Summary
Ett protokoll för syntes, rening och karakterisering av en rutenium-baserade hämmare av mitokondrie kalcium upptag presenteras. Ett förfarande för att utvärdera dess effektivitet i permeabilized däggdjursceller demonstreras.
Abstract
Vi detalj syntes och rening av en mitokondrie kalcium upptag hämmare, [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)]5 +. Optimerad syntesen av denna förening inleds från [Ru (NH3)5Cl] Cl2 i 1 M NH4OH i en sluten behållare, vilket ger en grön lösning. Rening sker med katjon-exchange kromatografi. Denna förening kännetecknas och verifierade för att vara ren av UV-vis- och IR-spektroskopi. Mitokondriell kalcium upptag hämmande egenskaper bedöms i permeabilized HeLa celler av fluorescens-spektroskopi.
Introduction
Mitokondriell kalcium är en viktig regulator för ett antal processer som är kritiska för normal cellfunktion, inklusive energiproduktion och apoptos. 1 , 2 , 3 den mitokondriella kalcium uniporter (MCU), en ion transportör protein som finns på det inre mitokondriella membranet, reglerar inflödet av kalciumjoner i mitokondrierna. 4 , 5 , 6 kemiska hämmare av MCU är värdefulla verktyg fortsatta ansträngningar för att studera funktion och cellulära roller av denna transport protein och mitokondrie kalcium. Den sammansatta [(HCO2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, är en av de enda kända selektiva hämmare för MCU med rapporterade Kd värdet 24 µM.7 ,8,9,10 detta komplex är en gemensam förorening som finns i kommersiella formuleringar av rutenium röd (RuRed), en triruthenium di-µ-oxo överbryggas hexacation av formeln [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, som har också använts som en hämmare för upptag av kalcium. Även om Ru360 är kommersiellt tillgängliga, är det mycket kostsamt. Dessutom utmanas syntes och isolering av Ru360 av svårt rening förfaranden och metoder för tvetydiga karakterisering.
Vi har nyligen rapporterat alternativa förfaranden för att komma åt en Ru360 analog, [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 denna förening hämmar MCU med hög affinitet, liknar Ru360. I detta protokoll, kommer vi att beskriva våra mest effektiva syntes av denna förening, som inleds från [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Rening av produkten med starkt sura katjonbytarmassa är detaljerad, tillsammans med vanliga fallgropar för detta förfarande. Vi också presenterar metoder för karakterisering och bedömning av sammansatta renhet och avgränsa en enkel metod för att testa dess effektivitet i att blockera mitokondriell kalcium upptag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Observera: i denna syntes används koncentrerade syror och baser. Använda alla lämpliga säkerhetsrutiner när du utför reaktion inklusive användning av tekniska kontrollåtgärder (spiskåpa) och personlig skyddsutrustning (PPE) inklusive skyddsglasögon, handskar, labbrock, full längd byxor och stängd tå skor.
1. beredning av [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- syntes av [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
- Lös 1,00 g RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru viktprocent, 4,1 mmol) i 5 mL H 2 O. Cool mörk brun lösningen till 0 ° C i ett isbad. Lägg till 11 mL (0.23 mol) 80% hydrazin hydrat lösning på ett droppvis sätt. Den första reaktionen blir kraftig med evolution gas, vilket resulterar i en brun lösning. Låt den färdiga lösningen rör vid rumstemperatur för 16 h; den slutliga lösningen blir mörka red.
Försiktighet: Hydrazin är akut giftigt och cancerframkallande. Dessutom, är vattenfri former av reagensen explosiva. Som alltid, Använd lämplig personlig skyddsutrustning och rök huvor vid hantering. Inte koncentrera dessa lösningar till torrhet. - Till denna lösning, Lägg till ca 5-10 mL koncentrerad HCl för att justera pH till 2. Vid denna punkt, lösningen blir gul-brun i färgen.
- Värme denna lösning vid 105 ° C under omrörning för 1-2 h. En gul solid kommer att fälla ut ur lösningen. När inga fler fällningen synbart former, ta bort från värmen.
- Tillåta reaktionsblandningen att svalna till rumstemperatur och placera i ett isbad för 0 ° C för 10 min. samla gula fast av dammsugarfilter och tvätta med 5 mL etanol och dietyleter.
