純化合物の比率は小さくなります 。
- 赤外分光法による固体状態のサンプルを分析します。診断のバンドは、3234 cm -1、3151 cm -1、1618 cm -1、1313 cm -1 815 cm -1。1762 cm -1 1400 cm -1 に共通の不純物バンドを見て、NH の特徴 4 Cl. ルテニウム赤で識別できます 1404 cm -1、1300 cm -1、1037 cm -1 と 800 cm -1 に帯 。
- 蛍光分光法によるミトコンドリアのカルシウム吸収抑制の評価
注意!次の手順は、哺乳動物細胞を使用します。生物学的安全性レベル 2 (BSL2) 研究のために認定されている適切な層流フードの仕事行われる必要があります
。 注: [(OH 2) (NH 3) 4 とらぶる (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 が呼びます [Ru] としてこのセクション- バッファーをグルコース含有生理食塩水溶液 (BGSS) のアッセイのメディア。BGSS は 110 mM KCl、1 mM KH 2 PO 4、1 mM MgCl 2、20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、5 mM コハク酸ナトリウム、30 μ M エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-ソリューション N, N、N '、N '-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)。PH 7.4 に調整、グリコールエーテルジアミン四酢酸を除くすべてを組み合わせます。グリコールエーテルジアミン四酢酸を加えて pH 7.4 に調整。50 ml アッセイ メディアの 1 mg/mL のブドウ糖の 0.5 mL を追加します 。
- ダルベッコで 500 cm 2 シャーレで培養 HeLa 細胞 ' s 修正イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) 5% CO 2 播くことによって 100 mm ペトリ皿の成長している 37 ° c. を増幅する HeLa 細胞での加湿のインキュベーターでの500 cm 2 シャーレでそれら。大きな皿に総メディア ボリュームは 115 mL です。各大皿約 1800 万細胞、2 つの蛍光分光実験のために十分になります。
- のセルに達するまで成長 90-95% 合流。メディアを取り出して、15 mL pH 7.4 PBS のセルをすすいでください。PBS で 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 15 の mL を追加し、セルをデタッチするのには 10 分間インキュベートします。14 mL の丸底の隼の管にセルを転送
- 倒立顕微鏡とトリパン ブルー色素および診断を使用してセルをカウントし、セルの合計数とメディア 1.8 mL 体積当たり 750 万の細胞に到達するために必要な量を計算 媒体。5310 × g. 上清をデカントで 10 分の細胞を遠心分離し、BGSS の計算された容積を追加します。優しく細胞を再懸濁します。
- この試金のため純粋な水で準備ジメチルスルホキシド (DMSO)、1 mM H 2 O と 10 mM CaCl 2 H 2 o. [Ru] 在庫ソリューション、カルシウム グリーン 5N で 40 mM ジギトニンの原液を準備、1-3 mM の範囲で指定できます
。 注: カルシウム グリーン-5N は、光に敏感な。暗闇の中で保存し、光の露出を最小限にします 。
- この試金のため純粋な水で準備ジメチルスルホキシド (DMSO)、1 mM H 2 O と 10 mM CaCl 2 H 2 o. [Ru] 在庫ソリューション、カルシウム グリーン 5N で 40 mM ジギトニンの原液を準備、1-3 mM の範囲で指定できます
- 506 nm と 532 で発光励起、蛍光をセットアップ 37 で制御キュベット ホルダー付き nm ° C. 準備攪拌棒やホイール、3.6 1.8 μ L ジギトニン ソリューション上記 1.5.2 から 1.8 mL 細胞懸濁液とアクリル キュベット &# 181;L カルシウム グリーン 5N (ソリューション) と 9 μ [Ru] (1 mM 原液、5 μ M 最終濃度) のため。セル蛍光で 15 分間を、インキュベートします。
- は、生の吸収ではなく励起/蛍光比としてデータを読み取ります。この実習は光源の輝度変動に関連付けられているエラーを最小限に抑えます 。
- [Ru] 細胞の反応に CaCl 2 添加の効果を測定するための不在で最初のサンプル分析を実施します 。
- 1.5.4 で説明する設定と蛍光の分析を開始。安定した排出量ベースラインを確立する約 2 分間待機し、CaCl 2 (10 μ M 最終濃度) の 1.8 μ L を追加します。放射強度は、CaCl 2 の添加によってすぐに増加し、カルシウム イオンは、ミトコンドリアを入力分のコース上が崩壊します。崩壊が完了するまで待つ (≈ 5 分)。[Ru] と扱われない細胞のミトコンドリアのカルシウム吸収反応を決定する、追加のカルシウム ボーラスを追加します 。
- 別キュベットで 5 μ M [Ru] を含む実験を繰り返す 1.5.4.3 で前述。阻害剤の存在下で発光強度は増加が崩壊します。この観察を意味するミトコンドリアのカルシウムの取り込みをブロックします 。
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Representative Results
