Summary
Un protocole pour la synthèse, purification et caractérisation d’un inhibiteur de ruthénium-basée de la capture de calcium mitochondrique est présenté. Une procédure pour évaluer son efficacité dans les cellules de mammifères perméabilisées est démontrée.
Abstract
Nous détaillons la synthèse et la purification d’un inhibiteur de l’absorption de calcium mitochondrique, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]5 +. La synthèse optimisée de ce composé commence à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 en 1 M NH4OH dans un récipient fermé, ce qui donne une solution verte. Purification s’effectue par chromatographie échangeuse de cations. Ce composé est caractérisé et vérifié comme pure par spectroscopie UV-visible et IR. Les propriétés inhibitrices de l’absorption de calcium mitochondrique sont évaluées dans les cellules HeLa perméabilisées par spectroscopie de fluorescence.
Introduction
Le calcium mitochondrique est un régulateur clé pour un certain nombre de processus qui sont essentielles à la fonction des cellules normales, y compris la production d’énergie et de l’apoptose. 1 , 2 , 3 le calcium mitochondrique Uniport (MCU), une protéine de transport des ions qui se trouve dans la membrane mitochondriale interne, réglemente l’influx des ions calcium dans les mitochondries. 4 , 5 , 6 les inhibiteurs chimiques de la MCU sont des outils précieux pour la poursuite des efforts pour étudier la fonction et les rôles cellulaires de ce transport des protéines et le calcium mitochondrique. Le composé [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, est un des seuls inhibiteurs sélectifs connus pour le MCU avec une valeur déclarée ded K de 24 µM.7 ,8,9,10 , ce complexe est une impureté commune trouvée dans les formulations commerciales de rouge de ruthénium (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo ponté hexacation de la formule [(NH3) 5 RU (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, qui a également été utilisé comme un inhibiteur de l’absorption du calcium. Ru360 est disponible dans le commerce, mais il est très coûteux. En outre, la synthèse et l’isolement des Ru360 est contestée par les procédures de purification difficile et méthodes de caractérisation ambiguë.
Nous avons récemment rapporté les procédures alternatives pour accéder à un Ru360 analogique, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 ce composé inhibe la MCU avec l’affinité élevée, similaire à Ru360. Dans ce protocole, nous décrirons notre synthèse plus efficace de ce composé, qui commence à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purification du produit à l’aide de résine échangeuse de cations fortement acide est détaillée, ainsi que les pièges communs pour cette procédure. Aussi, nous présentons des méthodes de caractérisation et d’évaluation de pureté composée et délimiter une approche simple pour tester son efficacité en bloquant l’absorption calcique mitochondriale.
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Protocol
Remarque : acides concentrés et bases sont utilisées dans la présente synthèse. Utilisez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution de la réaction, y compris l’utilisation des contrôles d’ingénierie (hotte aspirante) et équipement de protection individuelle (EPI) y compris les lunettes de protection, gants, blouse, pleine longueur pantalons et chaussures fermées.
1. préparation de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- synthèse de Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12
- dissoudre 1,00 g RuCl 3 · n H 2 O (40 % Ru en poids, 4,1 mmol) dans 5 mL d’H 2 O. Cool la solution brune foncée à 0 ° C dans un bain de glace. Ajouter 11 mL (0,23 mol) de solution de l’hydrate d’hydrazine de 80 % d’une manière goutte à goutte. La réaction initiale sera vigoureuse avec le gaz evolution, donnant lieu à une solution brune. Laissez la solution obtenue à remuer à température ambiante pendant 16 h ; la solution finale sera rouge foncé
ATTENTION : L’Hydrazine est extrêmement toxiques et cancérigènes. En outre, les formes anhydres de ce réactif sont explosifs. Comme toujours, utilisez appropriés hottes PPE et fumées lors de la manipulation. Pas concentrer ces solutions jusqu'à siccité. - à cette solution, ajouter environ 5-10 mL d’HCl concentré pour ajuster le pH à 2. À ce stade, la solution sera jaune-brun couleur.
- Chauffer cette solution à 105 ° C sous agitation pendant 1-2 h. Un solide jaune va précipiter hors de la solution. Quand aucuns plus ne précipitent visiblement formes, retirer du feu.
- Laisser le mélange refroidir à la température ambiante, et place ensuite dans un bain de glace de 0 ° C pendant 10 min. recueillir le solide jaune de filtration sous vide et lavage avec 5 mL chacun de l’éthanol et l’éther diéthylique.
