Summary
En protokol til syntese, oprensning og karakterisering af en ruthenium-baserede hæmmer af mitokondrie calcium optagelse er præsenteret. En procedure til at evaluere dets effektivitet i permeabilized mammale celler er påvist.
Abstract
Vi detalje syntese og rensning af en mitokondrie calcium uptake hæmmer, [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)]5 +. Optimeret syntesen af dette stof begynder fra [Ru (NH3)5Cl] Cl2 i 1 M NH4OH i en lukket beholder, hvilket giver en grøn løsning. Rensning er udført med kationbytter chromatografi. Dette stof er karakteriseret og verificeret til at være ren af UV-vis og IR-spektroskopi. Mitokondrie calcium optagelse hæmmende egenskaber er vurderet i permeabilized HeLa celler af fluorescens spektroskopi.
Introduction
Mitokondrie calcium er en vigtig regulator for en række processer, der er vigtige for normal cellefunktion, herunder energiproduktion og apoptose. 1 , 2 , 3 mitokondrie calcium uniporter (MCU), en ion transporter protein, der findes på den indre mitokondrielle membran, regulerer strømmen af calciumioner i mitokondrierne. 4 , 5 , 6 kemisk hæmmere af MCU er værdifulde værktøjer til at fortsætte bestræbelserne på at studere den funktion og cellulære roller til denne transport protein og mitokondriel calcium. Den sammensatte [(HCO2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, er en af de eneste kendte selektive hæmmere for MCU med en rapporteret Kd værdi af 24 µM.7 ,8,9,10 dette kompleks er en fælles urenhed fundet i kommercielle formuleringer af ruthenium rød (RuRed), en triruthenium di-µ-oxo bro hexacation af formel [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, der også har været brugt som en calcium uptake hæmmer. Selv om Ru360 er kommercielt tilgængelige, er det meget dyrt. Derudover er syntese og isolering af Ru360 udfordret af vanskelige rensning procedurer og tvetydige karakterisering metoder.
Vi har for nylig rapporteret alternative procedurer til at få adgang til en Ru360 analoge, [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 dette stof hæmmer MCU med høj affinitet, svarende til Ru360. I denne protokol, vil vi beskrive vores mest effektive syntese af dette stof, som begynder fra [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Rensning af produktet ved hjælp af stærkt sur kationbytter harpiks er detaljeret, sammen med fælles faldgruber for denne procedure. Vi også præsentere metoder til karakterisering og vurdering af sammensatte renhed, og afgrænse en enkel tilgang for at teste dens effektivitet i blokerende mitokondrie calcium optagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: koncentrerede syrer og baser er brugt i denne syntese. Bruge alle passende sikkerhedspraksis, når du udfører den reaktion, herunder anvendelse af tekniske foranstaltninger (stinkskab) og personlige værnemidler (PPE) herunder sikkerhedsbriller, handsker, laboratoriekittel, fuld længde bukser og lukket tå sko.
1. forberedelse af [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- syntese af [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
- opløse 1,00 g af RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru af vægt, 4.1 mmol) i 5 mL H 2 O. Cool den mørke brune løsning ved 0 ° C i isbad. Tilføje 11 mL (0,23 mol) af 80% hydrazin hydrat løsning i en dråbevis måde. Den første reaktion vil være energisk med evolution forbrændingsgasserne i en brun løsning. Lad den resulterende løsning rør ved stuetemperatur til 16 h; den endelige løsning bliver mørke red.
Forsigtig: Hydrazin er akut giftige og kræftfremkaldende. Derudover er vandfri former for denne reagens eksplosive. Som altid bruge passende PPE og fume emhætter når håndtering. Ikke koncentrere disse løsninger til tørhed. - Til denne løsning, tilføje ca 5-10 mL koncentreret HCL til pH indstilles til 2. På dette tidspunkt løsningen vil være gul-brun i farven.
- Varme denne løsning ved 105 ° C under omrøring til 1-2 h. En gul solid vil bundfald ud af løsningen. Når ikke mere bundfald synligt former, fjerne fra varmen.
- Tillade reaktionsblandingen afkøles til stuetemperatur, og derefter placere i et 0 ° C is bad for 10 min. indsamle gul solid af vakuum filtrering og vask med 5 mL hver af ethanol og diethylether.