- Lös helt rå produkten i 15-25 mL hett vatten. Chill 10 mL av en koncentrerad HCl-lösning i en filterkolv genom att placera den i ett isbad. Filtrera gula lösningen till den kylda HCl-lösningen att inducera utfällning av en blek gul ren solid. Filtrera denna utfällning och tvätta med 5 mL varje 0,5 M HCl, etanol och eter.
- Karakterisera den sammansatta med IR spektroskopi. Kontrollera renhet genom identifiering av stretching frekvenser på 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 och 801 cm -1. En gemensam mindre förorening på 2069 cm -1 har tilldelats [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
- Lös 1,00 g RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru viktprocent, 4,1 mmol) i 5 mL H 2 O. Cool mörk brun lösningen till 0 ° C i ett isbad. Lägg till 11 mL (0.23 mol) 80% hydrazin hydrat lösning på ett droppvis sätt. Den första reaktionen blir kraftig med evolution gas, vilket resulterar i en brun lösning. Låt den färdiga lösningen rör vid rumstemperatur för 16 h; den slutliga lösningen blir mörka red.
- Syntes av [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- Lös 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 i 50 mL 1 M NH 4 OH i en 200 mL tung vägg-rundbottnad tryckkärl. Löst cap kolven med en propp och värm reaktionsblandningen vid 75 ° C i 6 h. ta bort från värmen och rör i rumstemperatur i 4 dagar för att ge en mörkgrön lösning.
Försiktighet! Värme en förseglad fartyg resulterar i en tryckuppbyggnad. Se till att använda lämpliga påtryckningar-safe glasvaror. För denna reaktion är syftet med tätning fartyget att minimera förlust av gasformiga NH 3. Därför lägger proppen löst för att möjliggöra utsläpp av övertryck.
- Lös 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 i 50 mL 1 M NH 4 OH i en 200 mL tung vägg-rundbottnad tryckkärl. Löst cap kolven med en propp och värm reaktionsblandningen vid 75 ° C i 6 h. ta bort från värmen och rör i rumstemperatur i 4 dagar för att ge en mörkgrön lösning.
- Rening genom katjon-exchange kromatografi
- i en glasbägare på 25 mL, upphäva 5 g katjonbytarmassa (t.ex. Dowex 50WX2 200-400 mesh (H + formulär) i 10 mL 0,1 M HCl.
- Ladda detta slam i en 10 mL-kolumn (10 mm diameter, höjd 15 cm) fästs med en 50 mL vätska reservoar. Tvätta kådan med ca 20-30 mL 0,1 M HCl, tills eluatet är färglös.
- Tillbaka till den gröna reaktion lösning isolerade i steg 1.2.1. Denna lösning, tillsätt koncentrerad HCl för att justera pH till 2, varvid lösningen färgen ändras till brunt.
- Ladda denna surgjord lösning till katjon-harts Jonbytarkolonnen bereddes i steg 1.3.2 av försiktigt pipettering det ovanpå jonbytaren. Låt eluatet helt rinna, och fortsätta fylla på lösningen. Upprepa denna process tills hela lösningen har lagts till. Toppen av kådan blir mörk brun/svart. Kådan kommer att minska i volym något.
- Användning glaspärlor att täcka toppen av kådan. Dessa förhindrar att kådan bli störda när nya lösningar läggs.
- Eluera kolumnen med 20 mL 1 M HCl.
- Eluera kolonnen med en ökad HCl-koncentration av 1,5 M (≈ 50 mL). En gul lösning börjar lossna kolumnen. Öka den HCl-koncentrationen till 2 M och fortsätta eluering tills eluatet är färglös eller en mycket blek grön-gul. En total volym på 150-200 mL kommer att krävas för denna process.
- Öka den HCl-koncentrationen till 2,5 M (20-50 mL). Samla eluatet som fraktioner i provrör. Öka till 3 M HCl. Produkten kommer att eluera från kolumnen som en grön-brun lösning. En röd-brun bråkdel kan också börja komma bort kolumnen. Dessa fraktioner är oxiderat rutenium röd orenheter, inte pool med grön-brun fraktioner.