- Dissoudre complètement le produit brut de 15 à 25 mL d’eau chaude. Réfrigérer 10 mL d’une solution de HCl concentrée dans une fiole de filtre en le plaçant dans un bain de glace. Filtrer la solution jaune dans la solution de HCl réfrigérée pour induire la précipitation d’un solide pur jaune pâle. Filtrer ce précipité et laver avec 5 mL d’HCl 0,5 M, l’éthanol et l’éther.
- Caractériser les composés en utilisant la spectroscopie IR. Vérifier la pureté de l’identification des fréquences d’élongation à 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 et 801 cm -1. Une souillure mineure commun à 2069 cm -1 est affectée à [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
- dissoudre 1,00 g RuCl 3 · n H 2 O (40 % Ru en poids, 4,1 mmol) dans 5 mL d’H 2 O. Cool la solution brune foncée à 0 ° C dans un bain de glace. Ajouter 11 mL (0,23 mol) de solution de l’hydrate d’hydrazine de 80 % d’une manière goutte à goutte. La réaction initiale sera vigoureuse avec le gaz evolution, donnant lieu à une solution brune. Laissez la solution obtenue à remuer à température ambiante pendant 16 h ; la solution finale sera rouge foncé
- Synthèse de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- dissoudre 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 dans 50 mL de 1 M NH 4 OH dans un récipient à pression à fond rond 200 mL paroi épaisse. Vaguement Boucher le ballon avec un bouchon et chauffer le mélange réactionnel à 75 ° C pendant 6 h. retirer du feu et remuer à température ambiante pendant 4 jours obtenir une solution de vert foncée.
Mise en garde ! Chauffage un résultats de navire scellé dans une montée en pression. Veillez à utiliser de verrerie de pression-coffre fort approprié. Pour cette réaction, l’étanchéité du navire vise à minimiser la perte de gazeux NH 3. Par conséquent, placez le bouchon vaguement afin de permettre la libération d’une pression excessive.
- dissoudre 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 dans 50 mL de 1 M NH 4 OH dans un récipient à pression à fond rond 200 mL paroi épaisse. Vaguement Boucher le ballon avec un bouchon et chauffer le mélange réactionnel à 75 ° C pendant 6 h. retirer du feu et remuer à température ambiante pendant 4 jours obtenir une solution de vert foncée.
- Purification par chromatographie échangeuse de cations
- dans un bécher de 25 mL, suspendre la résine échangeuse de cations g 5 (p. ex., Dowex 50WX2 200-400 de maille (forme H +) dans 10 mL 0,1 M HCl.
- Charger ce coulis dans une colonne de 10 mL (10 mm de diamètre, hauteur 15 cm) munie d’un réservoir de solvant 50 mL. Laver la résine avec environ 20-30 mL de HCl de 0,1 M, jusqu'à ce que l’éluat soit incolore.
- Retour à la solution de réaction vert isolée à l’étape 1.2.1. Ajouter à cette solution, HCl concentré pour ajuster le pH à 2, à quel point la couleur de la solution passe au brun.
- Charger cette solution acidifiée à la colonne de résine échangeuse de cations préparée à l’étape 1.3.2 par pipetage il doucement sur le dessus de la résine. Laissez l’éluat complètement vidanger et poursuivre le chargement de la solution. Répétez ce processus jusqu'à ce que l’ensemble de la solution a été ajouté. La partie supérieure de la résine sera brun foncé/noir. La résine va diminuer en volume légèrement.
- Perles de verre utilisation pour couvrir la partie supérieure de la résine. Ils empêcheront la résine d’être dérangé en nouvelles solutions sont ajoutées.
- Éluer la colonne avec 20 mL de 1 HCl de M.
- Éluer la colonne avec une concentration accrue de HCl de 1,5 M (≈ 50 mL). Une solution jaune commence à se détacher de la colonne. Augmenter la concentration de HCl à 2 M et continuer à élution jusqu'à ce que l’éluat soit incolore ou jaune-vert très pâle. Un volume total de 150-200 mL sera nécessaire pour ce processus.
- Augmenter la concentration de HCl à 2,5 M (20 à 50 mL). Recueillir l’éluat sous forme de fractions dans des éprouvettes. Augmenter à 3 M HCl. Le produit va éluer de la colonne comme une solution de vert-brun. Une fraction de brun-rouge peut également commencer à se détacher de la colonne. Comme ces fractions sont les impuretés oxydées rouge de ruthénium, ne pas en commun avec les fractions de brun-vert.