このメソッドは、ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤 [(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] Cl2から始まっての合成をについて説明します、よく知られている ruthenium(III) の出発原料。[Ru (NH3)5Cl]Cl2は 3200 cm-1、1608 cm-1、1298 cm-1、および 798 cm-1 (図 1) で振動モードの IR の分光学によって特徴付けられます。2069 cm-1にマイナーな不純物は、[Ru (NH3)5N2] Cl3に起因することができます。1 M NH4オハイオ州 Ru(III) この種の反応は、[(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5を与えます。この反応の進行状況は、ソリューション黄色から緑への色の劇的な変化によって証明されます。最終反応液は、色はダーク グリーンです。この濃塩酸溶液の酸性化は茶色; 色変更の結果します。この中和の過程では塩化アンモニウムは、ケアを行使しない場合、最終製品を汚染することができます。強酸性のメッシュ (H+フォーム) 樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィによる化合物の浄化が行われます。樹脂は 0.10 M HCl で最初に平衡し、列に [(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5ソリューションが読み込まれます。塩化アンモニウムの副産物は、1 M HCl 洗浄液でた。ルテニウム含有化合物は、塩酸濃度で溶出します。未反応 [Ru (NH3)5Cl] Cl2開始材料を含んだ黄色の分数のシリーズは、HCl 濃度は 1.5 M 列から来る。望ましいプロダクトを示して 2.5 3.0 m HCl、および結果として得られる分数表示緑色は茶色と緑。
製品の一部分をプーリングする前に彼らの純度を確認必要があります。目的の化合物は、紫外-可視スペクトル上でいくつかの pH 依存性を展示、分数の小さい因数をスペクトル特徴量が分数のすべてで同じであることを確認する非常に基本的な 3 M NH3ソリューションに追加することをお勧めします。純粋な分数だけ 360 に強烈なピークを表示 nm と 600 で弱いピーク nm (図 2)。480 と 533 nm 付近のピークはそれぞれ、ルテニウム茶色と赤の存在を示すと重要なピーク 260 nm、290 で肩 nm、[(NH3) Ru5Cl] Cl2開始材料 (図 3 の存在を意味します。).純粋な分数の回転蒸発は、緑褐色の固体として目的の化合物を与えます。
単離した化合物はさらに紫外可視・赤外分光によって特徴付けられます。紫外-可視スペクトル (図 2) が表示されます、360 nm と 600 nm 吸光度バンド上記のよう。600 nm 帯の消散係数は 850 M-1cm-1 360 nm 帯の 27000 M-1cm-1。600 nm 帯と比較して 360 nm 帯の強度比は、pH 7.4 の pbs は、31 をする必要があります、このメトリックは、化合物の純度を測定する効果的に使用することができます。IR スペクトルは、図 4に示すように表示されます。とらぶる O 伸縮振動は、たとえば、850 cm-1に診断です。とらぶる O ストレッチを決定し、最終製品に塩化アンモニウムが無いことを確認して、IR スペクトルが採用されました。塩化アンモニウム、一般的な不純物には、1762 cm-1 (非常に弱い) と 1400 cm-1 (強い) IR スペクトル (図 5) から容易に識別できることで振動モードがあります。ルテニウム赤反応の一般的な副産物であると IR スペクトル 1404 cm-1にストレッチ、1300 cm-1、1037 cm-1 800 cm-1に識別することができます、目的の製品と一部重複が (が発生します図 6)。
ジギトニン グリセリンの HeLa 細胞におけるカルシウム吸収応答観察 (図 7)。印は CaCl2ボーラスを追加。[(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] の存在下で Cl5発光強度の増加はカルシウム添加がミトコンドリアのカルシウムによる減衰なしの時に観察されます。取り込みが観察されます。
図 1: [Ru (NH3)5Cl] Cl2の赤外スペクトル。[Ru (NH3)5Cl] Cl2非常に小さい [Ru (NH3)5N2] Cl3不純物の赤外線スペクトル。赤い矢印は 2,069 cm-1に不純物を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 純粋な材料の代表紫外-可視スペクトル。[(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)]Cl5紫外可視吸光度スペクトルと近赤外線 (インセット) pH 7.4 PBS で撮影します。360 で主要な吸光度を吸光係数 nm は 27,000 M-1 cm-1。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 粗反応混合物の紫外-可視スペクトル。[(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)]Cl5紫外可視吸光度スペクトル pH 7.4 PBS で撮影した精製前に、の粗反応混合物の。赤い矢印は、一般的な不純物を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 純粋な材料の代表的な赤外スペクトル。[(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5の赤外線スペクトル。とらぶる O ストレッチは 850 cm-1NH3発振器から他のストレッチです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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図 5: NH4Cl 不純物を含む赤外線スペクトル。[(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5塩化アンモニウム不純物の赤外線スペクトル。赤い矢印は、1,400 cm-1に塩化アンモニウムを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 商業のルテニウム赤の赤外スペクトル[(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 (黒い跡) と商業ルテニウム赤 (赤のトレース) の赤外線スペクトル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 代表的なカルシウム吸収の結果。