Summary
Bir protokol, arıtma, malzemelerin ve rutenyum tabanlı inhibitörü olan mitokondrial kalsiyum alımı için sunulmaktadır. Permeabilized memeli hücrelerinde onun etkinliğini değerlendirmek için bir yordam gösterilmiştir.
Abstract
Sentez ve bir mitokondri kalsiyum alımını inhibitörü, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]5 +arıtma ayrıntı. Bu bileşik bir en iyi duruma getirilmiş sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2 den 1 M NH4OH yeşil bir çözüm verimli kapalı bir kap içinde başlar. Arıtma katyon değişim Kromatografi ile gerçekleştirilir. Bu bileşik ile karakterize olan ve saf olmak UV-VIS ve IR spektroskopisi tarafından doğrulandı. Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitör özellikleri permeabilized HeLa hücreleri Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilir.
Introduction
Mitokondrial kalsiyum enerji üretimi ve Apoptozis dahil olmak üzere normal hücre işlevi için kritik süreçlerin bir dizi için anahtar bir düzenleyicisidir. 1 , 2 , 3 mitokondrial kalsiyum uniporter (MCU), iç mitokondrial membran üzerinde bulunduğu bir iyon taşıyıcı protein kalsiyum iyonları akını mitokondri düzenlemektedir. 4 , 5 , 6 MCU kimyasal inhibitörleri çalışmaları bu taşıma protein ve mitokondrial kalsiyum hücresel roller ve işlev çalışmaya devam değerli araçlardır. Bileşik [(HCO2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, MCU bildirilen Kd değeri olan 24 µM.7 için tek bilinen seçici inhibitörleri biridir Bu karmaşık ortak bir kirlilik ticari formülasyonları ve rutenyum kırmızı (RuRed), bir triruthenium di-μ-oxo bulunan ,8,9,10 köprü hexacation Formula [(NH3) 5 Aynı zamanda kalsiyum alımını inhibitörü olarak kullanılan (μ-O) Ru Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +. Ru360 ticari olarak mevcut olmasına rağmen çok pahalıya mal olur. Ayrıca, sentez ve Ru360 yalıtım, meydan zor arıtma işlemleri ve belirsiz karakterizasyon yöntemleri tarafından.
Son zamanlarda bir Ru360 analog, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5erişmek için alternatif prosedürler bildirdin. 11 bu bileşik ile yüksek afinite, Ru360 için benzer MCU engeller. Bu protokol için [Ru (NH3)5Cl] Cl2den başlar bizim en etkili sentezi olan bu bileşik anlatacağız. Arıtma kesinlikle asidik katyon değişim reçine kullanarak ürün ile birlikte ortak tuzaklar bu yordam için detaylı. Ayrıca, karakterizasyonu ve bileşik saflık değerlendirme yöntemleri sunmak ve mitokondrial kalsiyum alımını engelleme onun etkinliğini test etmek için basit bir yaklaşım betimlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Konsantre asitler ve bazlar bu sentezinde kullanılır. Mühendislik kontrolleri (duman hood) ve koruyucu gözlük, eldiven, önlük, tam uzunlukta pantolon ve kapalı-toe ayakkabı da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanımı gibi tepki yerine getirirken tüm uygun güvenlik uygulamaları kullanın.
1. hazırlanması [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- sentez [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 12
- RuCl 3 · n H 2 O
- erimesi 1.00 g (% 40 ağırlık Ru, 4.1 mmol) H 2 O. serin bir buz banyosu 0 ° C'de koyu kahverengi çözümü 5 ml. 11 mL (0,23 mol) % 80 hidrazin hidrat çözüm dropwise bir şekilde ekleyin. İlk tepki kahverengi bir çözümde kaynaklanan evrim gaz ile güçlü olacak. 16 h için oda sıcaklığında karıştırın elde edilen çözüm izin; nihai çözüm koyu kırmızı olacak
Dikkat: Hidrazin akut toksik ve kanserojen. Ayrıca, susuz Bu reaktif patlayıcı biçimleridir. Her zaman olduğu gibi uygun KKE ve duman davlumbaz işlerken kullanın. Bu çözümler kuruluk için konsantre değil. - Bu, yaklaşık 5-10 mL konsantre HCL pH 2 ayarlamak için ekleyin. Bu noktada, belgili tanımlık eriyik-ecek var olmak sarı-kahverengi renkte.
