Summary
ويرد وضع بروتوكول للتوليف وتنقية، وتوصيف مثبط على أساس الروثينيوم لامتصاص الكالسيوم المتقدرية. ويتجلى إجراء تقييم فعاليته في خلايا الثدييات بيرميبيليزيد.
Abstract
ونحن بالتفصيل التوليف وتنقية مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية،] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [5 +. التوليف الأمثل من هذا المركب تبدأ من [رو (NH3)5Cl] Cl2 في 1 م NH4يا في حاوية مغلقة، مما أسفر عن حل أخضر. ويتم إنجاز تنقية مع الفصل اللوني لتبادل الأيونات الموجبة. يتميز هذا المركب والتحقق من أن تكون نقية بالتحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء. خصائص امتصاص الكالسيوم المتقدرية المثبطة يقيمها fluorescence التحليل الطيفي في خلايا هيلا بيرميبيليزيد.
Introduction
الكالسيوم المتقدرية هو منظم رئيسي لعدد من العمليات التي تعتبر حاسمة بالنسبة لوظيفة الخلية العادية، بما في ذلك إنتاج الطاقة والمبرمج. 1 , 2 , 3 أونيبورتير الكالسيوم المتقدرية (MCU)، بروتين الناقل أيون موجودة على غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وينظم تدفق أيونات الكالسيوم في الميتوكوندريا. 4 , 5 , 6 الكيميائية مثبطات MCU أدوات قيمة لمواصلة الجهود الرامية إلى دراسة وظائف وأدوار الخلوية هذا النقل البروتين والكالسيوم المتقدرية. مجمع] (NH3) (HCO2)4رو رو (μ س) (NH3)4(س2CH) [3 +، Ru360، واحد من مثبطات انتقائية المعروفة فقط ل MCU مع قيمةد ك المبلغ عنها من 24 ميكرومتر.7 8، ،،من910 هذا المجمع شوائب مشتركة الموجودة في المستحضرات التجارية من الروثينيوم الأحمر (روريد)، اثنا دي-μ-أوكسو سد هيكساكاتيون الصيغة (NH]3) 5 رو (μ س) رو (NH3)4(μ س) رو (NH3)5)]6 +، التي استخدمت أيضا كمثبط امتصاص كالسيوم. على الرغم من أن Ru360 المتاحة تجارياً، أنها مكلفة للغاية. وعلاوة على ذلك، طعن التوليف وعزل Ru360 تنقية صعوبة إجراءات وأساليب توصيف غامضة.
ونحن قد أبلغت مؤخرا بإجراءات بديلة الوصول إلى Ru360 التماثلية، [(NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 يمنع هذا المركب MCU مع تقارب عالية، مماثلة ل Ru360. في هذا البروتوكول، ونحن سوف تصف لدينا توليف الأكثر فعالية لهذا المركب، الذي يبدأ من [رو (NH3)5Cl] Cl2. هو مفصل تنقية المنتج باستخدام راتنج تبادل الأيونات الموجبة الحمضية بشدة، جنبا إلى جنب مع المخاطر الشائعة لهذا الإجراء. ونحن أيضا أساليب لتوصيف وتقييم درجة نقاء مجمع، وتحدد نهج بسيط لاختبار فعاليته في منع امتصاص الكالسيوم المتقدرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
: تركيز الأحماض والقواعد المستخدمة في هذا التوليف. استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند القيام برد فعل بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان) ومعدات الحماية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) بما في ذلك سلامة النظارات والقفازات ومعطف مختبر، وكامل طول السراويل وأحذية أغلقت تو.