- Opløses fuldstændigt den rå vare i 15-25 mL varmt vand. Chill 10 mL koncentreret HCl løsning i en sugekolbe ved at placere det i isbad. Filtrere den gule løsning i kølet HCl løsning til at fremkalde udfældning af en bleg gul ren solid. Filtrere dette bundfald og skylles med 5 mL 0,5 M HCl, ethanol og ether.
- Characterize sammensatte ved hjælp af IR-spektroskopi. Kontrollere renhed ved identifikation af stretching frekvenser på 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 og 801 cm -1. En fælles mindre urenheder på 2069 cm -1 er tildelt til [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
- opløse 1,00 g af RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru af vægt, 4.1 mmol) i 5 mL H 2 O. Cool den mørke brune løsning ved 0 ° C i isbad. Tilføje 11 mL (0,23 mol) af 80% hydrazin hydrat løsning i en dråbevis måde. Den første reaktion vil være energisk med evolution forbrændingsgasserne i en brun løsning. Lad den resulterende løsning rør ved stuetemperatur til 16 h; den endelige løsning bliver mørke red.
- Syntese af [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- opløse 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 i 50 mL 1 M NH 4 OH i en 200 mL tung væg rundbundet trykbeholder. Løst cap kolben med en prop og varme reaktionsblanding ved 75 ° C i 6 h. Fjern fra varmen og rør ved stuetemperatur i 4 dage for at give en mørk grøn løsning.
Forsigtig! Opvarmning en forseglet beholder resultater i en pres oprustning. Sørg for at bruge passende pres-safe glasvarer. For denne reaktion er formålet med forsegling fartøjet at minimere tab af gasformige NH 3. Derfor placere prop løst til at give mulighed for frigivelse af overtryk.
- opløse 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 i 50 mL 1 M NH 4 OH i en 200 mL tung væg rundbundet trykbeholder. Løst cap kolben med en prop og varme reaktionsblanding ved 75 ° C i 6 h. Fjern fra varmen og rør ved stuetemperatur i 4 dage for at give en mørk grøn løsning.
- Rensning ved kationbytter kromatografi
- i et 25 mL bægerglas, suspendere 5 g kationbytter harpiks (f.eks. Dowex 50WX2 200-400 mesh (H + form) i 10 mL 0,1 M HCl.
- Indlæse denne gylle i en 10 mL kolonne (10 mm diameter, 15 cm højde) anbringes med en 50 mL opløsningsmiddel reservoir. Vaske harpiks med ca 20-30 mL af 0,1 M HCl, indtil eluatet er farveløs.
- Tilbagevenden til grønne reaktion løsning isoleret i trin 1.2.1. Denne løsning, tilføje koncentreret HCl for at ph indstilles til 2, på hvilket tidspunkt skifter løsning farve til brun.
- Indlæse denne syrnet løsningen til kolonnen kationbytter harpiks tilberedt trin 1.3.2 i forsigtigt pipettering det på toppen af harpiks. Lad eluatet helt dræne, og fortsætte ladning løsningen. Gentag denne proces, indtil hele løsningen er blevet tilføjet. Toppen af harpiksen vil være mørk brun/sort. Harpiksen vil falde i volumen lidt.
- Brug glasperler til at dække toppen af harpiks. Disse vil forhindre harpiks fra at blive forstyrret når nye løsninger er tilføjet.
- Elueres kolonnen med 20 mL 1 M HCL.
- Elueres kolonne med en øget koncentration af 1,5 M HCl (≈ 50 mL). En gul løsning vil begynde at komme fra kolonnen. Øge koncentration til 2 M HCl og fortsætte eluerer indtil eluatet er farveløs eller en meget bleg grøn-gul. En samlet maengde paa 150-200 mL vil være nødvendig for denne proces.
- Øge koncentration HCl til 2,5 M (20-50 mL). Eluatet opsamles som brøker i reagensglas. Øges til 3 M HCl. Produktet vil elueres af kolonnen som en grøn-brun løsning. En rød-brun brøkdel kan også begynde at komme ud af kolonnen. Da disse fraktioner er oxideret ruthenium røde urenheder, ikke pool med grøn-brun fraktioner.