- Bu çözüm karıştırarak 1-2 h için ise 105 ° c ısı. Sarı bir katı eriyik dışarı çökelti. Zaman artık gözle görülür formları çökelti, ısı kaldırmak.
- Her etanol ve Dietil eter oda sıcaklığına kadar serin ve 10 dk. toplamak için vakum filtrasyon ve yıkama ile 5 mL sarı katı bir 0 ° C buz banyosunda koyun reaksiyon karışım izin verin.
- 15-25 ml sıcak su ham ürün tamamen erimesi. 10 mL konsantre HCl bir çözüm bir filtre şişesi içinde bir buz banyosu yerleştirerek chill. Sarı çözüm soğutulmuş HCl çözüm içine soluk sarı saf sağlam bir yağış ikna etmek için filtre. Bu çökelti filtre ve yıkama 5 mL ile her 0,5 M HCl, etanol ve eter.
- Bileşik kullanarak karakterize IR spektroskopisi. By 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 ve 801 cm -1 germe frekanslarda tanımlaması saflık doğrulayın. 2069 cm -1, ortak bir küçük kirlilik [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3 ' e atanır.
- erimesi 1.00 g (% 40 ağırlık Ru, 4.1 mmol) H 2 O. serin bir buz banyosu 0 ° C'de koyu kahverengi çözümü 5 ml. 11 mL (0,23 mol) % 80 hidrazin hidrat çözüm dropwise bir şekilde ekleyin. İlk tepki kahverengi bir çözümde kaynaklanan evrim gaz ile güçlü olacak. 16 h için oda sıcaklığında karıştırın elde edilen çözüm izin; nihai çözüm koyu kırmızı olacak
- [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 sentezi
- 100 mg (0,34 mmol) dağıtılması [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 50 mL / 1 M NH 4 OH 200 mL ağır duvar yuvarlak popolu basınç gemi içinde. Gevşek bir tıpa ile balonun kap ve 75 ° C 6 h. Kaldır ısı için tepki karisimin ısı ve koyu yeşil çözüm verim 4 gün için oda sıcaklığında karıştırın.
Dikkat! Basınç birikmesi mühürlü gemi sonuçlarında Isıtma. Uygun basınç güvenli cam kullandığınızdan emin olun. Bu reaksiyon, gaz halinde olan yakıtlar NH 3 kaybını en aza indirmek için gemi sızdırmazlık amaçlı var. Bu nedenle, gevşek aşırı baskı yayın için izin vermek için tıpa yerleştirin.
- 100 mg (0,34 mmol) dağıtılması [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 50 mL / 1 M NH 4 OH 200 mL ağır duvar yuvarlak popolu basınç gemi içinde. Gevşek bir tıpa ile balonun kap ve 75 ° C 6 h. Kaldır ısı için tepki karisimin ısı ve koyu yeşil çözüm verim 4 gün için oda sıcaklığında karıştırın.
- Arıtma katyon değişim Kromatografi tarafından
- 25 mL kabı içinde 5 g katyon değişim reçine askıya alma (10 ml 0.1 M Örneğin, kafes (H + form) Dowex 50WX2 200-400 HCl.
- 50 mL çözelti su deposu ile yapıştırılmış bu Bulamaç bir 10 mL sütununa (10 mm çap, 15 cm yükseklik) yükleyin. Eluate renksiz olana reçine ile yaklaşık 20-30 mL 0.1 M HCL, yıka. 1.2.1. adımda izole yeşil tepki çözüm
- dönün. Bu, konsantre HCl pH 2, hangi noktasında çözüm renk değiştirir Brown'a ayarlamak için çözüm.
- Bu acidified çözüm adım 1.3.2 yavaşça üzerine reçine pipetting tarafından hazırlanan katyon değişim reçine sütuna yerleştirin. Tamamen drenaj ve çözüm yüklemeye devam eluate izin ver. Tüm çözüm eklenene kadar bu işlemi yineleyin. Reçine üst koyu kahverengi/siyah olacak. Reçine hacmindeki biraz azalacak.