1. إعداد [(أوه 2) (NH 3) 4 رو (μ س) رو (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- توليف Cl [Cl 5 رو (NH 3)] 2 12
- ز حل 1.00 روكل 3 · ن ح 2 س (40% رو بالوزن، 4.1 mmol) في 5 مل ح 2 سين بارد الحل البنى الداكن إلى 0 درجة مئوية في حمام الثلج. إضافة مل 11 (0.23 mol) من حل هيدرات الهيدرازين 80% بطريقة دروبويسي. رد الفعل الأولى ستكون قوية مع تطور الغاز، أسفر عن حل براون. واسمحوا أن الحل الناجم عن ذلك ضجة في درجة حرارة الغرفة ح 16؛ أن الحل النهائي سيكون احمرت الظلام
تنبيه: الهيدرازين حادة السمية والمسببة للسرطان. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر اللامائى أشكال هذا الكاشف المتفجرات. كما هو الحال دائماً، استخدم أغطية معدات الوقاية الشخصية والأبخرة المناسبة عند التعامل. لم تركز هذه الحلول إلى جفاف. - لهذا الحل، قم بإضافة ما يقرب من 5-10 مل HCl مركزة لضبط درجة الحموضة إلى 2. عند هذه النقطة، سيكون الحل بني أصفر اللون.
- الحرارة هذا الحل عند 105 درجة مئوية بينما التحريك ح 1-2. مادة صلبة صفراء سوف يعجل بالخروج من الحل. عندما يعجل لا أكثر وضوحاً أشكال، إزالة من الحرارة.
- السماح برد فعل الخليط يبرد لدرجة حرارة الغرفة، ومن ثم ضع في حمام الثلج 0 درجة مئوية لجمع 10 دقيقة صلبة صفراء بفراغ الترشيح والغسيل مع مل 5 كل من الإيثانول وثنائي إثيل الاثير. تماما حل
- النفط الخام المنتج في 15-25 مل ماء الساخن. تشيل 10 مل حل HCl تتركز في قارورة تصفية بوضعه في حمام الثلج. تصفية الحل الأصفر إلى حل HCl مبردة للحث على هطول الأمطار صلبة نقية أصفر باهت. تصفية هذا متسرعا وتغسل مع 5 مل من 0.5 M HCl، الإيثانول والبروم ثنائي الفينيل- مطيافية الأشعة تحت الحمراء
- تميز باستخدام مجمع. تحقق من النقاء بتحديد الترددات وتمتد في سم 3226 -1 و 1604 سم -1 سم 1297 -1 سم 801 -1. يتم تعيينه الحدث الأصغر مشترك في سم 2069 -1 إلى [رو (NH 3) 5 ن 2] Cl 3-
- ز حل 1.00 روكل 3 · ن ح 2 س (40% رو بالوزن، 4.1 mmol) في 5 مل ح 2 سين بارد الحل البنى الداكن إلى 0 درجة مئوية في حمام الثلج. إضافة مل 11 (0.23 mol) من حل هيدرات الهيدرازين 80% بطريقة دروبويسي. رد الفعل الأولى ستكون قوية مع تطور الغاز، أسفر عن حل براون. واسمحوا أن الحل الناجم عن ذلك ضجة في درجة حرارة الغرفة ح 16؛ أن الحل النهائي سيكون احمرت الظلام
- توليف من [(NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- حل 100 مغ (0.34 ملمول) [رو (NH 3) 5 Cl] Cl 2 في 50 مل من م 1 NH 4 يا في وعاء ضغط القاع المستديرة ثقيلة جدار 200 مل. كاب قارورة مع سداده فضفاضة وتسخين المخلوط رد الفعل عند 75 درجة مئوية ل h. 6 إزالة من الحرارة ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 أيام تسفر عن حل أخضر داكن.
تحذير! تدفئة نتائج سفينة مختومة في تراكم ضغط. تأكد من استخدام الأواني الزجاجية الآمنة للضغط المناسب. لرد الفعل هذا، أن الغرض من ختم السفينة تقليل الخسائر في الغازية NH 3. ولذلك، ضع سداده فضفاضة للسماح بالإفراج عن الضغط الزائد.
- حل 100 مغ (0.34 ملمول) [رو (NH 3) 5 Cl] Cl 2 في 50 مل من م 1 NH 4 يا في وعاء ضغط القاع المستديرة ثقيلة جدار 200 مل. كاب قارورة مع سداده فضفاضة وتسخين المخلوط رد الفعل عند 75 درجة مئوية ل h. 6 إزالة من الحرارة ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 أيام تسفر عن حل أخضر داكن.