- Karakterisering og kontrol af renhed [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- tester alle fraktioner fra trin 1.3.8. af UV-vis spektroskopi. For at udføre denne opgave, tilføje 100 µL af en given brøk til 2 mL 3 M NH3 og analysere ved UV-vis spektroskopi. Fraktioner der indeholder ren produkt vil have en stor absorbans band på 360 nm og en mindre intens absorbans på 600 nm. Absorbans ved 480 eller 533 nm er vejledende af oxideret ruthenium rød og ruthenium røde urenheder, hhv.
- Pool fraktioner der indeholder ren produkt og inddampes til tørhed af roterende fordampning. Produktet vil blive isoleret som en grøn-brun solid. Udbyttet er normalt på rækkefølgen af 5-15 mg (10-20% udbytte). Single-krystaller, egnet til røntgen diffraktion, kan opnås ved vapor diffusion af ethanol i vandig opløsning af stoffet.
- At kontrollere renhed, analysere sammensat af UV-vis spektroskopi i en opløsning af pH 7,4 fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Renheden kan vurderes ved at tage forholdet mellem intensiteten af 360 nm og 600 nm toppe. Dette forhold er 31 for en ren sammensatte. For urent forbindelser, forholdet vil være mindre.
- Analyserer prøven i den solid-state ved IR-spektroskopi. Diagnostiske bands er på 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 og 815 cm -1. Fælles urenhed bands er set på 1762 cm -1 og 1400 cm -1, karakteristisk for NH 4 Cl. Ruthenium rød kan identificeres af bands på 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 og 800 cm -1.
- Evaluering af mitokondrie calcium optagelse hæmning af fluorescens spektroskopi
forsigtighed! Følgende procedurer bruge pattedyrsceller. Arbejdet skal udføres i passende laminar flow emhætter, der er certificeret til biologisk sikkerhed niveau 2 (BSL2) forskning.
Bemærk: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 vil blive benævnt som [Ru] i dette afsnit- gøre buffered glukose-holdige saltvand løsning (BGSS) assay medier. BGSS er en løsning bestående af 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 5 mM natrium succinat, 30 µM ethylenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tetraacetic syre (EGTA). Kombinere alt undtagen EGTA, justere pH 7,4. Tilføje EGTA og justere pH 7,4. 50 ml af assay media tilføje 0,5 mL af 1 mg/mL glukose.
- Kultur HeLa celler i 500 cm 2 petriskåle i Dulbecco ' s ændret Eagle Medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) i en fugtig kuvøse med 5% CO 2 på 37 ° C. forstærke HeLa celler vokser i en 100 mm petriskål ved såning dem i en 500 cm 2 petriskål. Total media volumen i den store skål er 115 mL. Hver stor parabol vil give ca 18 millioner celler, nok til to fluorescens spektroskopi eksperimenter.
- Vokser cellerne indtil de når 90-95% confluency. Fjerne medier, og skyl celler med 15 mL pH 7,4 PBS. Der tilsættes 15 mL af 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) i PBS og inkuberes i 10 min at løsrive cellerne. Overfør celler til 14 mL rund bund falcon rør
- tælle celler benytter trypan blå og en hemocytometer med en inverteret mikroskop, og beregne det samlede antal celler og mængden af medierne skulle nå 7,5 millioner celler pr. 1,8 mL volumen af medium. Centrifugeres celler i 10 min på 5310 × g. Decant supernatanten og tilføje beregnede mængden af BGSS. Resuspend celler forsigtigt.
- Til dette assay, forberede stamopløsninger af 40 mM digitonin i dimethylsulfoxid (DMSO), 1 mM Calcium grøn-5N i H 2 O og 10 mM CaCl 2 i H 2 O. [Ru] stamopløsninger, forberedt i rent vand, kan variere fra 1-3 mM.
Bemærk: Calcium grøn-5N er lysfølsomt. Lagre i mørke og minimere lyseksponering.
- Til dette assay, forberede stamopløsninger af 40 mM digitonin i dimethylsulfoxid (DMSO), 1 mM Calcium grøn-5N i H 2 O og 10 mM CaCl 2 i H 2 O. [Ru] stamopløsninger, forberedt i rent vand, kan variere fra 1-3 mM.