- Reçine üst kapsayacak şekilde kullanım cam boncuk. Bunlar-ecek önlemek reçine yeni çözümler eklendiğinde rahatsız.
- 20 mL 1 M HCL sütunla elute.
- Elute sütun ile bir artan 1,5 M HCl konsantrasyonu (≈ 50 mL). Sarı bir çözüm sütun gelmeye başlayacak. 2 m HCl konsantrasyonu artırmak ve devam eluate renksiz olana eluting veya bir çok soluk yeşil-sarı. 150-200 mL toplam hacmi bu işlem için gerekli olacak.
- 2.5 m (20-50 mL) HCl konsantrasyonu artırmak. Kesirler testi tüpler olarak eluate toplamak. 3 M HCl artırın. Ürün sütundan bir yeşil-kahverengi çözüm olarak elute. Kırmızı-kahverengi kesir de uzakta-in sütun gelmeye başlayabilir. Bu kesirler oksitlenmiş rutenyum kırmızı kirleri olduğundan, yeşil-kahverengi kesirler ile havuz değil.
- Karakterizasyonu ve doğrulama saflık [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- kesirler Test Adım 1.3.8. UV-VIS spektroskopisi tarafından. Bu görevi gerçekleştirmek için belirli bir kısmını 100 µL 3 M NH3 2 mL ekleyin ve UV-VIS spektroskopisi tarafından analiz. Saf ürün içeren kesirleri 360'a büyük Absorbans grubu olacak nm ve daha az yoğun Absorbans 600 nm. 480 veya 533 nm Absorbans oksitlenmiş rutenyum kırmızı ve rutenyum kırmızı kirleri, gösterge sırasıyla.
- Saf ürün içeren kesirleri havuz ve kuruluk çözümü tarafından döner buharlaşma buharlaşır. Ürün bir yeşil-kahverengi katı izole olacak. Verimleri genellikle 5-15 mg (% 10-20 verim) sırasına bulunmaktadır. Tek kristalleri, x-ışını kırınımı için uygun etanol buharı difüzyon bahçedeki sulu çözümler içine tarafından elde edilebilir. Saflık, doğrulamak için
- UV-VIS spektroskopisi bir çözüm pH 7.4 fosfat tamponlu tuz (PBS) tarafından bileşik analiz. Saflık-var değerlendirildi 360 yoğunluğu oranı alarak nm ve 600 nm tepeler. Bu oran saf bir bileşiği 31'dir. Saf olmayan bileşikler için oranı daha küçük olur.
- Katı hal örnek tarafından IR spektroskopi analiz. Tanılama bantları 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 ve 815 cm -1 vardır. Ortak kirlilik bantları 1762 cm -1 ve 1400 cm -1 de görülür, NH karakteristik 4 CL rutenyum kırmızı bantları 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 ve 800 cm -1 belirlenebilir.
- Mitokondrial kalsiyum alımını inhibisyon Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilmesi
dikkat! Memeli hücreleri aşağıdaki yordamları kullanın. İş yürütülen biyolojik güvenlik seviye için 2 (BSL2) araştırma sertifikalıdır uygun laminar akış davlumbaz içinde.
Not: [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 atıfta [Ru] Bu bölümde- arabelleğe alınmış olun glikoz içeren tuzlu çözüm (BGSS) olarak tahlil medya. BGSS bir çözümdür oluşan 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 5 mM sodyum süksinat, 30 µM etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tetraacetic asit (EGTA). EGTA dışında her şeyi birleştirmek, pH 7.4 için ayarlayın. EGTA ekleyin ve pH 7.4 için yeniden ayarlayabilirsiniz. Tahlil medya için 50 mL 0.5 mL 1 mg/mL glikoz ekleyin.