- تنقية اللوني لتبادل الأيونات الموجبة
- في كوب 25 مل، تعليق ز 5 راتنج تبادل الأيونات الموجبة (مثلاً شبكة دو 50WX2 200-400 (نموذج ح +) في 10 مل م 0.1 HCl.
- تحميل هذا الملاط إلى عمود 10 مل (10 مم، الارتفاع 15 سم) الملصقة بخزان مذيب 50 مل. أغسل الراتنج مع ما يقرب من 20-30 مل من 0.1 M HCl، حتى النذرة عديم اللون.
- العودة إلى حل الرد الأخضر معزولة في خطوة 1.2.1. لهذا الحل، قم بإضافة HCl مركزة لضبط درجة الحموضة إلى 2، النقطة التي يتغير لون الحل إلى براون-
- تحميل هذا الحل المحمضة إلى العمود راتنج تبادل الأيونات الموجبة أعده في خطوة 1.3.2 بلطف بيبيتينج أنه على رأس الراتنج. واسمحوا النذرة تماما الصرف، ومتابعة تحميل الحل. كرر هذه العملية حتى تم إضافة الحل الكامل. وسيكون الأعلى من الراتنج بني داكن/أسود. الراتنج ستنخفض في حجم قليلاً.
- استخدام الزجاج الخرز لتغطية الجزء العلوي من الراتنج. هذه سيمنع الراتنج من يجري بالانزعاج عندما تتم إضافة حلول جديدة-
- الوت العمود مع 20 مل من 1 M HCl.
- الوت العمود مع زيادة تركيز HCl 1.5 متر (≈ 50 مل). حلاً أصفر ستبدأ بالخروج من العمود. زيادة تركيز HCl إلى 2 متر وتستمر التينج حتى النذرة عديم اللون أو أصفر أخضر شاحب جداً. إجمالي 150-200 مل ستكون مطلوبة من أجل هذه العملية.
- زيادة تركيز HCl إلى 2.5 م (20-50 مل). جمع النذرة كالكسور في أنابيب الاختبار. تزيد على 3 M HCl. وسوف الوت المنتج من العمود كحل الأخضر والبنى. قد تبدأ صغيراً أحمر اللون البنى أيضا يأتي الخروج من العمود. كما هذه الكسور الأحمر المؤكسد الروثينيوم من الشوائب، لا تجمع مع كسور الأخضر والبنى-
- توصيف والتحقق من نقاء] (NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2) [Cl 5
- اختبار كل من الكسور من الخطوة 1.3.8. طريق التحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية. لإنجاز هذه المهمة وإضافة 100 ميليلتر من جزء معين في 2 مل 3 M NH3 وتحليل جانب مطيافية الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة. الكسور التي تحتوي على منتجات نقية سيكون عصابة امتصاص كبير في 360 نيوتن متر وامتصاص أقل كثافة في 600 نانومتر. امتصاص في 480 أو 533 nm الإرشادية الروثينيوم المؤكسد أحمر وأحمر الروثينيوم من الشوائب، على التوالي.
- تجمع الكسور التي تحتوي على منتجات نقية وتتبخر الحل لجفاف بتبخر دوارة. وسوف يكون المنتج معزولة صلبة الأخضر والبنى. غلة عادة تتراوح بين 5-15 ملغ (10-20% العائد). يمكن الحصول على واحد--بلورات، مناسبة حيود الأشعة السينية، بنشر بخار الإيثانول في المحاليل المجمع. تحليل
- للتحقق من النقاء، المجمع بالتحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية في إيجاد حل لدرجة الحموضة 7.4 مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). يمكن تقييم نقاء بأخذ نسبة كثافة 360 نيوتن متر و 600 نانومتر القمم. وهذه النسبة هي 31 لمجمع نقية. للمركبات النجسة، ستكون النسبة أصغر.