- Setup fluorimeter for at ophidse på 506 nm og Læs emission på 532 nm med kuvette-indehaveren kontrolleret ved 37 ° C. Forbered en akryl kuvette med en røre bar eller hjul, 1,8 mL cellesuspension fra 1.5.2 ovenfor, 1,8 µL digitonin løsning, 3.6 & #181; L Calcium grøn-5N (opløsning), og 9 µL [Ru] (for 1 mM stamopløsning, 5 µM endelige koncentration). Inkuber celler i 15 min. i fluorimeter.
- Læse data som excitation/emission forholdet i stedet for de rå absorption. Denne praksis minimerer fejl i forbindelse med udsving i lyskilden intensitet.
- Den første prøve analyse i mangel af [Ru] til at måle effekten af tilsætning af CaCl 2 på svar af cellerne.
- Begin analyse på fluorimeter med indstillingerne beskrevet i 1.5.4. Vent ca 2 minutter for at etablere en stabil emission baseline, og derefter tilføje 1,8 µL af CaCl 2 (10 µM endelige koncentration). Emission intensiteten øges straks efter tilsætning af CaCl 2, og vil derefter henfalde i løbet af minutter som calciumioner ind mitokondrier. Vent indtil forfald er færdig (≈ 5 min). Tilføje yderligere calcium bolustypen Bestem mitokondrie calcium optagelse svar af celler ikke behandles med [Ru].
- i en anden kuvette indeholdende 5 µM [Ru], gentage forsøget, som beskrevet ovenfor i 1.5.4.3. I nærværelse af inhibitor, vil emission intensitet stige, men ikke forfald. Denne observation betyder blokeret mitokondrie calcium uptake.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne metode beskrives en syntese af mitokondrie calcium uptake hæmmer [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 start fra [Ru (NH3)5Cl] Cl2, en velkendt ruthenium(III) råvare. [Ru (NH3)5Cl] CL2 er kendetegnet ved IR-spektroskopi med vibrationelle tilstande på 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1og 798 cm-1 (figur 1). En mindre urenheder på 2069 cm-1 kan tilskrives [Ru (NH3)5N2] Cl3. Reaktionen fra denne Ru(III) arter med 1 M NH4OH frembyder [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. Udviklingen af denne reaktion fremgår af en dramatisk ændring i farve af løsning fra gul til grøn. Den endelige reaktion løsning er mørk grøn farve. Forsuring af denne løsning med koncentreret HCl resulterer i en farveændring af til brun; et biprodukt af denne neutralisering er ammoniumchlorid, som kan forurene det endelige produkt, hvis pleje ikke er udøves. Rensning af sammensat provenuet via kationbytter kromatografi ved hjælp af stærkt sure mesh (H+ form) harpiks. Harpiksen er ekvilibreres først med 0,10 M HCl, og løsningen af [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 er indlæst på kolonnen. Ammoniumklorid biprodukt eluerer med 1 M HCl vask. Ruthenium-holdige forbindelser elueres ved højere HCl-koncentrationer. En række gule fraktioner, der indeholder ureageret [Ru (NH3)5Cl] Cl2 starter materiale, komme ud af kolonnen, når HCl koncentration er 1,5 M. Den ønskede vare eluerer mellem 2,5-3,0 M HCl, og de deraf følgende fraktioner vises grøn til grøn-brun farve.
Før pooling fraktioner i produktet, skal deres renhed verificeres. Fordi den ønskede sammensatte udstiller nogle pH-afhængighed i dens spektrum, UV-vis, foreslår vi, at tilføje små prøver af fraktioner til meget grundlæggende 3 M NH3 løsninger til at sikre, at den spektrale egenskaber er den samme for alle fraktioner. Ren fraktioner skal kun vise en intens peak på 360 nm og en svag peak på 600 nm (figur 2). Toppe nær 480 og 533 nm indikere tilstedeværelsen af ruthenium brun og rød, henholdsvis, og en betydelig peak på 260 nm, med en skulder på 290 nm, betyder tilstedeværelsen af [Ru (NH3)5Cl] Cl2 starter materiale (figur 3 ). Roterende fordampning af ren fraktioner giver den ønskede sammensatte som en grøn-brun solid.
