Summary
En protokoll for syntese, rensing og karakterisering av en ruthenium-baserte inhibitor for mitokondrie kalsium opptak er presentert. En prosedyre for å vurdere effektiviteten i permeabilized pattedyrceller er demonstrert.
Abstract
Vi detalj syntese og rensing av en et mitokondrie kalsium opptak-hemmer, [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)]5 +. Optimalisert syntesen av dette sammensatte starter fra [Ru (NH3)5Cl] Cl2 i 1 M NH4OH i en lukket beholder, gir en grønn løsning. Rensingen gjøres med cation exchange kromatografi. Denne forbindelsen er preget og bekreftet for å være ren av UV-vis og IR spektroskopi. Mitokondrielt kalsium opptak inhibitoriske egenskaper vurderes i permeabilized HeLa celler av fluorescens spektroskopi.
Introduction
Mitokondrielt kalsium er en viktig regulator for en rekke prosesser som er kritiske til normal celle-funksjonen, inkludert energiproduksjon og apoptose. 1 , 2 , 3 mitokondrie kalsium uniporter (MCU), en ion transporter protein som ligger på den indre mitokondrie membranen, regulerer tilstrømningen av kalsiumioner i mitokondrier. 4 , 5 , 6 kjemiske hemmere av MCU er verdifulle verktøy for kontinuerlig innsats for å studere funksjon og mobilnettet roller til denne transport protein og mitokondrie kalsium. Sammensatte [(HCO2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(O2lm)]3 +, Ru360, er en av de eneste kjente selektiv hemmere mot MCU med rapporterte Kd verdi på 24 µM.7 ,8,9,10 Dette komplekset er en vanlig urenhet i kommersielle formuleringer på ruthenium rød (RuRed), en triruthenium di-μ-oxo bro hexacation av formelen [(NH3) 5 Ru (μ-O) Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +, som har også blitt brukt som en kalsium opptak inhibitor. Men Ru360 er kommersielt tilgjengelig, er det svært kostbare. Videre er syntese og isolering av Ru360 utfordret av vanskelig rensing prosedyrer og tvetydig karakterisering metoder.
Vi har nylig rapportert alternative prosedyrer til en Ru360 analog, [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 denne forbindelsen hemmer MCU med høy affinitet, ligner på Ru360. I denne protokollen, vil vi beskrive våre mest effektive syntese av dette sammensatte, som starter fra [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Rensing av produktet bruker sterkt surt cation exchange harpiks er detaljert, sammen med vanlige fallgruver for denne prosedyren. Vi presentere metoder for karakterisering og vurdering av sammensatte renhet, og avgrense en enkel tilnærming for å teste effektiviteten i blokkering mitokondrie kalsium opptak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: konsentrert syrer og baser brukes i denne tanken. Bruke alle nødvendige sikkerhets praksis når reaksjonen inkludert bruk av engineering kontroller (avtrekksvifte) og personlig verneutstyr (PVU) inkludert vernebriller, hansker, laboratoriefrakk, full lengde bukser og lukket-toe sko.
1. utarbeidelse av [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- syntese av [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
- oppløse 1,00 g av RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru vekt, 4.1 mmol) i 5 mL av H 2 O. Cool mørke brune løsningen 0 ° c i en isbadet. Legge til 11 mL (0,23 mol) 80% hydrazine hydrat løsning på en dropwise måte. Den første reaksjonen vil være energisk med utviklingen gass, noe som resulterer i en brun løsning. La den resulterende løsningen rør ved romtemperatur for 16 h; den endelige løsningen vil være mørk red.
Forsiktig: Hydrazine er akutt giftige og kreftfremkallende. I tillegg er vannfri former for denne reagensen eksplosiv. Som alltid, bruke aktuelle PPE og røyk hetter ved håndtering. Ikke fokusere disse løsningene til tørrhet. - Denne løsningen, legge til ca 5-10 mL konsentrert HCl å justere pH 2. På dette punktet, løsningen vil være gul-brun farge.
- Varme denne løsningen på 105 ° C under omrøring for 1-2 h. En gul solid vil bunnfall ut av løsningen. Når lenger bunnfall synlig skjemaer, Fjern fra varmen.