- Kültür HeLa hücreleri 500 cm 2 Petri yemeklerinde Dulbecco ' s % 10 fetal sığır serum (FBS) ile % 5 CO 2 tohum tarafından bir 100 mm Petri kabına büyüyen 37 ° c yükseltmek HeLa hücreleri de oksijen bir kuluçka ile modifiye kartal orta (DMEM) Onları bir 500 cm 2 Petri içinde. 115 mL büyük tabak içinde toplam medya birimdir. Her büyük çanak yaklaşık 18 milyon hücre, iki Floresans spektroskopisi deneyler için yeterli verim.
- Büyümek hücreleri % 90-95 ulaşana kadar confluency. Medyayı çıkarın ve 15 mL pH 7.4 PBS hücrelerle durulayın. PBS içinde 15 mL 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve hücreleri ayırmak 10 dakikadır kuluçkaya. Hücreleri alt Şahin tüpler yuvarlak 14 mL transfer
- Say trypan mavi ve bir hemasitometre ile ters bir mikroskop kullanarak hücreleri ve hücre ve toplam 7.5 milyon hücre 1,8 mL birim başına ulaşması için gerekli ortam hacmi hesaplamak Orta. Hücreler için 5310 × g. Decant süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi ve BGSS hesaplanan hacmi ekleyin. Hücreleri nazikçe resuspend.
- Bu tahlil için Dimetil sülfoksit (DMSO), 1 mM kalsiyum yeşil-5N H 2 O ve 10 mM CaCl 2 H 2 o [Ru] hisse senedi çözümlerinde, 40 mM digitonin hisse senedi çözümler saf suda hazırlanan hazırlamak, 1-3 mM arasında değişen olabilir.
Not: kalsiyum yeşil-5N ışığa duyarlı. Saklamak karanlıkta ve pozlama ışık en aza indirgemek.
- Bu tahlil için Dimetil sülfoksit (DMSO), 1 mM kalsiyum yeşil-5N H 2 O ve 10 mM CaCl 2 H 2 o [Ru] hisse senedi çözümlerinde, 40 mM digitonin hisse senedi çözümler saf suda hazırlanan hazırlamak, 1-3 mM arasında değişen olabilir.
- Fluorimeter 506 nm ve okuma 532, emisyon heyecanlandırmak için kurulum nm ile 37, kontrollü küvet tutucu ° C. hazırlayın bir heyecan bar veya tekerlek, 1,8 mL hücre süspansiyon 1.5.2 yukarıda, 1.8 µL digitonin çözüm, 3.6 üzerinden bir akrilik küvet ve #181; L kalsiyum yeşil-5N (çözüm) ve 9 µL [Ru] (1 mM hisse senedi çözüm, 5 µM son konsantrasyonu için). Hücreler fluorimeter 15dk için kuluçkaya.
- Veri ham emme yerine uyarma/emisyon oranı olarak okuyun. Bu uygulama ışık kaynağı şiddeti dalgalanmalar ile ilişkili hatalar en aza indirir.
- Hücreleri yanıt CaCl 2 ek etkisini ölçmek için [Ru] yokluğunda ilk örnek analizi gerçekleştirmek.
- Begin analiz 1.5.4 içinde açıklanan ayarları ile fluorimeter. Bir sabit emisyon temel kurmak için yaklaşık 2 dakika bekleyin ve sonra 1.8 µL CaCl 2 (10 µM son konsantrasyonu) ekleyin. Emisyon yoğunluğu hemen CaCl 2 eklenmesi artacak ve kalsiyum iyonları mitokondri girerken sonra dakika boyunca çürüme. Çürüme işlemini tamamlayana kadar bekleyin (≈ 5 dk). Mitokondrial kalsiyum alımını yanıt [Ru] tedavi değil hücre belirlemek için ek kalsiyum boluses eklemek.