Den isolerede sammensatte kan yderligere være kendetegnet ved både UV-vis og IR-spektroskopi. UV-vis spektrum (figur 2) viser 360 nm og 600 nm absorbans bands som beskrevet ovenfor. Extinction koefficient for 600 nm bandet er 850 M-1cm-1 , og for de 360 nm band 27000 M-1cm-1. Forholdet mellem intensiteten af frekvensbåndet 360 nm i forhold til 600 nm bandet bør være 31 i pH 7,4 PBS, og denne måleparameter reelt kan bruges til at måle renheden af sammensat. IR-spektrum skal vises som vist i figur 4. Ru-O-Ru strækker frekvens, for eksempel, er diagnostisk på 850 cm-1. IR-spektrum blev ansat til at bestemme Ru-O-Ru strækningen og sikre ingen ammoniumklorid var til stede i det endelige produkt. Ammoniumklorid, en fælles urenhed, har vibrationelle tilstande på 1762 cm-1 (meget svagt) og 1400 cm-1 (stærk), kan let skelnes fra IR-spektrum (figur 5). Ruthenium rød er en fælles biprodukt af reaktionen og kan identificeres i IR spektrum med strækninger på 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 og 800 cm-1, selvom nogle overlapper med den ønskede vare vil forekomme) Figur 6).
Calcium optagelse svar i digitonin-permeabilized HeLa celler er observeret (figur 7). Stjernerne Angiver tilføjelse af en CaCl2 bolus. I nærværelse af [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] er Cl5 en stigning i emissionen intensitet observeret på calcium supplement, men ingen forfald på grund af mitokondrie calcium optagelsen er observeret.
Figur 1 : Infrarød spektre af [Ru (NH3)5Cl] Cl2. De infrarøde spektre af [Ru (NH3)5Cl] Cl2 med en meget lille [Ru (NH3)5N2] Cl3 urenhed. Den røde pil angiver urenhed på 2,069 cm-1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant UV-vis spektre for ren materiale. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-vis absorbans spectra og nær infrarød (indsatser) taget i pH 7,4 PBS. Extinction koefficient for den store absorbans på 360 nm er 27.000 M-1 cm-1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : UV-vis spektre af rå reaktionsblandingen. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-vis absorbans spektre af rå reaktionsblandingen før rensning taget i pH 7,4 PBS. De røde pile angiver fælles urenheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant infrarød spektre for ren materiale. De infrarøde spektre af [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. Ru-O-Ru strækning er 850 cm-1, de andre strækninger er fra NH3 oscillatorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
/>
Figur 5 : Infrarød spectra indeholdende NH4Cl urenheder. De infrarøde spektre af [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 med ammoniumklorid urenhed. Den røde pil angiver ammoniumklorid på 1.400 cm-1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Infrarød spektre af kommercielle ruthenium red. Det infrarøde spektrum af [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 (sort trace) og kommercielle ruthenium rød (rød trace). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Repræsentant calcium optagelse resultater. Fluorescens stigning som følge af tilsætning af calcium til en cocktail af digitonin-permeabilized HeLa celler, Calcium grøn-5N og [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 i BGSS. Blindprøven indeholder ingen [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 og fluorescens fald på grund af Ca2 + optagelse i mitokondrier kan ses. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrie calcium uptake hæmmer [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 kan være syntetiseret fra [Ru (NH3)5Cl] Cl2, en velkendt ruthenium(III) Start materiale, som beskrevet i denne procedure. Syntesen af [Ru (NH3)5Cl] Cl2 opnås let med lidt besvær. Efter omrøring RuCl3 til 16 h i hydrazin hydrat, pH af løsningen bør justeres til en værdi af 2 med HCl. PH faldet er afgørende for at opnå den ønskede vare. Hvis det ønskes, kan denne syntese ændres til form [Ru (NH3)5Br] Br2 ved refluxerende i HBr i stedet for HCl.