- Tillate reaksjonsblandingen å avkjøles til romtemperatur, og plasser i en 0 ° C isbadet for 10 min. samle gul solid vakuum filtrering og vask med 5 mL etanol og diethyl ether.
- Løse råolje produktet i 15-25 mL av varmt vann. Chill 10 mL av en konsentrert HCl løsning i et filter kolbe ved å plassere den i en isbadet. Filtrere gule løsningen i kjølt HCl løsningen å indusere nedbør av en blek gul ren solid. Filtrere dette utløse og vask med 5 mL hver 0,5 M HCl, etanol og Eter.
- Karakteriserer den sammensatte bruker IR spektroskopi. Kontroller renhet av identifikasjon av strekker frekvenser på 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 og 801 cm -1. En vanlig mindre urenhet på 2069 cm -1 er tilordnet [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
- oppløse 1,00 g av RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru vekt, 4.1 mmol) i 5 mL av H 2 O. Cool mørke brune løsningen 0 ° c i en isbadet. Legge til 11 mL (0,23 mol) 80% hydrazine hydrat løsning på en dropwise måte. Den første reaksjonen vil være energisk med utviklingen gass, noe som resulterer i en brun løsning. La den resulterende løsningen rør ved romtemperatur for 16 h; den endelige løsningen vil være mørk red.
- Syntese av [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- oppløse 100 mg (0.34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 i 50 mL 1 M NH 4 OH i en 200 mL tunge veggen rund bunn trykktank. Løst cap flasken en propp og varme reaksjonsblandingen ved 75 ° C i 6 h. Fjern fra varmen og rør i romtemperatur i 4 dager til en mørk grønn løsning.
Forsiktig! Varme en forseglet fartøyet resulterer i en trykkoppbygging. Pass på å bruke riktig trykk-safe glass. For denne reaksjonen er formålet med tetting fartøyet å redusere tap av gass NH 3. Derfor, sted stopperen løst å tillate utgivelsen av høyt trykk.
- oppløse 100 mg (0.34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 i 50 mL 1 M NH 4 OH i en 200 mL tunge veggen rund bunn trykktank. Løst cap flasken en propp og varme reaksjonsblandingen ved 75 ° C i 6 h. Fjern fra varmen og rør i romtemperatur i 4 dager til en mørk grønn løsning.
- Rensing av cation exchange kromatografi
- i et 25 mL beaker, suspendere 5 g cation exchange harpiks (f.eks Dowex 50WX2 200-400 nett (H + skjema) i 10 mL 0.1 M HCl.
- Laste denne slurry til en 10 mL kolonne (10 mm diameter, 15 cm høyde) festet med en 50 mL løsemiddel reservoaret. Vask harpiks med ca 20-30 mL av 0.1 M HCl, til eluate er fargeløs.
- Tilbake til grønne reaksjon løsning i trinn 1.2.1. Denne løsningen, legge til konsentrert HCl justerer pH verdien 2, da løsning fargen endres til brun.
- Laste denne sur løsning til kolonnen for cation exchange-harpiks utarbeidet i trinn 1.3.2 av forsiktig pipettering det på harpiks. La eluate helt avløp, og fortsette lessing løsningen. Gjenta denne prosessen til hele løsningen er lagt. Toppen av harpiks blir mørk brun/svart. Harpiks reduseres i volumet litt.
- Bruk glassperler å dekke toppen av harpiks. Dette vil hindre harpiks blir forstyrret når nye løsninger legges.
- Elute kolonnen med 20 mL 1 M HCl.
- Elute kolonnen med en økt HCl konsentrasjon på 1,5 M (≈ 50 mL). En gul løsning vil begynne å komme av kolonnen. Øke HCl konsentrasjonen 2 m og fortsette eluting til eluate er fargeløs eller en blek grønn-gul. Et totalt volum på 150-200 mL vil være nødvendig for denne prosessen.
- Øker HCl konsentrasjonen til 2,5 M (20-50 mL). Samle eluate som brøker i test-rør. Øke til 3 M HCl. Produktet vil elute fra kolonnen som en grønn-brun løsning. En rødbrun brøkdel kan også begynne å komme ut av kolonnen. Som disse fraksjoner er oksidert ruthenium røde urenheter, ikke svømmebasseng med grønn-brun fraksjoner.