- Caractérisation et la vérification de la pureté de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- tester toutes les fractions de étape 1.3.8. par spectroscopie UV-visible. Pour accomplir cette tâche, ajouter 100 µL d’une fraction donnée dans 2 mL de 3 M NH3 et analyser par spectroscopie UV-visible. Les fractions contenant pur produit aura une bande large absorbance à 360 nm et une moins forte absorbance à 600 nm. Absorbance à 480 ou 533 nm est révélateur oxydé rouge de ruthénium et d’impuretés rouge de ruthénium, respectivement.
- Fractions contenant le pur produit de la piscine et évaporer à sec évaporateur rotatif. Le produit sera isolé comme un solide brun-vert. Les rendements sont en général l’ordre de 5 à 15 mg (taux de rendement de 10 à 20 %). Single-crystals, convenant de la diffraction des rayons x, peuvent être obtenues par la diffusion de la vapeur de l’éthanol dans les solutions aqueuses du composé.
- Pour vérifier la pureté, analyser le composé par spectroscopie UV-visible dans une solution de pH 7,4 tampon phosphate salin (PBS). Pureté peut être évaluée en prenant le ratio d’intensité de la 360 nm et 600 nm pics. Ce ratio est 31 pour un composé pur. Pour les composés impurs, le ratio sera plus petit.
- Analyser l’échantillon à l’état solide par spectroscopie infrarouge. Bandes diagnostiques sont à 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, cm 1313 -1 et 815 cm -1. Bandes d’impureté commune sont vus à 1762 cm -1 et 1 400 cm -1, caractéristique du NH 4 rouge de ruthénium de CL peuvent être identifiés par bandes à 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 et 800 cm -1.
- Évaluation de l’inhibition de l’absorption de calcium mitochondrial par spectroscopie de fluorescence
attention ! Les procédures suivantes utilisent les cellules de mammifères. Travaux devrait être effectués dans les hottes à flux laminaire appropriées qui sont certifiées pour une enceinte de sécurité biologique de niveau 2 (BSL2) recherche.
Remarque : [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 sera être dénommé comme [Ru] dans la présente section- marque tamponnée contenant du glucose du sérum physiologique (BGSS) les médias de dosage. BGSS est une solution composée de 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4 d’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), succinate sodique de 5 mM, 110 mM KCl, 30 µM éthylène glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tétraacétique (EGTA). Combinez tout sauf l’EGTA, ajuster le pH à 7,4. Ajouter EGTA et réajuster le pH à 7,4. 50 ml de médias de dosage ajouter 0,5 mL de glucose 1 mg/mL.
- Cellules HeLa culture en 500 cm 2 boîtes de Pétri dans Dulbecco ' s Modified Eagle moyenne (DMEM) avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO 2 à des cellules de C. amplifier HeLa ° 37 par ensemencement de plus en plus dans une boîte de Pétri de 100 mm les dans un plat de Pétri de 2 500 cm. Le volume total des médias dans le grand plat est 115 mL. Chaque grand plat produira environ 18 millions cellules, assez pour deux expériences de spectroscopie de fluorescence.
- Poussent les cellules jusqu'à ce qu’ils atteignent 90-95 % confluency. Retirez les supports et rincer les cellules avec 15 mL pH 7,4 PBS. Ajouter 15 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM dans du PBS et incuber pendant 10 min détacher les cellules. Les cellules de transfert à 14 mL tubes falcon bas
- compter les cellules en utilisant le bleu trypan et un hémocytomètre avec un microscope inversé et calculer le nombre total de cellules et le volume des médias nécessaires pour atteindre 7,5 millions de cellules par volume de 1,8 mL du milieu. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 5310 × g. décanter le liquide surnageant et ajouter le volume calculé de BGSS. Remettre en suspension les cellules doucement.
- Pour cet essai, préparer les solutions de la digitonine 40 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), 1 mM vert de Calcium-5N H 2 O, et 10 mM CaCl 2 en H 2 O. [Ru] des solutions mères, préparées dans l’eau pure, peut varier de 1 à 3 mM.
Remarque : Calcium vert-5N est sensible à la lumière. Stocker dans l’obscurité et de minimiser l’exposition à la lumière.
- Pour cet essai, préparer les solutions de la digitonine 40 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), 1 mM vert de Calcium-5N H 2 O, et 10 mM CaCl 2 en H 2 O. [Ru] des solutions mères, préparées dans l’eau pure, peut varier de 1 à 3 mM.