Vi har observeret nogle strategier til at minimere dannelsen af uønskede biprodukter i syntesen af mitokondrie calcium uptake hæmmer. Bemærkelsesværdigt, er at holde kolben udjævnede afgørende for succes af denne reaktion; Hvis kolben er åben, der en række andre biprodukter, herunder ruthenium rød (RuRed), dannes i betydelige mængder. Formodentlig er gasformig ammoniak tabt fra det åbne reaktion fartøj, og denne begivenhed kompromiser dannelse af den ønskede vare. Størrelsen af kolben og mængden af vandig ammoniak er også vigtige parametre, der ikke skal ændres væsentligt fra dem, der er beskrevet i denne protokol, som vi har bemærket, at effektiviteten af denne reaktion er faldet i mindre flasker. Denne metode øger ikke drastisk udbyttet af dette stof i forhold til de andre to metoder vi havde tidligere offentliggjorte. Det, men indeholder færre trin og give anledning til mindre side produkt dannelse, såsom RuRed. Det lave udbytte kan henføres til tilstedeværelsen af en lille mængde af ureageret [Ru (NH3)5Cl] Cl2 samt ukendte stærkt ladede urenheder, der er bevaret på toppen af kolonnen. Selv om vi ikke har udforsket mange yderligere reaktionsbetingelser, er det muligt, at forbedringer kan realiseres ved at variere reaktionstiden og reaktant koncentrationer, at opnå højere udbytter.
Rensning af [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 er den mest kedelige og vanskelig del af denne protokol. Et godt pakket kolonne vil i høj grad hjælpe i adskillelsen; indlæsning af harpiks som gylle er en effektiv metode til at pakke kolonnen. Det skal bemærkes, at som HCl-koncentrationen er øget i løbet af kolonne eluering, harpiksen vil kontrakten i størrelse. Du kan med held få ren materiale, bør den hastighed, hvormed den syrekoncentration er steget ikke afviger fra den angivne procedure. Det endelige produkt vil være en grøn-brun solid; en grundlæggende løsning vil være mørkegrøn men sure opløsninger vil være brun. Hvis en lys pink-rød løsning er observeret, er ruthenium røde forureninger til stede. RuRed kan fastsættes ved hjælp af udryddelse koefficient (62.000 M-1·cm-1 på 533 nm). Denne rensningsproces er relativt generelt for stærk kationbytter harpiks kolonner.
Mitokondrie calcium optagelse hæmning kan testes ved hjælp af permeabilized HeLa celler, fluorescerende calcium sensor Calcium grøn-5N og et spektrofluorimeter. 13 , 14 dette assay kræver en stor mængde af celler og derfor nødvendiggør forstærkning af kulturen i et meget stort 500 cm2 petriskål. Disse store kultur kolber forhindre yderligere udfordringer i at minimere mikrobiel kontaminering, fordi de eksponerede overflade områder er meget store. Arbejdet skal udføres i en laminar flow kabinet at opretholde sterilitet. Fluorescens svar af Calcium grøn-5N i permeabilized HeLa celler er overvåget af fluorescens spektroskopi. Tilføjelse af en ekstern bolus af calcium til kuvette udløser en øjeblikkelig stigning i fluorescens, som følge af calciumioner interagere med sensoren. I løbet af nogle minutter i mangel af en inhibitor henfalder intensiteten på grund af udbredelsen af disse calciumioner i mitokondrierne, en organelle, der ikke kan tilgås af farvestoffet. Hvornår denne analyse foretages i tilstedeværelse af en inhibitor tilføjelsen af en bolus af calciumioner giver anledning til en stigning i emissionen intensitet. Forfald på grund af mitokondrie calcium optagelse, er imidlertid ikke til stede, kontrollere mitokondrie calcium optagelse hæmmende egenskaber af dette stof. Denne proces kan bruges som en generel skærm for calcium uptake hæmmere. Denne procedure kan derudover anvendes andre eukaryote celler af interesse. Denne analyse afhænger permeabilization af den ydre cellulære membran giver således ikke oplysninger om den cellulære optagelse evne af et kompleks.
I Resumé beskriver denne protokol syntese og rensning af en roman ruthenium-baserede mitokondrie calcium uptake hæmmer. Dette stof er af væsentlig værdi for at studere biologi mitokondrie calcium og dens rolle i cellen pattedyr fysiologi. Den relativt simple assay for afprøvning mitokondrie calcium optagelse er også til screening og undersøgelse af ny hæmmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Cornell University. Dette arbejde gjort brug af Cornell Center for materialer delt forskningsfaciliteter, der støttes gennem programmet NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. anerkender støtte af en NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) og Dr. Dave Holowka for assistance med calcium eksperimenter. Enhver udtalelse, konstateringer og konklusioner og henstillinger udtrykt i dette materiale er dem af forfatterne (s) og afspejler ikke nødvendigvis synspunkter af National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