- Karakterisering og verifisering av renhet [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- tester alle fraksjoner fra Trinn 1.3.8. av UV-vis spektroskopi. For å oppnå dette, Legg til 100 µL av en bestemt fraksjon i 2 mL av 3 M NH3 og analysere av UV-vis spektroskopi. Brøker som inneholder rent produkt vil ha en stor absorbansen band på 360 nm og en mindre intens absorbans ved 600 nm. Absorbans ved 480 eller 533 nm er et tegn på oksidert ruthenium rød og selskapets røde urenheter, henholdsvis.
- Pool brøker som inneholder rent produkt og fordampe løsningen tørrhet av roterende fordampning. Produktet blir isolert som en grønn-brun solid. Rentene er vanligvis på 5-15 mg (10-20% avkastning). Single-krystaller, egnet for X-ray Diffraksjon, kan fås ved damp spredningen av etanol i vandige løsninger av sammensatt.
- Kontrollere renhet, analysere sammensatt av UV-vis spektroskopi i en løsning av pH 7.4 fosfat-bufret saltvann (PBS). Renhet vurderes ved å ta forholdet mellom intensiteten av 360 nm og 600 nm topper. Dette forholdet er 31 for en ren sammensatt. For urene forbindelser, forholdet vil bli mindre.
- Analysere eksemplet i den SSD ved IR spektroskopi. Diagnostiske band er 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 og 815 cm -1. Vanlige urenhet band sett 1762 cm -1 og 1400 cm -1, karakteristisk for NH 4 klasse Ruthenium røde kan identifiseres av båndene 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 og 800 cm -1.
- Evaluering av mitokondrie kalsium opptak hemming av fluorescens spektroskopi
Advarsel! Følgende prosedyrer bruker pattedyrceller. Arbeidet skal utføres i passende laminær strømning hetter som er sertifisert for biologiske sikkerhetskabinett nivå 2 (BSL2) forskning.
Merk: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 vil bli referert til som [Ru] i denne delen- gjør bufret glukose inneholder saltholdig løsning (BGSS) som analysen media. BGSS er en løsning bestående av 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 5 mM natrium succinate, 30 µM etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tetraacetic syre (EGTA). Kombiner alt unntatt EGTA, justere pH 7,4. Legg EGTA og justere pH 7,4. 50 mL av analysen media legge 0,5 mL 1 mg/mL glukose.
- Kultur HeLa celler i 500 cm 2 Petri retter i Dulbecco ' s endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) i en fuktet inkubator med 5% CO 2 på 37 ° C. forsterke HeLa celler vokser i en 100 mm Petriskål av frø dem i en 500 cm 2 Petriskål. Totalt medier volumet i store parabolen er 115 mL. Hver store rett vil gi ca 18 millioner celler, nok for to fluorescens spektroskopi eksperimenter.
- Vokser cellene til de når 90-95% confluency. Fjerne media, og skyll cellene med 15 mL pH 7.4 PBS. Legg til 15 mL 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i PBS og ruge i 10 min å koble cellene. Overføre cellene til 14 mL rundt bunnen falcon rør
- telle celler med trypan blå og en hemocytometer med en invertert mikroskop, og Beregn antall celler og volumet av mediene som behøves for å nå 7,5 millioner celler per 1,8 mL volum middels. Sentrifuge celler for 10 min på 5310 × g. Decant nedbryting og legge til beregnede mengden BGSS. Resuspend celler forsiktig.
- For denne analysen, forberede lager løsninger av 40 mM digitonin i dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 mM kalsium Green-5N i H 2 O og 10 mM CaCl 2 H 2 O. [Ru] lager løsninger, utarbeidet i rent vann, kan variere fra 1-3 mM.
Merk: kalsium Green-5N er lys-sensitive. Lagre i mørket og minimere lyseksponering.
- For denne analysen, forberede lager løsninger av 40 mM digitonin i dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 mM kalsium Green-5N i H 2 O og 10 mM CaCl 2 H 2 O. [Ru] lager løsninger, utarbeidet i rent vann, kan variere fra 1-3 mM.