- تحليل العينة في الحالة الصلبة واسطة مطيافية الأشعة تحت الحمراء. تكون الأشرطة التشخيص على 3234 سم -1 سم 3151 -1، سم 1618 -1، سم 1313 -1 وسم 815 -1. تعتبر مشتركة شوائب العصابات في 1762 سم -1 و 1400 سم -1, مميزة من NH 4 أحمر الروثينيوم ألغ يمكن تحديد الفرق في سم 1404 -1 و 800 سم -1 سم 1300 -1، سم 1037 -1-
- التقييم لتثبيط امتصاص الكالسيوم المتقدرية بالأسفار التحليل الطيفي
تنبيه! الإجراءات التالية استخدام خلايا الثدييات. وينبغي أن يجري العمل في أغطية الاندفاق الصفحي المناسبة التي هي معتمدة للسلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL2) البحوث.
ملاحظة: [(NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 سوف يشار إليها باسم [رو] في هذا القسم- جعل مخزنة المحتوية على السكر المحلول الملحي (بجس) كما تحليل وسائل الإعلام. بجس حل تضم 110 مم بوكل، مم 1 خ 2 ص 4، 1 مم مجكل 2، 20 مم 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (هيبيس)، سوكسيناتي الصوديوم 5 مم، 30 ميكرون جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-ن، ن ، ن '، ن '-حمض tetraacetic (اجتا). الجمع بين كل شيء ما عدا اجتا، وضبط pH إلى 7.4. إضافة اجتا وتعدل pH إلى 7.4. 50 مل بمقايسة وسائط إضافة 0.5 مل السكر 1 ملغ/مل.
- خلايا "هيلا الثقافة" في 500 سم 2 أطباق بيتري في دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO 2 في 37 ° "هيلا تضخيم جيم" الخلايا تنمو في 100 مم طبق بيتري ببذر لهم في طبق بتري 500 سم 2. أن حجم مجموع وسائل الإعلام في الطبق الكبير 115 مل. وسيؤدي كل طبق كبير حوالي 18 مليون الخلايا، ما يكفي للتحليل الطيفي fluorescence تجربتين.
- تنمو الخلايا حتى تصل إلى 90-95% كونفلوينسي. قم بإزالة الوسائط، وشطف الخلايا مع 15 مل الأس الهيدروجيني 7.4 برنامج تلفزيوني. إضافة 15 مل حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 10 دقائق لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى مل 14 جولة أسفل الصقر أنابيب
- عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير مع مجهر مقلوب، وحساب إجمالي عدد الخلايا وحجم الوسائط اللازمة للوصول إلى الخلايا 7.5 مليون في حجم 1.8 مل من المتوسطة. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 5310 × زاي صب المادة طافية وإضافة حجم المحسوبة من بجس. ريسوسبيند الخلايا بلطف.
- لهذا التحليل، إعداد حلول الأسهم من ديجيتونين 40 مم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، 1 مم الكالسيوم الأخضر-5N في ح 2 س، و 10 مم كاكل 2 في 2 ح سين [رو] الأسهم الحلول، أعدت في المياه النقية، ويمكن أن تتراوح بين 1-3 مم-
ملاحظة: الكالسيوم الأخضر-5N حساسة للضوء. تخزين في الظلام والتقليل من التعرض للضوء.
- لهذا التحليل، إعداد حلول الأسهم من ديجيتونين 40 مم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، 1 مم الكالسيوم الأخضر-5N في ح 2 س، و 10 مم كاكل 2 في 2 ح سين [رو] الأسهم الحلول، أعدت في المياه النقية، ويمكن أن تتراوح بين 1-3 مم-
- الإعداد فلوريميتير إثارة في 506 نانومتر والقراءة الانبعاثات في 532 نانومتر مع صاحب ومبومو يسيطر على 37 ° جيم تحضير ومبومو اكريليك مع شريط ضجة أو عجلة، تعليق خلية 1.8 مل من 1.5.2 أعلاه، 1.8 ميليلتر ديجيتونين الحل، 3.6 & #181؛ الكالسيوم L الأخضر-5N (الحل)، وميليلتر 9 [رو] (للحل الأسهم 1 مم، 5 ميكرومتر التركيز النهائي). احتضان خلايا لمدة 15 دقيقة في فلوريميتير.