- Karakterisering och verifiering av renhet [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- testa alla fraktioner från steg 1.3.8. av UV-vis-spektroskopi. Att utföra denna uppgift, tillsätt 100 µL av en given bråkdel i 2 mL 3 M NH3 och analysera av UV-vis-spektroskopi. Fraktioner som innehåller ren produkt kommer att ha ett stort absorbansen band på 360 nm och en mindre intensiv absorbans på 600 nm. Absorbansen vid 480 eller 533 nm är indikativt för oxiderade rutenium röd och rutenium röd orenheter, respektive.
- Pool fraktioner som innehåller ren produkt och Indunsta till torrhet genom roterande avdunstning. Produkten kommer att vara isolerad som en grön-brun solid. Avkastningen är vanligtvis storleksordningen 5-15 mg (10-20% avkastning). Singel-kristaller, lämplig för röntgendiffraktion, kan erhållas genom vapor diffusion av etanol i vattenlösningar av sammansatta.
- Att kontrollera renhet, analysera föreningen genom UV-vis spektroskopi i en lösning av pH 7,4 fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Renhet kan bedömas genom att förhållandet mellan intensiteten av 360 nm och 600 nm toppar. Detta förhållande är 31 ren förening. För oren föreningar, förhållandet blir mindre.
- Analysera provet i den solid-state genom IR spektroskopi. Diagnostiska band är på 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 och 815 cm -1. Vanliga föroreningar band ses på 1762 cm -1 och 1400 cm -1, kännetecknar NH 4 Cl. rutenium röd kan identifieras genom band 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 och 800 cm -1.
- Utvärdering av mitokondriell kalcium upptag hämning av fluorescens-spektroskopi
försiktighet! Följande procedurer använder däggdjursceller. Arbetet bör utföras i lämplig laminär huvor som är certifierade för biologisk säkerhet nivå 2 (BSL2) forskning.
Obs: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 kommer att benämnas [Ru] i detta avsnitt- göra buffrad glukos-innehållande koksaltlösning (BGSS) som assay media. BGSS är en lösning som består av 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES), 5 mM natrium succinat, 30 µM etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tetraacetic acid (EGTA). Kombinera allt utom EGTA, justera pH till 7,4. Lägg till EGTA och justera pH till 7,4. Lägg till 0,5 mL av 1 mg/mL glukos för 50 mL assay media.
- Kultur HeLa cells i 500 cm 2 petriskålar i Dulbecco ' s ändrad Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) i en fuktad inkubator med 5% CO 2 vid 37 ° C. förstärka HeLa celler växer i en 100 mm petriskål av sådd dem i en 500 cm 2 petriskål. Den totala media i den stora skålen är 115 mL. Varje stor skålen kommer att ge cirka 18 miljoner celler, nog för två fluorescens-spektroskopi experiment.
- Odla cellerna tills de når 90-95% confluency. Ta bort media och skölj cellerna med 15 mL pH 7,4 PBS. Tillsätt 15 mL av 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i PBS och inkubera i 10 min till lossa cellerna. Överföra cellerna till 14 mL rund botten falcon rören
- räkna celler med trypan blå och en hemocytometer med ett inverterat Mikroskop, och beräkna det totala antalet celler och volymen av media som behövs för att nå 7,5 miljoner celler per 1,8 mL volym medium. Centrifugera cellerna för 10 min vid 5310 × g. Dekantera supernatanten och lägga till den beräknade volymen BGSS. Återsuspendera cellerna försiktigt.
- För denna analys, förbereda stamlösningar av 40 mM digitonin i dimetyl sulfoxid (DMSO), 1 mM kalcium Green-5N i H 2 O och 10 mM CaCl 2 i H 2 O. [Ru] stamlösningar, beredd i rent vatten, kan variera från 1-3 mM.
Obs: kalcium Green-5N är ljuskänsliga. Förvaras mörkt och minimera ljusexponering.
- För denna analys, förbereda stamlösningar av 40 mM digitonin i dimetyl sulfoxid (DMSO), 1 mM kalcium Green-5N i H 2 O och 10 mM CaCl 2 i H 2 O. [Ru] stamlösningar, beredd i rent vatten, kan variera från 1-3 mM.