- 1.5.4.3 içinde yukarıda açıklandığı gibi başka bir küvet içinde deneme tekrar 5 mikron [Ru], içeren. İnhibitörü huzurunda emisyon yoğunluğu artırmak ama değil çürük. Bu gözlem ettiğinizi mitokondrial kalsiyum alımı bloke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem bir sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2başlayarak mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 açıklar bir iyi bilinen ruthenium(III) başlangıç materyali. [Ru (NH3)5Cl] CL2 IR spektroskopisi, 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1ve 798 cm-1 (şekil 1) titreşim modları ile karakterizedir. 2069 cm-1 adlı küçük bir kirlilik [Ru (NH3)5N2] Cl3' e bağlanabilir. Bu Ru(III) tür 1 M NH4OH ile tepki [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5affords. Bu reaksiyon ilerlemesini kanıtladığı sarı çözümden yeşil rengini dramatik bir değişim. Koyu yeşil renkli son tepki çözümdür. Asitleştirme konsantre HCl sonuçlarında kahverengi bir renk değişikliği ile bu çözümün; Bu nötralizasyon bir yan ürünü amonyum klorür, bakım değil icra hangi nihai ürün kontamine olduğunu. Bahçedeki arıtma kesinlikle asidik mesh (H+ form) reçine kullanarak katyon değişim Kromatografi ile devam eder. Reçine ilk 0,10 M HCl ile equilibrated ve çözüm [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 sütun üzerinde yüklenir. Amonyum klorür yan ürünü 1 M HCl yıkama ile elutes. Rutenyum içeren bileşikler yüksek HCl konsantrasyonu elute. Malzeme başlayan unreacted [Ru (NH3)5Cl] Cl2 içeren, sarı kesirler bir dizi sütun kapalı HCl konsantrasyonu 1,5 M olduğunda gel. İstenen ürün 2.5-3.0 M arasında elutes HCl ve ortaya çıkan kesirler için yeşil görünür yeşil-kahverengi renkte.
Ürünün kesirler havuzu önce onların saflık doğrulanması gerekir. Bazı pH bağımlılığı, UV-vis spektrum içinde istenen bileşik sergileyen çünkü son derece temel 3 M NH3 çözümlere spektral özellikleri tüm kesirler için aynı olduğundan emin olmak için kesirler küçük aliquots ekleyerek öneririz. Saf kesirler, yalnızca görüntüler yoğun bir tepe 360'nm ve zayıf bir tepe 600 nm (Şekil 2). Tepeler 480 ve 533 nm yakınındaki belirtmek rutenyum kahverengi ve kırmızı, sırasıyla ve önemli bir tepe 260 nm, 290, bir omuz ile nm, malzeme (şekil 3 Başlangıç [Ru (NH3)5Cl] Cl2 varlığı belirtir ). Saf kesirler döner buharlaşma istenen bileşik bir yeşil-kahverengi katı tanıyor.
İzole bileşik daha fazla UV-VIS ve IR spektroskopisi ile karakterize edilebilir. UV-vis spektrum (Şekil 2) görüntüler 360 nm ve yukarıda açıklandığı gibi 600 nm Absorbans bantları. Geçersiz kalma katsayısı 600 nm grup için 850 M-1cm-1 ve 360 nm grup için 27000 M-1cm-1. 600 nm gruba göre 360 nm grup yoğunluğu oranı 31 pH 7.4 PBS içinde olmalı ve bu ölçümü etkin bileşik saflığı ölçmek için kullanılabilir. IR spektrum şekil 4' te gösterildiği gibi görünmesi gerekir. Ru-O-Ru germe, örneğin, 850 cm-1tanı sıklığıdır. IR spektrum Ru-O-Ru streç belirlemek için ve hiçbir amonyum klorür son üründe mevcut sağlamak için istihdam edildi. Amonyum klorür, ortak bir kirlilik, 1762 cm-1 (çok zayıf) ve bu kolayca IR spektrum (şekil 5) ayırt edilebilir 1400 cm-1 (güçlü) titreşim modu vardır. Rutenyum kırmızı tepki ortak bir yan ürünü ve IR spektrumu uzanıyor, 1404 cm-1ile 1300 cm-1, 1037 cm-1 ve 800 cm-1tanımlanan, her ne kadar bazı istenilen ürün ile üst üste ortaya çıkar) Şekil 6).