- قراءة البيانات كنسبة الإثارة/الانبعاثات بدلاً من استيعاب الخام. هذه الممارسة يقلل الأخطاء المرتبطة بالتقلبات في كثافة مصدر الضوء.
- القيام بتحليل العينة الأولى في الغياب [رو] لقياس تأثير إضافة كاكل 2 على استجابة الخلايا.
- التحليل تبدأ في فلوريميتير مع الإعدادات الموضحة في 1.5.4. الانتظار حوالي 2 دقيقة وضع خط أساس انبعاثات مستقرة، ثم قم بإضافة ميليلتر 1.8 كاكل 2 (10 ميكرون تركيز النهائي). كثافة الانبعاثات ستزيد فورا عند إضافة كاكل 2، وسوف تسوس على مدى دقائق ثم دخول أيونات الكالسيوم الميتوكوندريا. انتظر حتى ينتهي الانحلال (≈ 5 دقائق). إضافة بلعات الكالسيوم الإضافية لتحديد استجابة الخلايا لا تعامل مع [رو] امتصاص الكالسيوم المتقدرية.
- في ومبومو آخر يحتوي على 5 ميكرومتر [رو]، كرر التجربة كما هو موضح أعلاه في 1.5.4.3. حضور المانع، كثافة الانبعاثات تزيد، لكن ليس الاضمحلال. وهذه الملاحظة تعني حظر امتصاص الكالسيوم المتقدرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا الأسلوب توليفة من الكالسيوم المتقدرية امتصاص المانع] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 ابتداء من [رو (NH3)5Cl] Cl2، انطلاق المواد ruthenium(III) معروفة جيدا. [Cl5رو (NH3)] Cl2 يتميز بطيف الأشعة تحت الحمراء، مع وسائط الذبذبات في 3200 سم-1و 1608 سم-1سم 1298-1سم 798-1 (الشكل 1). يمكن أن يعزى الحدث الأصغر في سم 2069-1 إلى [رو (NH3)5ن2] Cl3. رد فعل من هذا النوع Ru(III) مع 1 م NH4يا يتيح [(NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2)] Cl5. ويتضح التقدم المحرز في رد الفعل هذا بتغيير جذري في لون الحل من اللون الأصفر إلى اللون الأخضر. الحل النهائي من رد فعل أخضر داكن اللون. تحمض هذا الحل مع HCl تركيز يؤدي إلى تغيير لون إلى البنى؛ منتج ثانوي لتحييد هذا هو كلوريد الأمونيوم، والتي يمكن أن تلوث المنتج النهائي إذا لم يمارس الرعاية. تنقية للمجمع العائدات عن طريق تبادل الأيونات الموجبة اللوني باستخدام الراتنجات (نموذج ح+ ) مش الحمضية بشدة. الراتنج هو اكويليبراتيد أولاً مع 0.10 M HCl، ويتم تحميل الحل] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 في العمود. التيس ثانوي كلوريد الأمونيوم مع الغسالات HCl 1 متر. المركبات المحتوية على الروثينيوم الوت في تركيزات أعلى من HCl. تأتي سلسلة من الكسور الصفراء، التي تحتوي على [رو (NH3)5Cl] الممتص Cl2 ابتداء من المواد، الخروج من العمود عند تركيز HCl هو 1.5 متر. التيس المنتج المطلوب بين 2.5-3.0 M HCl، والكسور الناتجة تظهر الأخضر إلى الأخضر في اللون البنى.