- Setup fluorimeter för att excitera på 506 nm och Läs utsläpp på 532 nm med innehavaren av kyvetten-kontrollerade vid 37 ° C. förbereda en akryl kyvetten med en uppståndelse bar eller hjul, 1,8 mL cellsuspension från 1.5.2 ovan, 1,8 µL digitonin lösning, 3.6 & #181. L kalcium Green-5N (lösning) och 9 µL [Ru] (för 1 mM stamlösning, 5 µM slutlig koncentration). Inkubera cellerna i 15 min i fluorimeter.
- Läsa data som magnetisering/utsläpp förhållandet i stället för råa absorptionen. Denna praxis minimerar fel i samband med fluktuationer i ljuskälla intensitet.
- Genomföra den första prov analysen i avsaknad av [Ru] att mäta effekten av tillägg av CaCl 2 på svaret av cellerna.
- Börja analys på fluorimeter med inställningarna som beskrivs i 1.5.4. Vänta cirka 2 minuter för att etablera en stabil utsläpp originalplan och sedan lägga 1,8 µL av CaCl 2 (10 µM slutlig koncentration). Utsläpp intensiteten ökar omedelbart vid tillägg av CaCl 2, och sedan sönderfaller under loppet av minuter som kalciumjonerna in mitokondrierna. Vänta tills förfalla är klar (≈ 5 min). Lägg till ytterligare kalcium bolusar för att avgöra den mitokondriella kalcium upptag Svaren av celler som inte behandlas med [Ru].
- i en annan kyvetten innehållande 5 µM [Ru], upprepa experimentet som beskrivs ovan i 1.5.4.3. I närvaro av hämmaren, kommer utsläpp intensitet öka, men inte förfalla. Denna observation betyder blockerad mitokondriell kalcium upptag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod beskriver en syntes av mitokondriell kalcium upptag hämmare [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 start från [Ru (NH3)5Cl] Cl2, en välkända ruthenium(III) utgångsmaterial. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 kännetecknas av IR spektroskopi, med vibrations lägen på 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1och 798 cm-1 (figur 1). En mindre förorening på 2069 cm-1 kan tillskrivas [Ru (NH3)5N2] Cl3. Reaktionen av Ru(III) arten med 1 M NH4OH ger [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. Utvecklingen av denna reaktion framgår av en dramatisk förändring i färgen på lösningen från gult till grönt. Den slutliga reaktion lösningen är mörkgröna i färgen. Försurning av denna lösning med koncentrerad HCl resulterar i en färgförändring till brun; en biprodukt av detta neutralisering är ammoniumklorid, som kan förorena den slutliga produkten om vård inte utnyttjas. Rening av föreningen intäkter via katjon-exchange kromatografi använda starkt sura mesh (H+ formulär) harts. Kådan är utjämnad först med 0.10 M HCl, och lösningen av [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 läses på kolumnen. Den ammoniumklorid biprodukt eluerar med upp 1 M HCl sköljvattnet. Rutenium-innehållande föreningar eluera vid högre HCl koncentrationer. En rad gula fraktioner, som innehåller oreagerad [Ru (NH3)5Cl] Cl2 utgångsmaterial, komma bort kolumnen när den HCl-koncentrationen är 1,5 M. Önskad produkt eluerar mellan 2,5-3,0 M HCl, och de resulterande fraktionerna visas grön till grön-brun i färgen.
Innan sammanslagning fraktioner av produkten, bör deras renhet kontrolleras. Eftersom den önskvärda föreningen uppvisar vissa pH-beroende i dess UV-vis-spektrum, föreslår vi att lägga till små delprover av fraktioner i mycket grundläggande 3 M NH3 lösningar för att säkerställa att de spektrala funktionerna är desamma för alla fraktioner. Rena fraktioner ska bara visa en intensiv topp på 360 nm och en svag topp på 600 nm (figur 2). Toppar nära 480 och 533 nm indikera närvaron av rutenium brunt och rött, respektive, och en betydande peak på 260 nm, med en axel på 290 nm, betecknar närvaron av [Ru (NH3)5Cl] Cl2 utgångsmaterial (figur 3 ). Roterande avdunstning av rena fraktioner ger den önskvärda föreningen som en grön-brun solid.