- Setup le fluorimètre pour exciter à 506 nm et lire l’émission à 532 nm avec le porte-cuvette réglé à 37 ° C. préparer une cuve acrylique avec une barre de remuer ou de la roue, suspension de cellules de 1,8 mL de 1.5.2 ci-dessus, 1,8 µL de solution de digitonine, 3.6 & #181 ; Calcium L vert-5N (solution) et 9 µL [Ru] (pour la solution mère de 1 mM, concentration finale de 5 µM). Incuber les cellules pendant 15 min dans le fluorimètre.
- Lire les données comme le ratio de l’excitation/émission au lieu de l’absorption de raw. Cette pratique minimise les erreurs liées aux fluctuations de l’intensité de la source lumineuse.
- Effectuer la première analyse de l’échantillon en l’absence de [Ru] pour mesurer l’effet de l’addition de CaCl 2 sur la réponse des cellules.
- Analyse de commencer sur le fluorimètre avec les paramètres décrits au point 1.5.4. Attendez environ 2 minutes pour établir une base d’émission stable et puis ajouter 1,8 µL de CaCl 2 (concentration finale de 10 µM). L’intensité des émissions augmentera immédiatement lors de l’addition du CaCl 2 et décroîtra au cours des minutes alors que les ions de calcium, entrez dans les mitochondries. Attendez que la décomposition se termine (≈ 5 min). Ajouter des bolus de calcium supplémentaire pour déterminer la réponse de l’absorption de calcium mitochondrique de cellules non traitées avec [Ru].
- Dans une autre cuve contenant 5 µM [Ru], répéter l’expérience comme décrit ci-dessus dans 1.5.4.3. En présence de l’inhibiteur, intensité d’émission va augmenter, mais pas de désintégration. Cette observation signifie bloqué la capture de calcium mitochondrique.
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Representative Results
Cette méthode décrit une synthèse du calcium mitochondrial absorption inhibiteur [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, une matériel de départ bien connu de ruthénium (III). [Ru (NH3)5Cl] CL2 est caractérisés par spectroscopie IR, avec des modes de vibration à 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1et 798 cm-1 (Figure 1). Une souillure mineure à 2069 cm-1 peut être attribuée aux [Ru (NH3)5N2] Cl3. La réaction de cette espèce de ru avec 1 M NH4OH offre [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. L’état d’avancement de cette réaction se manifeste par un changement radical dans la couleur de la solution du jaune au vert. La solution de réaction finale est vert foncé en couleur. L’acidification de cette solution avec HCl concentré se traduit par un changement de couleur brun ; un sous-produit de cette neutralisation est le chlorure d’ammonium, qui peut contaminer le produit final si les précautions nécessaires ne sont pas prises. Purification du composé se produit par chromatographie échangeuse de cations fortement acide maille (forme H+ ) résine. La résine est équilibrée tout d’abord avec 0,10 M HCl et la solution de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 est chargée sur la colonne. Le sous-produit de chlorure d’ammonium élué avec les lavages de HCl 1 M. Composés contenant du ruthénium éluent à des concentrations plus élevées de HCl. Une série de fractions jaunes, qui contiennent n’ayant pas réagi [Ru (NH3)5Cl] Cl2 matériel de départ, se détacher de la colonne lorsque la concentration de HCl est de 1,5 M. Le produit désiré élue entre 2,5 à 3,0 M HCl et les fractions qui en résultent apparaissent vertes de couleur vert-brun.
Avant de mettre en commun les fractions du produit, leur pureté doit être vérifiée. Parce que le composé désiré expose certains pH-dépendance dans le spectre UV-visible, nous suggérons d’ajouter de petites parties aliquotes des fractions à très basiques NH3 les solutions 3M pour s’assurer que les caractéristiques spectrales sont les mêmes pour toutes les fractions. Fractions de pures seulement arborer un pic intense à 360 nm et une faible crête à 600 nm (Figure 2). Crêtes près de 480 et 533 nm indiquent la présence de ruthénium brun et rouge, respectivement et un pic significatif à 260 nm, avec un épaulement à 290 nm, signifie la présence de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 à partir de matériau (Figure 3 ). Évaporateur rotatif des fractions pures fournit le composé désiré comme un solide brun-vert.