قبل تجميع الكسور للمنتج، وينبغي التحقق من النقاء بهم. لأن المجمع المطلوب يسلك بعض من الاعتماد على درجة الحموضة في طيف الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة لها، نقترح إضافة مختبرين الصغيرة للكسور بحلول3 NH 3 م الغاية الأساسية لضمان أن الميزات الطيفية هي نفسها بالنسبة لكل من الكسور. يجب عرض الكسور نقية فقط ذروة مكثفة في 360 نانومتر وذروة ضعيفة في 600 نانومتر (الشكل 2). قمم قرب 480 و 533 nm تشير إلى وجود الروثينيوم البنى والأحمر، على التوالي، وذروة هامة في 260 نيوتن متر، مع كتف في 290 نانومتر، يدل على الوجود [رو (NH3)5Cl] Cl2 ابتداء من المواد (الرقم 3 ). تبخر دوارة للكسور الصرفة يتيح المجمع المطلوب صلبة الأخضر والبنى.
يمكن كذلك يتميز مجمع معزول بالتحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء. نانومتر يعرض 360 الطيف (الشكل 2) تجاه الأشعة فوق البنفسجية و 600 العصابات امتصاص شمال البحر الأبيض المتوسط كما هو موضح أعلاه. معامل الانقراض للفرقة 600 نانومتر هو 850 م-1سم-1 والفرقة nm 360 م 27000-1سم-1. ينبغي أن تكون نسبة كثافة الفرقة nm 360 600 الفرقة شمال البحر الأبيض المتوسط بالمقارنة مع 31 في برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4، وهذا المتري يمكن استخدامها بشكل فعال لقياس مدى نقاء المجمع. يجب أن يظهر طيف الأشعة تحت الحمراء كما هو مبين في الشكل 4. التردد تمتد س رو-رو، على سبيل المثال، التشخيص في 850 سم-1. طيف الأشعة تحت الحمراء واستخدمت لتحديد امتداد س رو-رو وضمان لا كلوريد الأمونيوم كان حاضرا في المنتج النهائي. كلوريد الأمونيوم، شوائب مشتركة، قد وسائط الذبذبات في 1762 سم-1 (ضعيف جداً) و 1400 سم-1 (القوى) التي يمكن بسهولة تمييز من طيف الأشعة تحت الحمراء (الشكل 5). الروثينيوم الأحمر هو منتج ثانوي مشترك من رد فعل ويمكن المحددة في الطيف مع وتمتد في سم 1404-1الأشعة تحت الحمراء، 1300 سم-1، سم 1037-1 وسم 800-1، على الرغم من أن بعض التداخل مع المنتج المطلوب سوف يحدث ( الشكل 6).
ولوحظ استجابة امتصاص الكالسيوم في خلايا هيلا بيرميبيليزيد ديجيتونين (الشكل 7). تشير العلامات النجمية إلى إضافة بلعه2 كاكل. لوحظ حضور [(NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2)] Cl5 زيادة في كثافة الانبعاثات عند إضافة الكالسيوم، ولكن لا تسوس بسبب الكالسيوم المتقدرية ولوحظ الإقبال.
الشكل 1 : أطياف الأشعة تحت الحمراء من [رو (NH3)5Cl] Cl2- أطياف الأشعة تحت الحمراء من [رو (NH3)5Cl] Cl2 مع شوائب3 Cl [رو (NH3)5ن2] صغيرة جداً. يشير السهم الأحمر إلى الشوائب في سم 2,069-1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : أطياف الأشعة فوق البنفسجية الممثل بالنسبة للمواد النقية. [(أوه2) (NH3)4رو (μ س) رو (NH3)4(OH2)] Cl5 تجاه الأشعة فوق البنفسجية امتصاص الأطياف والقرب من الأشعة تحت الحمراء (اقحم) اتخذت في درجة الحموضة 7.4 برنامج تلفزيوني. معامل الانقراض لامتصاص الرئيسية في 360 نيوتن متر هو م 27,000-1 سم-1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : أطياف الأشعة فوق البنفسجية مقابل الخليط الخام رد فعل- [(أوه2) (NH3)4رو (μ س) رو (NH3)4(OH2)] Cl5 تجاه الأشعة فوق البنفسجية أطياف امتصاص رد فعل النفط الخام المخلوط قبل تنقية المتخذة في برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4. وتبين الأسهم الحمراء الشوائب المشتركة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الممثل أطياف الأشعة تحت الحمراء للمواد النقية. أطياف الأشعة تحت الحمراء [(NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2)] Cl5. تمتد س رو-رو في 850 سم-1، مساحات أخرى من التذبذب3 NH. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