- Setup i fluorimeter for å opphisse 506 nm og lese utslipp på 532 nm med cuvette-holderen kontrollert på 37 ° C. forberede en akryl cuvette med rør bar eller hjulet, 1,8 mL celle suspensjon fra 1.5.2 ovenfor, 1,8 µL digitonin løsning, 3.6 & #181; L kalsium Green-5N (løsning), og 9 µL [Ru] (for 1 mM lagerløsning, 5 µM siste konsentrasjon). Inkuber celler i 15 min i fluorimeter.
- Lese dataene som eksitasjon/utslipp forholdet i stedet for den rå absorpsjonen. Denne praksisen minimerer feil forbundet med svingninger i lyskilde intensiteten.
- Utføre første eksempel analysen i fravær av [Ru] å måle effekten av tilsetning av CaCl 2 på svar av cellene.
- Begynner analyse på fluorimeter med innstillingene beskrevet i 1.5.4. Vente ca 2 minutter å fastsette baseline stabil utslipp, og deretter legge 1,8 µL av CaCl 2 (10 µM siste konsentrasjon). Utslippsintensiteten vil øke umiddelbart etter tillegg av CaCl 2, og deretter vil forfalle i løpet av minutter som kalsiumioner inn mitokondrier. Vent til forfallet er ferdig (≈ 5 min). Legge til ytterligere kalsium boluser for å fastslå mitokondrie kalsium opptak svaret celler ikke behandles med [Ru].
- i en annen cuvette inneholder 5 µM [Ru], gjenta eksperimentet som beskrevet ovenfor i 1.5.4.3. I nærvær av inhibitor, vil utslippsintensitet øke, men ikke forfall. Denne observasjonen betyr blokkert mitokondrie kalsium opptak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden beskriver en syntese av mitokondrie kalsium opptak inhibitor [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 fra [Ru (NH3)5Cl] Cl2, en kjente ruthenium(III) utgangsmaterialet. [Ru (NH3)5Cl] CL2 er preget av IR spektroskopi, med vibrerende modus på 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1og 798 cm-1 (figur 1). En mindre urenhet på 2069 cm-1 kan tilskrives [Ru (NH3)5N2] Cl3. Reaksjonen av denne Ru(III) arter med 1 M NH4OH gir [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. Utviklingen av denne reaksjonen er dokumentert av en dramatisk endring i fargen på løsningen fra gul til grønn. Den endelige reaksjon løsningen er mørk grønn i fargen. Forsuring av denne løsningen med konsentrert HCl gir en fargeendring til brun; et biprodukt av dette nøytralisering er salmiakk, som kan forurense sluttproduktet hvis omsorg ikke er utøves. Rensing av sammensatte fortsetter via cation exchange kromatografi bruker sterkt surt mesh (H+ skjema) harpiks. Harpiksen er equilibrated først med 0,10 M HCl, og løsningen [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 er lastet på kolonnen. Salmiakk biprodukt elutes med 1 M HCl vasker. Selskapets inneholder forbindelser elute på høyere HCl konsentrasjoner. En rekke gule fraksjoner, som inneholder Ureagert [Ru (NH3)5Cl] Cl2 starter materiale, komme ut av kolonnen når HCl konsentrasjonen er 1,5 M. Det ønskede produktet elutes mellom 2,5-3,0 M HCl og resulterende fraksjoner vises grønne til grønn-brun på farge.
Før pooling fraksjoner av produktet, skal sin renhet bekreftes. Fordi den ønskede sammensatt utstillinger noen pH-avhengighet i spekteret sin UV-vis, foreslår vi å legge til små dele fraksjoner svært grunnleggende 3 M NH3 løsninger for å sikre at de spektrale funksjonene er de samme for alle fraksjoner. Ren fraksjoner skal bare vise en intens topp på 360 nm og en svak peak på 600 nm (figur 2). Toppene i nærheten 480 og 533 nm indikere tilstedeværelse av selskapets brown og røde, henholdsvis, og en betydelig peak på 260 nm, med en skulder på 290 nm, betyr tilstedeværelsen av [Ru (NH3)5Cl] Cl2 starter materiale (Figur 3 ). Roterende fordampning av ren fraksjoner gir den ønskede sammensatt som en grønn-brun solid.