Le composé isolé peut encore être caractérisé par spectroscopie UV-visible et IR fois. L’UV-visible du spectre (Figure 2) affiche la 360 nm et 600 bandes d’absorption nm comme décrit ci-dessus. Le coefficient d’extinction pour la bande à 600 nm est de 850 M-1cm-1 et pour la bande à 360 nm 27000 M-1cm-1. Le rapport de l’intensité de la bande à 360 nm par rapport à la bande à 600 nm doit être 31 dans du PBS pH 7,4, et cette mesure peut servir efficacement afin d’évaluer la pureté du composé. Le spectre IR doit apparaître comme indiqué dans la Figure 4. La fréquence d’élongation O-Ru-Ru, par exemple, est diagnostique à 850 cm-1. Le spectre IR a été employé pour déterminer la portion de Ru-O-Ru et pour assurer que sans chlorure d’ammonium était présent dans le produit final. Chlorure d’ammonium, une impureté commune, a des modes de vibration à 1762 cm-1 (très faible) et 1400 cm-1 (fort) qui peut être facilement discerné du spectre IR (Figure 5). Le rouge de ruthénium est un sous-produit courant de la réaction et peut être identifié dans le spectre avec des passages à 1404 cm-1IR, 1300 cm-1, 1037 cm-1 et 800 cm-1, même si un certain chevauchement avec le produit désiré se produira) La figure 6).
La réponse de l’absorption de calcium dans les cellules HeLa digitonine-perméabilisées est observée (Figure 7). Les astérisques indiquent l’ajout d’un bolus de2 CaCl. En présence de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 une augmentation de l’intensité des émissions est observée après l’ajout de calcium, mais aucune décomposition en raison de calcium mitochondrique l’absorption est observée.
Figure 1 : Les spectres infrarouges de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Les spectres infrarouges [Ru (NH3)5Cl] Cl2 avec une très petite impureté de3 [Ru (NH3)5N2] Cl. La flèche rouge indique l’impureté au cm 2 069-1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Spectres représentant UV-vis pour matériel pur. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Spectre d’absorbance CL5 UV-visible et le proche infrarouge (en médaillon) pris dans du PBS pH 7,4. Le coefficient d’extinction pour l’absorbance majeur à 360 nm est de 27 000 M-1 cm-1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Spectres UV-vis du mélange réactionnel brut. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Spectre d’absorbance CL5 UV-vis du mélange réactionnel brut avant la purification pris dans du PBS pH 7,4. Les flèches rouges indiquent les impuretés courantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Des spectres infrarouges représentatifs pour matériel pur. Les spectres infrarouges de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. Le tronçon de Ru-O-Ru est à 850 cm-1, les autres tronçons sont des oscillateurs NH3 . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Figure 5 : Les spectres infrarouges contenant des impuretés de NH4Cl. Les spectres infrarouges de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 avec addition de chlorure d’ammonium. La flèche rouge indique le chlorure d’ammonium à 1 400 cm-1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Les spectres infrarouges de rouge de ruthénium commercial Le spectre infrarouge de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 (trace noire) et le rouge de ruthénium commerciale (trace rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Résultats de l’absorption calcique représentatif. L’augmentation de la fluorescence en raison de l’ajout de calcium à un cocktail de digitonine-perméabilisées les cellules HeLa, Calcium vert-5N et [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 dans BGSS. Le vide contient pas [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 et diminution de la fluorescence due à l’absorption de Ca2 + dans les mitochondries sont visibles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le calcium mitochondrial absorption inhibiteur [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 peut être synthétisé de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un bien connu ruthénium à partir de matériel, tel que décrit dans cette procédure. La synthèse de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 est facilement atteint sans trop de difficulté. Après agitation RuCl3 pendant 16 h dans l’hydrazine hydrate, le pH de la solution doit être ajusté à une valeur de 2 avec du HCl. La baisse de pH est essentielle pour réaliser le produit désiré. Si vous le souhaitez, cette synthèse peut être modifiée pour forme [Ru (NH3)5Br] Br2 par reflux dans HBr au lieu de HCl.