/>
الشكل 5 : أطياف الأشعة تحت الحمراء التي تتضمن NH4الشوائب Cl. أطياف الأشعة تحت الحمراء [(NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2)] Cl5 مع شوائب كلوريد الأمونيوم. يشير السهم الأحمر إلى كلوريد الأمونيوم في سم 1,400-1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : أطياف الأشعة تحت الحمراء من احمرت الروثينيوم التجاري طيف الأشعة تحت الحمراء [(NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2)] Cl5 (تتبع الأسود) والتجارية الروثينيوم حمراء (أحمر التتبع). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : نتائج امتصاص الكالسيوم الممثل. زيادة الأسفار بسبب إضافة الكالسيوم إلى خليط من خلايا هيلا بيرميبيليزيد ديجيتونين والكالسيوم الأخضر-5N] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 في بجس. يحتوي الفارغة لا Cl] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [5 ويمكن ملاحظة انخفاض الأسفار بسبب امتصاص Ca2 + في الميتوكوندريا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الكالسيوم المتقدرية امتصاص المانع] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 يمكن أن يكون المركب من [رو (NH3)5Cl] Cl2، ruthenium(III) معروفة جيدا ابتداء من المواد، كما هو موضح في هذا الإجراء. ويتحقق التوليف [رو (NH3)5Cl] Cl2 سهولة دون صعوبة تذكر. وبعد إثارة روكل3 لح 16 في هيدرازين هيدرات، ينبغي تعديل درجة حموضة الحل بقيمة 2 مع HCl. انخفاض الأس الهيدروجيني أمر حاسم لتحقيق المنتج المطلوب. إذا رغبت في ذلك، يمكن تعديل هذا التوليف لنموذج [رو (NH3)5ر] Br2 من refluxing في هبر بدلاً من HCl.
وقد لاحظنا بعض الاستراتيجيات للتقليل من تشكيل مشتقات غير مرغوب فيها أثناء توليف مثبطات امتصاص الكالسيوم المتقدرية. جدير بالذكر أن حفظ قارورة توج أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الرد؛ إذا كان مفتوحاً قارورة، يتم تشكيل عدد من مشتقات أخرى، بما في ذلك أحمر الروثينيوم (رورد)، بكميات كبيرة. ومن المفترض أن يضيع الأمونيا الغازية من وعاء التفاعل المفتوح، وهذا الحدث التنازلات تشكيل المنتج المطلوب. حجم قارورة وحجم الأمونيا المائية هي أيضا من المعالم الهامة التي لا ينبغي تعديلها إلى حد كبير عن تلك المبينة في هذا البروتوكول، كما لاحظنا أن كفاءة هذا الرد هو تناقص في قوارير صغيرة. هذا الأسلوب لا جذريا زيادة العائد من هذا المركب بالمقارنة بطريقتين أخرى أننا قد يكشف عنها من قبل. أنه، ومع ذلك، تحتوي على خطوات أقل، وأن تؤدي إلى أقل تشكيل المنتجات الجانبية، مثل رورد. العائد المنخفض يمكن أن يعزى إلى وجود كمية صغيرة من الممتص [رو (NH3)5Cl] Cl2 ، فضلا عن مجهول اتهم درجة عالية من الشوائب التي يتم الاحتفاظ بها في الجزء العلوي من العمود. على الرغم من أننا لم تستكشف العديد من شروط إضافية للرد، فمن الممكن أن التحسينات يمكن أن تتحقق باختلاف وقت رد الفعل وتركيزات مادة التفاعل، للحصول على مردود أعلى.