Den isolera föreningen kan ytterligare karakteriseras av både UV-vis- och IR-spektroskopi. UV-vis spektrumet (figur 2) visar 360 nm och 600 nm absorbansen band som beskrivs ovan. Utrotning koefficienten för 600 nm bandet är 850 M-1cm-1 och för 360 nm bandet är 27000 M-1cm-1. Förhållandet av intensiteten av 360 nm bandet jämfört med 600 nm bandet bör vara 31 i pH 7,4 PBS och detta mått kan effektivt användas för att mäta renheten av föreningen. Det IR-spektrumet bör visas som visas i figur 4. Ru-O-Ru stretching frekvens, är exempelvis diagnostiska på 850 cm-1. Det IR-spektrumet var anställd att bestämma Ru-O-Ru sträckan och se till att inga ammoniumklorid var närvarande i den slutliga produkten. Ammoniumklorid, en gemensam orenhet, har vibrations lägen på 1762 cm-1 (mycket svag) och 1400 cm-1 (stark) som lätt kan urskiljas från det IR-spektrumet (figur 5). Rutenium röd är en gemensam biprodukt av reaktionen och kan identifieras i IR spectrum med sträckor på 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 och 800 cm-1, även om vissa överlappar med önskad produkt kommer att inträffa) (Se figur 6).
Kalcium upptag svar i digitonin-permeabilized HeLa celler observeras (figur 7). Asteriskerna visar tillägg av CaCl2 bolusdos. I närvaro av [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] observeras Cl5 en ökning av utsläpp intensitet vid kalcium tillskott, men ingen förfall på grund av mitokondriell kalcium upptag observeras.
Figur 1 : Infraröda spektra av [Ru (NH3)5Cl] Cl2. De infraröda spektra av [Ru (NH3)5Cl] Cl2 med en mycket liten [Ru (NH3)5N2] Cl3 förorening. Den röda pilen anger föroreningar på 2.069 cm-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representant UV-vis spektra för rent materiellt. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 UV-vis absorbansen spectra och nära infraröd (infälld) tas i pH 7,4 PBS. Utrotning koefficienten för stora absorbansen vid 360 nm är 27.000 M-1 cm-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : UV-vis spektra av rå reaktionsblandningen. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 UV-vis absorbansen spektra av rå reaktionsblandningen innan rening i pH 7,4 PBS. De röda pilarna visar vanliga orenheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa infraröda spektra för rent materiellt. De infraröda spektra av [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. Ru-O-Ru sträckan är på 850 cm-1, de andra sträckorna från NH3 oscillatorerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/>
Figur 5 : Infraröda spektra innehållande NH4Cl orenheter. De infraröda spektra av [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 med ammoniumklorid orenhet. Den röda pilen anger ammoniumklorid på 1 400 cm-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Infraröda spektra av kommersiella rutenium red. Det infraröda spektrumet av [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 (svart trace) och kommersiella rutenium röd (röd trace). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Representativa kalcium upptag resultat. Fluorescens ökningen på grund av tillägg av kalcium för en cocktail av digitonin-permeabilized HeLa cells, kalcium Green-5N och [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 i BGSS. Tomrummet innehåller inga [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 och fluorescens minskning på grund av Ca2 + upptag i mitokondrierna kan ses. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mitokondriella kalcium upptag hämmare [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 kan syntetiseras från [Ru (NH3)5Cl] Cl2, en välkänd ruthenium(III) utgångsmaterial, som beskrivs i proceduren. Syntesen av [Ru (NH3)5Cl] Cl2 uppnås lätt med lite svårighet. Efter omrörning RuCl3 för 16 h i hydrazin återfukta, pH i lösningen bör justeras till ett värde av 2 med HCl. PH drop är avgörande för att uppnå önskad produkt. Om så önskas kan denna syntes ändras till form [Ru (NH3)5Br] Br2 av refluxing i HBr i stället för HCl.