Kalsiyum alımını yanıt HeLa hücreleri digitonin permeabilized olarak (Şekil 7) görülmektedir. Yıldız işaretlerini CaCl2 bolus eklenmesi gösterir. [(OH2) (NH3)4varlığında (μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] kalsiyum ek ama hayır çürümesi mitokondrial kalsiyum nedeniyle üzerine Cl5 emisyon yoğunluğu bir artış görülmektedir alımı görülmektedir.
Resim 1 : [Ru (NH3)5Cl] Cl2Infrared spektrumları. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 bir çok küçük [Ru (NH3)5N2] Cl3 kirlilik ile kızılötesi spectra. Kırmızı ok kirlilik 2.069 cm-1de gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Saf malzeme için temsilcisi UV-VIS spectra. [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-VIS Absorbans spectra ve pH 7.4 PBS alınan kızılötesi (gömme) yakın. 360 büyük Absorbans için yok olma katsayısı nm olduğunu 27.000 M-1 cm-1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : UV-VIS spectra ham tepki karışımı. [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-VIS Absorbans spectra pH 7.4 PBS alınan arıtma önce ham tepki karışımı. Kırmızı oklar, ortak yabancı maddeleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Saf malzeme için temsil edici kızılötesi spectra. Kızılötesi spectra [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. Ru-O-Ru streç 850 cm-1, diğer uzanan NH3 osilatörler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
/>
Şekil 5 : NH4Cl yabancı maddeleri içeren kızılötesi spectra. [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 amonyum klorür kirlilik ile kızılötesi spectra. Kırmızı ok amonyum klorür 1400 cm-1de gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Ticari rutenyum kırmızı kızılötesi spectra [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 (siyah izleme) ve ticari rutenyum kırmızı (kırmızı izle) kızılötesi spektrum. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Temsilcisi kalsiyum alımı sonuçları. Floresans artış nedeniyle kalsiyum digitonin permeabilized HeLa hücreleri, kalsiyum yeşil-5N ve [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 bir kokteyl için eklenmesi BGSS içinde. Boş yok [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 içerir ve mitokondri içine Ca2 + alımı nedeniyle Floresans azalma görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 sentezlenmiş [Ru (NH3)5Cl] Cl2, iyi bilinen bir ruthenium(III) olabilir malzeme, bu yordamda açıklandığı gibi başladı. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 sentezi kolayca küçük zorlukla elde edilir. 16 h için RuCl3 hidrazin içinde karıştırma sonra hidrat, çözüm pH HCl ile 2 değeri için ayarlanmalıdır. PH bırakma istediğiniz ürün elde etmek için önemlidir. İstenirse, bu sentez formu [Ru (NH3)5Br] Br2 ' ye HBr HCl yerine refluxing tarafından değiştirilebilir.
İstenmeyen yan oluşumu mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü sentezi sırasında en aza indirmek için bazı stratejiler gözlemledim. Özellikle, Şapkalı şişesi tutarak bu reaksiyon başarısı için önemlidir; şişeye açıksa, bir dizi rutenyum kırmızı (RuRed), dahil olmak üzere diğer yan kayda değer miktarda oluşur. Muhtemelen, gaz halinde olan yakıtlar amonyak açık tepki gemi ve istediğiniz ürün bu olay tavizler oluşumu kaybolur. Şişeye boyutunu ve sulu amonyak hacmi de bu reaksiyon verimliliğini daha küçük şişeler içinde azalır fark etmiş gibi önemli ölçüde bu protokol için açıklanana değiştirilmemelidir önemli parametreler bulunur. Bu yöntem daha önce açıklanması diğer iki yöntem ile karşılaştırıldığında bu bileşik verimi büyük ölçüde artırmaz. Bu, ancak, daha az sayıda adımla içeren ve daha az yan ürün oluşumu, RuRed gibi ortaya çıkmasına. Düşük verim unreacted [Ru (NH3)5Cl] Cl2 yanı sıra son derece sütunun üst kısmında korunur kirleri tahsil bilinmeyen küçük bir miktar varlığı ilişkilendirilebilir. Her ne kadar birçok ek reaksiyon koşulları araştırılmalıdır değil, iyileştirmeler reaksiyon süresi ve daha yüksek verim elde etmek için kontrollerimiz konsantrasyonları, değişen tarafından gerçekleştirilebilir mümkündür.