التنقية] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 هو الجزء الأكثر شاقة وصعبة من هذا البروتوكول. عمود معبأة جيدا سوف يساعد كثيرا في الفصل؛ تحميل الراتنج الملاط نهج فعال لحزمة العمود. تجدر الإشارة إلى أن كما هو زيادة تركيز HCl على مدى شطف العمود، سيتم عقد الراتنج في الحجم. للحصول على المواد النقية بنجاح، ينبغي إلا تحيد المعدل الذي هو زيادة تركيز حامض الإجراء المذكور. وسيكون المنتج النهائي الأخضر والبنى صلبة؛ حل أساسي سوف يكون أخضر داكن ولكن ستكون الحلول الحمضية براون. إذا كان من الملاحظ حلاً أحمر وردي مشرق، التلوث الروثينيوم الأحمر موجودة. يمكن تحديد مقدار روريد باستخدام معامل الانقراض (م 62,000-1·cm-1 في 533 nm). عملية تنقية هذا العام نسبيا للأعمدة راتنج تبادل الأيونات الموجبة القوية.
يمكن اختبار تثبيط امتصاص الكالسيوم المتقدرية باستخدام خلايا هيلا بيرميبيليزيد واستشعار الكالسيوم الفلورية الكالسيوم الأخضر-5N سبيكتروفلوريميتير. 13 , 14 هذا التحليل يتطلب كمية كبيرة من الخلايا ويستلزم ذلك التضخيم للثقافة في كبيرة جداً 500 سم2 طبق بتري. منع هذه قوارير الثقافة كبيرة تحديات إضافية في التقليل من التلوث الميكروبي للمساحات المكشوفة كبيرة جداً. وينبغي أن يجري العمل في تدفق الصفحي مجلس الوزراء للحفاظ على العقم. ويرصد رد الفلورية الخضراء-5N الكالسيوم في خلايا هيلا بيرميبيليزيد fluorescence التحليل الطيفي. إضافة بلعه الخارجية من الكالسيوم ومبومو مشغلات زيادة فورية في الأسفار، الناشئة من أيونات الكالسيوم التي تتفاعل مع جهاز استشعار. على مدى عدة دقائق نظراً لعدم المانع، يضمحل الكثافة نظراً للإقبال على هذه الأيونات الكالسيوم في الميتوكوندريا، عضية التي لا يمكن الوصول إليها من قبل الصبغة. عندما ينفذ هذا التحليل حضور المانع إضافة بولوس أيونات الكالسيوم يؤدي إلى زيادة في كثافة الانبعاثات. الانحلال بسبب امتصاص الكالسيوم الميتوكوندريا، ومع ذلك، غير موجود، التحقق من خصائص امتصاص الكالسيوم المتقدرية المثبطة لهذا المركب. يمكن استخدام هذه العملية كشاشة عامة لمثبطات امتصاص الكالسيوم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا الإجراء للخلايا حقيقية النواة الأخرى ذات الاهتمام. يعتمد هذا التحليل على permeabilization الخارجي الغشاء الخلوي وبالتالي عدم توفير معلومات حول قدرة الامتصاص الخلوي معقدة.
باختصار، وصف هذا البروتوكول التوليف وتنقية مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية رواية المستندة إلى الروثينيوم. هذا المركب قيمة هامة لدراسة بيولوجيا المتقدرية الكالسيوم ودورها في فسيولوجيا الخلية الثديية. مقايسة بسيطة نسبيا لاختبار امتصاص الكالسيوم المتقدرية أيضا من استخدام للتحري والتحقيق من مثبطات جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
وأيد هذا البحث جامعة كورنيل. هذا العمل باستخدام مركز كورنيل "المرافق المشتركة البحث المواد"، هي معتمدة من خلال برنامج مرسيك جبهة الخلاص الوطني (هيئة الهجرة واللاجئين منحة--1120296). وتسلم S.R.N. الدعم بزمالة بحثية الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني (منحة تأيين-1650441) والدكتور ديف Holowka للمساعدة مع هذه التجارب الكالسيوم. أي رأي، النتائج التي توصل إليها، والاستنتاجات أو التوصيات التي أعرب عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين (s)، ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر "المؤسسة الوطنية للعلوم".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