Den isolerte sammensatt kan videre bli preget av både UV-vis og IR spektroskopi. UV-vis spektrum (figur 2) viser 360 nm og 600 nm absorbansen band som beskrevet ovenfor. Utryddelse koeffisient for 600 nm bandet er 850 M-1cm-1 og for 360 nm bandet 27000 M-1cm-1. Forholdet mellom intensiteten av 360 nm bandet forhold til 600 nm bandet skal 31 i pH 7.4 PBS, og denne beregningen kan effektivt brukes til å måle renheten av sammensatte. IR spekteret skal vises som vist i Figur 4. Ru-O-Ru strekker frekvensen er for eksempel diagnostiske på 850 cm-1. IR spekteret var ansatt å bestemme Ru-O-Ru strekningen og at ingen salmiakk var til stede i det endelige produktet. Salmiakk, en felles urenhet, har vibrasjonsmedisin modi 1762 cm-1 (veldig svak) og 1400 cm-1 (sterk) som enkelt kan skjelnes fra IR spekteret (figur 5). Selskapets rød er et vanlig biprodukt av reaksjonen og kan identifiseres i IR spektrum med strekninger på 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 og 800 cm-1, selv om noen overlapper med det ønskede produktet vil skje) Figur 6).
Kalsium opptak svaret i digitonin-permeabilized HeLa celler er observert (figur 7). Stjernene angir tillegg av CaCl2 bolus. I nærvær av [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] er Cl5 en økning i utslippsintensitet observert på kalsium tillegg, men ingen forfall på grunn av mitokondrie kalsium opptak er observert.
Figur 1 : Infrarød spektra av [Ru (NH3)5Cl] Cl2. De infrarøde spektra av [Ru (NH3)5Cl] Cl2 med en svært liten [Ru (NH3)5N2] Cl3 urenhet. Den røde pilen viser urenhet på 2,069 cm-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant UV-vis spectra for ren materiale. [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-vis absorbansen spectra, nær infrarød (innfelt) tatt i pH 7.4 PBS. Utryddelse koeffisient for store absorbansen på 360 nm er 27000 M-1 cm-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : UV-vis spektra av råolje reaksjonsblandingen. [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-vis absorbansen spektra av råolje reaksjonsblandingen før rensing i pH 7.4 PBS. Røde piler indikerer felles urenheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant infrarød spectra for ren materiale. De infrarøde spektra av [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. Ru-O-Ru strekningen går på 850 cm-1, de andre strekker seg fra NH3 oscillatorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/>
Figur 5 : Infrarød spectra som inneholder NH4Cl urenheter. De infrarøde spektra av [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 med salmiakk urenhet. Den røde pilen viser salmiakk på 1400 cm-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Infrarød spektra av kommersielle ruthenium red. Infrarød spekteret av [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 (svart trace) og kommersielle ruthenium rød (rød trace). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Representant kalsium opptak resultater. Fluorescens økningen på grunn av kalsium til en cocktail av digitonin-permeabilized HeLa celler, kalsium Green-5N og [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 i BGSS. Tomt inneholder ingen [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl-5 og fluorescens reduseres på grunn av Ca2 + opptak i mitokondrier kan sees. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrielt kalsium opptak inhibitor [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 kan bli syntetisert fra [Ru (NH3)5Cl] Cl2, en kjent ruthenium(III) starter materiale, som beskrevet i denne fremgangsmåten. Syntese av [Ru (NH3)5Cl] Cl2 er lett oppnådd med lite problemer. Etter stirring RuCl3 for 16 h i hydrazine hydrat, pH av løsningen skal justeres verdien 2 med HCl. PH drop er avgjørende for å oppnå det ønskede produktet. Eventuelt kan denne syntese endres til skjemaet [Ru (NH3)5Br] Br2 av refluxing i HBr i stedet for HCl.
Vi har observert noen strategier for å minimere dannelsen av uønskede biprodukter i syntesen av mitokondrie kalsium opptak inhibitor. Spesielt er å holde flasken avkortet avgjørende for suksessen til denne reaksjonen; Hvis flasken åpen, er en rekke andre biprodukter, inkludert selskapets rød (RuRed), dannet i merkbare mengder. Antagelig er gass ammoniakk tapt fra åpne reaksjonen fartøyet, og denne hendelsen kompromisser dannelsen av det ønskede produktet. Størrelsen på flasken og volumet av vandig ammoniakk er også viktige parametere som ikke bør endres betydelig fra beskrevet i denne protokollen, som vi har lagt merke til at effektiviteten av denne reaksjonen er redusert i mindre flasker. Denne metoden øke ikke drastisk avkastningen av dette sammensatte i forhold til de to andre metodene vi hadde tidligere avslørt. Det gjør imidlertid inneholde færre trinn og gi opphav til mindre siden produktet formasjonen, som RuRed. Lav avkastning kan tilskrives tilstedeværelsen av en liten mengde Ureagert [Ru (NH3)5Cl] Cl2 samt ukjent svært ladede som beholdes på toppen av kolonnen. Selv om vi ikke har utforsket mange ekstra reaksjonen forhold, er det mulig at forbedringer kan realiseres ved å variere reaksjonstid og reactant konsentrasjoner, å få høyere avkastning.