ジギトニン グリセリン HeLa 細胞、カルシウム グリーン-5N と [(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5のカクテルへのカルシウムの添加による蛍光の増加で BGSS。空白が含まれていない [(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5とミトコンドリアに Ca2 +吸収による蛍光減少を見ることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤 [(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] から合成された Cl2、よく知られている ruthenium(III) をすることができます。開始材料は、この手順で説明するよう。[Ru (NH3)5Cl] Cl2の合成は少し難しさと容易に実現できます。水和ヒドラジンの 16 h の RuCl3を攪拌した後、解決の pH は HCl と 2 の値に調整必要があります。PH 低下が目的の製品を達成するために重要です。必要な場合、この合成は HCl ではなく臭化水素酸の還流によってフォーム [Ru (NH3)5Br] Br2に変更できます。
我々 は、ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤の合成における望ましくない副産物の形成を最小限に抑えるためのいくつかの戦略を観察しています。特に、キャップ フラスコを維持することは、この反応の成功に重要です。フラスコが開いているルテニウム赤 (RuRed) を含む他の副産物の数がかなりの量で形成されます。おそらく、気体のアンモニアが開いて反応容器と目的の製品のこのイベント妥協形成から失われます。フラスコのサイズとアンモニア水の量は、変更しないでください大幅このプロトコルに記載されている我々 は小さなフラスコのこの反応の効率が減少することを気づいている重要なパラメーターです。このメソッドでは、この私たちが以前公表していた他の 2 つのメソッドと比較して化合物の収率は大幅に増加しません。それは、ただしより少ないステップ数を含んでおり、少ない製品の側形成 RuRed などを生じさせる。極低降伏点は、未反応 [Ru (NH3)5Cl] Cl2として未知の緊迫、列の上部に保持されている不純物の少量の存在に起因する可能性があります。我々 は多くの追加の反応条件を検討していない、反応時間とより高い収穫を得る反応物濃度を変化させることによって改善を実現できることが可能です。
[(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5の浄化は、このプロトコルの最も面倒で困難な部分です。よく充填カラム、分離に大いに役立つスラリーとして樹脂の読み込みは、列をパックする効果的な方法です。カラム溶出のコース上 HCl 濃度が増加すると、樹脂がサイズの契約があるに注意してください。純粋な材料を正常に得るためには、酸の濃度が増加する率の記載手順から逸脱すべきないです。最終製品になります緑褐色固体;基本的なソリューションは、濃い緑色になりますが、酸性溶液が茶色になります。明るい赤ピンクのソリューションを観察すると、ルテニウム赤汚染が存在します。吸光係数を使用して、RuRed の量を決定できます (62,000 M-1·cm-1で 533 nm)。この浄化プロセスは比較的強い陽イオン交換樹脂カラムが一般的です。
ミトコンドリアのカルシウム吸収抑制は、蛍光測定装置、蛍光カルシウム センサー カルシウム グリーン-5N、グリセリンの HeLa 細胞を使用してテストできます。13,14このアッセイ細胞の大規模な量を必要とする、従って非常に大きい 500 cm2シャーレで培養の増幅が必要になります。これらの大規模な培養フラスコを防ぐ露出表面積が非常に大きいために、微生物汚染を最小限に抑えることで新たな課題。作業は、層流無菌性を維持するキャビネットに実施する必要があります。グリセリンの HeLa 細胞におけるカルシウム グリーン 5N の蛍光応答は、蛍光分光法によって監視されます。キュヴェットへカルシウムの外部ボーラス添加カルシウム センサーとの相互作用から生じる蛍光の即時増加をトリガーします。阻害剤のない状態では数分にわたって、強度は染料がアクセスできない細胞小器官ミトコンドリア、これらカルシウム イオンの取り込みにより崩壊します。発光強度の増加に上昇を与える阻害剤添加カルシウムの塊の存在下でこの分析を実行するタイミング。崩壊ミトコンドリアのカルシウム吸収のためしかしが存在しない、この化合物のミトコンドリアのカルシウム吸収抑制性質を検証します。このプロセスは、カルシウム吸収阻害剤の一般的な画面として使用できます。さらに、関心の他の真核生物の細胞にこの手順を適用できます。この試金によって異なります外側の透過細胞膜がこのように複合体の細胞内取り込み機能に関する情報を提供しません。
要約すると、このプロトコルは合成と新規ルテニウムによるミトコンドリアのカルシウム吸収阻害物質の精製をについて説明します。この化合物は、ミトコンドリアのカルシウムおよび哺乳類の細胞の生理学におけるその役割の生物学を研究するための重要な価値です。ミトコンドリアのカルシウム摂取量をテストするための比較的単純なアッセイは、スクリーニングと阻害剤開発の調査のための使用のもです。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
この研究は、コーネル大学によって支えられました。この作品は、材料研究共有施設、NSF MRSEC プログラム (助成金 DMR 1120296) を通じてサポートされるコーネル大学センターを利用しました。S.R.N. は、NSF 大学院研究員 (グラント DGE-1650441) およびカルシウム実験について博士デーブ Holowka によるサポートを認めています。意見、所見、結論または本資料に示した推奨事項著者 (s) のものし、国立科学財団の見解を必ずしも反映されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
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