Vi har observerat några strategier för att minimera bildandet av oönskade biprodukter under syntesen av den mitokondriella kalcium upptag-hämmaren. Noterbart är att hålla kolven utjämnade kritiska till framgång för denna reaktion; om kolven är öppen, bildas ett antal andra biprodukter, inklusive rutenium röd (RuRed), i några betydande kvantiteter. Förmodligen, gasformig ammoniak förloras från öppna reaktionskärlet och denna händelse kompromisser bildandet av önskad produkt. Storleken på kolven och volymen av vattenfasen ammoniak är också viktiga parametrar som inte ska ändras avsevärt från de som beskrivs i detta protokoll, som vi har märkt att effektiviteten i denna reaktion är minskat i mindre flaskor. Denna metod öka inte drastiskt avkastningen av denna förening i jämförelse med de andra två metoderna som vi hade tidigare avslöjat. Det gör, dock innehåller färre steg och ge upphov till mindre sida produkt-formation, såsom RuRed. Den låga avkastningen kan tillskrivas närvaron av en liten mängd oreagerad [Ru (NH3)5Cl] Cl2 samt okänd laddad orenheter som finns kvar överst i kolumnen. Vi inte har utforskat många ytterligare reaktion villkor, är det möjligt att förbättringar kan förverkligas genom att variera reaktionstiden och reaktant koncentrationer, att erhålla högre avkastning.
Rening av [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 är de mest tråkiga och svåra delen av detta protokoll. En väl packad kolonn kommer att kraftigt bidra vid separation; lastning kådan som flytgödsel är ett effektivt tillvägagångssätt att packa kolumnen. Det bör noteras att när den HCl-koncentrationen ökas under loppet av den kolumn elueringen, harts kommer att krympa i storlek. För att framgångsrikt få rent materiellt, bör den hastighet vid vilken syra koncentrationen ökas inte avvika från det angivna förfarandet. Slutprodukten kommer att vara en grön-brun solid; en grundläggande lösning blir mörkt grön men sura lösningar kommer att vara brun. Om en ljust rosa-röd-lösning observeras, är rutenium röd föroreningar närvarande. Mängden RuRed kan bestämmas med hjälp av extinktionskoefficient (62 000 M-1·cm-1 på 533 nm). Denna reningsprocess är relativt allmänt för stark katjon-jonbytarkolonnerna harts.
Mitokondriell kalcium upptag hämning kan testas med permeabilized HeLa cells, fluorescerande kalcium sensorn kalcium Green-5N och en Spektrofluorometer. 13 , 14 denna analys kräver en stor mängd celler och därför kräver förstärkning av kulturen i en mycket stor 500 cm2 petriskål. Dessa stora kultur-kolvar förhindra ytterligare utmaningar att minimera mikrobiell kontamination eftersom de exponerade ytor är mycket stora. Arbetet bör utföras i ett laminärt flöde skåp att upprätthålla sterilitet. Fluorescens svaret av kalcium Green-5N i permeabilized HeLa cells övervakas av fluorescens-spektroskopi. Tillägg av en extern bolusdos av kalcium till kyvetten utlöser en omedelbar ökning i fluorescens, som härrör från de kalciumjoner som interagerar med sensorn. Under loppet av flera minuter i avsaknad av en hämmare sönderfaller intensiteten på grund av upptag av dessa kalciumjoner i mitokondrierna, en organell som inte kan nås av färgämnet. När denna analys utförs i närvaro av en hämmare tillägg av en bolusdos av kalciumjoner ger upphov till en ökning i utsläppen intensitet. Förfalla på grund av mitokondriell kalcium upptag, är dock inte närvarande, verifiera mitokondriell kalcium upptag hämmande egenskaper av denna förening. Denna process kan användas som en allmän skärm för kalcium upptag-hämmare. Dessutom kan detta förfarande tillämpas på andra eukaryota celler av intresse. Denna analys beror på permeabiliseringen av den yttre cellulära membran vilket ger inte information om cellernas upptag möjligheten av ett komplex.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll syntes och rening av en roman rutenium-baserade mitokondriell kalcium upptag-hämmare. Denna förening är av betydande värde för att studera biologi mitokondriell kalcium och dess roll i fysiologi på däggdjursceller. Relativt enkla analysen för testning mitokondriell kalcium upptag är också användning för screening och utredning av nya hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Cornell University. Detta arbete har använt Cornell centrum för material forskning delade faciliteter, som stöds genom programmet NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. erkänner stöd av en NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) och Dr Dave Holowka för hjälp med kalcium experimenten. Någon åsikt, resultaten och slutsatserna eller rekommendationerna uttryckt i detta material är författarnas (s) och återspeglar inte nödvändigtvis åsikter National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