Rensing av [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 er mest kjedelige og vanskelige delen av denne protokollen. En godt pakket kolonne vil sterkt hjelpe i separasjon; laster harpiks som slurry er en effektiv tilnærming til pakke kolonnen. Det bør bemerkes at som HCl konsentrasjonen er økt i løpet av kolonnen tilsettes, harpiks vil kontrakten i størrelse. Du oppnår rent materiale, bør frekvensen som acid konsentrasjonen øker avvike fra den angitte prosedyren. Det endelige produktet vil være en grønn-brun solid; en grunnleggende løsning vil være mørk grønn men syrlig løsninger blir brune. Hvis en lys rosa-rød-løsning er observert, finnes ruthenium røde forurensing. Hvor mye RuRed kan bestemmes ved hjelp av utryddelse koeffisient (62,000 M-1·cm-1 på 533 nm). Denne renselsesprosess er relativt generelt for sterk cation exchange harpiks kolonner.
Mitokondrielt kalsium opptak hemming kan testes permeabilized HeLa celler, fluorescerende kalsium sensoren kalsium Green-5N og en spectrofluorimeter. 13 , 14 denne analysen krever en stor mengde celler og derfor nødvendiggjøre forsterkning av kulturen i en stor 500 cm2 Petriskål. Disse store kultur kolber hindre ekstra utfordringer i å minimalisere mikrobiell forurensning fordi synlige flater er svært store. Arbeidet skal utføres i en laminær strømning regjering å opprettholde sterilitet. Fluorescens svaret av kalsium Green-5N i permeabilized HeLa celler overvåkes av fluorescens spektroskopi. Tillegg av en ekstern bolus kalsium til cuvette utløser en umiddelbar økning i fluorescens, som følge av kalsiumioner samarbeidsstil sensoren. I løpet av noen minutter i fravær av en inhibitor henfall intensiteten på grunn av opptak av disse kalsiumioner i mitokondrier, en organelle som fargestoff er ikke tilgjengelig. Når denne analysen utføres i nærvær av en inhibitor tillegg av bolus kalsium ioner gir opphav til en økning i utslippsintensitet. Forfall på grunn av mitokondrie kalsium opptak, men finnes ikke, bekrefter mitokondrie kalsium opptak inhibitoriske egenskaper av dette sammensatte. Denne prosessen kan brukes som en generell skjerm for kalsium opptak hemmere. Dessuten, kan denne prosedyren brukes til andre eukaryotic celler av interesse. Denne analysen er avhengig av permeabilization av ytre mobilnettet membran dermed gir ikke informasjon om mobilnettet opptak muligheten av en kompleks.
I sammendraget beskriver denne protokollen syntese og rensing av en roman ruthenium-baserte mitokondrie kalsium opptak inhibitor. Denne forbindelsen er av stor betydning for å studere biologi mitokondrie kalsium og dens rolle i fysiologi av pattedyr cellen. Relativt enkel analysen for å teste mitokondrie kalsium opptak er også bruk for screening og undersøkelse av nye hemmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Cornell University. Dette arbeidet gjort bruk av Cornell Center for materialer forskning delte fasiliteter, støttes gjennom NSF MRSEC programmet (Grant DMR-1120296). S.R.N. erkjenner støtte av en NSF-Graduate forskningsstipend (Grant DGE - 1650441) og Dr. Dave Holowka for hjelp med kalsium eksperimenter. Noen meninger, funn, og konklusjoner eller anbefalinger i dette materialet er de av forfatterne (s) og nødvendigvis gjenspeiler ikke synspunktene til National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