[(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 arıtma en sıkıcı ve zor bu protokolü bölümüdür. Bir de paketlenmiş sütun büyük ölçüde ayrılma için size yardımcı olacaktır; reçine Bulamaç olarak yükleme sütun paketi için etkili bir yaklaşımdır. Bu sütun elüsyon boyunca HCl konsantrasyonu arttıkça, reçine boyutunda sözleşme olması gerekmektedir. Başarılı bir şekilde saf malzemesi elde etmek üzere hangi asit konsantrasyonu artar oranı belirtilen yordam sapma değil. Nihai ürün-ecek var olmak sağlam bir yeşil-kahverengi; temel bir çözüm koyu yeşil olacaktır ama asidik çözümleri kahverengi olacak. Parlak pembe-kırmızı çözüm gözlem yapılırsa rutenyum kırmızı contaminations mevcuttur. RuRed miktarı geçersiz kalma katsayısı kullanarak belirlenebilir (533, 62,000 M-1·cm-1 nm). Bu arıtma nispeten güçlü katyon değişim reçine sütunlar için genel bir süreçtir.
Mitokondrial kalsiyum alımını inhibisyon permeabilized HeLa hücreleri, florasan kalsiyum sensör kalsiyum yeşil-5N ve bir spectrofluorimeter kullanarak test edilebilir. 13 , 14 bu tahlil hücrelerinin büyük bir miktar gerektirir ve bu nedenle bir çok büyük 500 cm2 Petri kabına kültüründe amplifikasyon gerektirebilir. Bu büyük kültür şişeler maruz yüzey alanlarını çok büyük olduğundan mikrobiyal kirlenme en aza indirme ek zorluklar önlemek. İş laminar akış kısırlık korumak için kabine yapılmalıdır. Kalsiyum yeşil-5N permeabilized HeLa hücreleri floresan yanıt Floresans spektroskopisi tarafından izlenir. Kalsiyum küvet için bir dış bolus ilavesi Floresan, sensör ile etkileşim kalsiyum iyonları kaynaklanan hemen artış tetikler. Yokluğunda bir inhibitörü, birkaç dakika boyunca, yoğunluğu alımını mitokondri, bu kalsiyum iyonu tarafından boya erişilemiyor bir organel nedeniyle bozunmaları. Ne zaman bu tahlil bir inhibitörü bir bolus kalsiyum iyonlarının ilavesi huzurunda gerçekleştirilen emisyon yoğunluğu için bir artış açmaktadır. Çürümesi nedeniyle mitokondrial kalsiyum alımı, mevcut, değil, ancak, mitokondrial kalsiyum alımını inhibitör özelliklerini bu bileşik doğrulanıyor. Bu işlem genel bir ekran olarak kalsiyum alımını inhibitörleri için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yordamı ilgi diğer ökaryotik hücreler için uygulanabilir. Bu tahlil, dış permeabilization bağlı hücresel membran böylece bir kompleks hücresel alımını yeteneği hakkında bilgi sağlamaz.
Özet olarak, bu iletişim kuralını sentezi ve rutenyum tabanlı roman mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü arıtma açıklayan. Mitokondrial kalsiyum ve memeli hücre fizyolojisi rolü biyoloji okuyan için önemli bir değer olan bileşiktir. Mitokondrial kalsiyum alımını testleri için nispeten basit tahlil tarama ve yeni inhibitörleri incelenmesi için kullanım da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Bu araştırma Cornell Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Bu eser Cornell Merkezi malzemeleri araştırma paylaşılan Tesisatı, NSF MRSEC programı (Grant DMR-1120296) ile desteklenen için kullanın yaptı. S.R.N. destek bir NSF yüksek lisans araştırma bursu (Grant DGE - 1650441) ve Dr Dave Holowka kalsiyum deneyler hakkında yardım almak için kabul eder. Herhangi bir görüş, bulgular ve sonuç ya da öneriler bu malzeme ifade yazarlar (s) ve mutlaka Ulusal Bilim Vakfı görüşlerini yansıtmamaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