Nous avons observé certaines stratégies pour minimiser la formation de sous-produits indésirables lors de la synthèse de l’inhibiteur de l’absorption de calcium mitochondrique. Notamment, garder le ballon plafonné est essentielle à la réussite de cette réaction ; Si le flacon est ouvert, un certain nombre d’autres sous-produits, y compris le rouge de ruthénium (RuRed), se forment en quantités appréciables. L’ammoniac gazeux est probablement perdu de la cuve ouverte et cette formation de compromis événement du produit souhaité. La taille du ballon et le volume de solution ammoniacale sont également des paramètres importants qui ne doivent être modifiés sensiblement de celles décrites dans le présent protocole, comme nous avons remarqué que l’efficacité de cette réaction est diminuée dans des flacons plus petits. Cette méthode n’augmente pas considérablement le rendement de ce composé en comparaison avec les deux autres méthodes, que nous avions mentionné précédemment. Il fait, cependant, contiennent moins d’étapes et donnent lieu à moins formation des produits secondaires, tels que RuRed. Le faible rendement peut être attribué à la présence d’une petite quantité d’inaltéré [Ru (NH3)5Cl] Cl2 comme inconnu fortement chargée des impuretés qui sont conservées dans la partie supérieure de la colonne. Bien que nous n’avons pas exploré plusieurs conditions de réaction supplémentaire, il est possible que des améliorations peuvent être réalisées en faisant varier le temps de réaction et les concentrations des réactifs, d’obtenir des rendements plus élevés.
La purification de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 est la partie la plus fastidieuse et difficile du présent protocole. Une colonne bien tassée aidera grandement à la séparation ; chargement de la résine dans le lisier est une approche efficace pour emballer la colonne. Il est à noter que lorsque la concentration de HCl est augmentée au cours de l’élution de la colonne, la résine se contractera en taille. Pour obtenir des succès matériel pur, le taux qui augmente la concentration en acide ne doit pas s’écarter de la procédure indiquée. Le produit final sera un solide brun-vert ; une solution de base sera vert foncé mais les solutions acides sera brunes. Si on observe une solution rose-rouge vif, des contaminations de rouge de ruthénium sont présentes. Le montant de RuRed peut être déterminé au moyen du coefficient d’extinction (62 000 M-1·cm-1 533 nm). Ce processus de purification est relativement général pour les colonnes de résine échangeuse de cations forts.
L’inhibition de l’absorption de calcium mitochondrial peut être testée à l’aide de cellules HeLa perméabilisées, la sonde fluorescente calcium Calcium vert-5N et un spectrofluorimeter. 13 , 14 ce test nécessite une grande quantité de cellules et donc nécessiter l’amplification de la culture dans un très grand 500 cm2 boîte de Pétri. Ces flacons de grande culture empêchent des défis supplémentaires en réduisant au minimum la contamination microbienne car les surfaces exposées sont très grandes. Travaux devrait être effectué dans une enceinte à flux laminaire pour maintenir la stérilité. La réponse de fluorescence du vert-5N de Calcium dans les cellules HeLa perméabilisées est surveillée par la spectroscopie de fluorescence. L’ajout d’un bolus externe de calcium à la cupule déclenche une augmentation immédiate de fluorescence, découlent les ions de calcium interagissant avec le capteur. Au cours de plusieurs minutes en l’absence d’un inhibiteur, l’intensité se désintègre en raison de l’absorption de ces ions de calcium dans les mitochondries, un organite qui ne sont pas accessibles par le colorant. Lorsque ce dosage est effectué en présence d’un inhibiteur de l’ajout d’un bolus d’ions calcium donne lieu à une augmentation de l’intensité des émissions. La désintégration due à l’absorption de calcium mitochondrique, cependant, n’est pas présente, vérifiant les propriétés inhibitrices de l’absorption de calcium mitochondrique de ce composé. Ce processus peut servir comme un écran général pour les inhibiteurs de l’absorption de calcium. En outre, cette procédure peut être appliquée à d’autres cellules eucaryotes d’intérêt. Ce test dépend de la perméabilisation de l’outer membrane cellulaire ne fournit donc pas d’informations quant à la capacité d’assimilation d’un complexe.
En résumé, ce protocole décrit la synthèse et la purification d’un inhibiteur de l’absorption de roman calcium mitochondrique axée sur le ruthénium. Ce composé est très utile pour l’étude de la biologie du calcium mitochondrique et son rôle dans la physiologie de la cellule mammifère. L’essai relativement simple pour les tests d’absorption calcique mitochondriale est aussi d’utilisation pour le dépistage et enquête de nouveaux inhibiteurs.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par l’Université Cornell. Ce travail fait usage du centre Cornell pour matériaux recherche Shared Facilities, qui sont pris en charge par le programme NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconnaît la prise en charge par une bourse de recherche universitaire de la NSF (subvention DGE - 1650441) et Dr. Dave Holowka d’assistance avec les expériences de calcium. Opinions, résultats et conclusions ou recommandations exprimées dans ce matériel sont celles de l’auteur (s) et ne reflètent pas nécessairement les vues de la National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
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