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Biochemistry

डीएनए धुंधला Formazan नीले प्रकाश जोखिम से प्रेरित वर्षण पर आधारित विधि

Published: January 28, 2018 doi: 10.3791/56528
Automatic Translation
1, 1, 1
1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

Summary

इस विधि चयनात्मक धुंधला और एक SYBR ग्रीन मैं/नाइट्रो ब्लू Tetrazolium समाधान में जेल भिगोने और फिर सूरज की रोशनी या एक नीली बत्ती स्रोत को उजागर द्वारा जैल में डीएनए के ठहराव की अनुमति देता है । यह एक दृश्य हाला पैदा करता है और लगभग कोई उपकरण की आवश्यकता है, यह क्षेत्र के उपयोग के लिए आदर्श बना ।

Abstract

डीएनए धुंधला तरीके जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं । हम एक सरल तरीका है कि एक रंगीन वेग के गठन से नग्न आंखों को डीएनए दृश्य की अनुमति देता है बनाया है । यह 1x के एक समाधान में acrylamide या agarose डीएनए जेल भिगोने के द्वारा काम करता है (२.० µ एम के बराबर) SYBR ग्रीन मैं (एसजी मैं) और ०.२० mM नाइट्रो ब्लू tetrazolium है कि जब सूरज की रोशनी या विशेष रूप से नीले प्रकाश को उजागर formazan की एक बैंगनी वेग का उत्पादन । इसके अलावा, डीएनए वसूली परीक्षण एक agarose हमारे विधि के साथ सना हुआ जेल में एक एम्पीसिलीन प्रतिरोधी प्लाज्मिड का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । कालोनियों की एक बड़ी संख्या पारंपरिक के साथ की तुलना में हमारे विधि के साथ प्राप्त की थी एसजी मैं पराबैंगनी रोशनी के साथ प्रयोग दाग । वर्णित विधि तेजी से, विशिष्ट है, और गैर डीएनए का पता लगाने के लिए विषैले, एक transilluminator के बिना "नग्न आंख" के लिए, और सस्ती और क्षेत्र के उपयोग के लिए उपयुक्त है । इन कारणों के लिए, हमारे नए डीएनए धुंधला विधि दोनों अनुसंधान और उद्योग के लिए संभावित लाभ है ।

Introduction

जैव रसायन और आण्विक जीवविज्ञान में अग्रिमों के साथ, डीएनए को शामिल अध्ययन बेहतर तकनीक की आवश्यकता के लिए डीएनए का विश्लेषण किया है । डीएनए दाग के लिए पहली विधि चांदी धुंधला था, जो बहुत संवेदनशील है, लेकिन selectivity का अभाव है और नमूना वसूली की अनुमति नहीं है । बाद में, फ्लोरोसेंट डीएनए धुंधला के विकास नमूना वसूली की संभावना के साथ डीएनए के चयनात्मक ठहराव की अनुमति दी । डीएनए ठहराव के लिए इस्तेमाल किया पहले फ्लोरोसेंट रंजक में से एक ethidium ब्रोमाइड1है, जो mutagenic2है । हालांकि, अब ऐसे GelRed और SYBR ग्रीन मैं (एसजी मैं)3के रूप में, सुरक्षित और अधिक संवेदनशील हैं कि फ्लोरोसेंट रंजक में सुधार कर रहे हैं; लेकिन इन फ्लोरोसेंट रंजक के सभी एक पराबैंगनी (यूवी) transilluminator या fluorimeter के उपयोग की आवश्यकता होती है ।

वहां दिख धुंधला डीएनए के लिए अंय तकनीकों रहे हैं, जैसे methylene ब्लू4 और क्रिस्टल वायलेट5,6,7,8,9, लेकिन इन सभी को कम संवेदनशीलता से ग्रस्त है और selectivity. tetrazolium लवण कार्बनिक यौगिकों में कमी करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, और जब यह होता है वे एक अघुलनशील और रंगीन formazan के रूप में10,11हाला । हाल ही में कुछ bivalent tetrazolium साल्ट को उनके पॉजिटिव tetrazolium रिंग्स के कारण डीएनए को बाइंड करते हुए12दिखाया गया है ।

हाल ही में एक प्रकाशन में13, polyacrylamide जैल में दाग और मात्रा में डीएनए के लिए एक नया दिखाई तकनीक का प्रस्ताव किया गया था, एक bivalent tetrazolium नमक की कमी का उपयोग कर नाइट्रो ब्लू tetrazolium (एनबीटी) और ethidium ब्रोमाइड, GelRed जैसे फ्लोरोसेंट रंजक SYBR हरे मैं और SYBR सोना । यह प्रतिक्रिया नीली बत्ती या सूरज की रोशनी की उपस्थिति में काम किया और बेहतर गुणवत्ता के साथ एक यूवी transilluminator के साथ एसजी I के उपयोग की तुलना में नमूना वसूली की अनुमति दी । इस कागज का उद्देश्य tetrazolium लवण का उपयोग कर धुंधला तकनीक का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है ।

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Protocol

1. तैयारी और जेल चल रहा है

  1. सोडियम Dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) नुस्खा Sambrook और रसेल14 में पाया, लेकिन पानी के बजाय एसडीएस का उपयोग कर गैर-denaturing 12% polyacrylamide जेल जैल तैयार करें ।
    1. 5 मिलीलीटर की संपति जेल तैयार करने के लिए, आसुत जल का १.७ मिलीलीटर, acrylamide/बीआईएस acrylamide के 2 मिलीलीटर (30/0.8% डब्ल्यू/वी), १.५ मीटर Tris पीएच ८.८, ०.०५ एमएल का 10% अमोनियम persulfate, और TEMED के ०.००२ मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    2. स्टैकिंग जेल के 2 मिलीलीटर तैयार करने के लिए १.५ मिलीलीटर पानी की, ०.३३ मिलीलीटर की acrylamide/बीआईएस acrylamide (30/0.8% डब्ल्यू/वी), ०.२५ मिलीलीटर की 1 मीटर Tris पीएच ६.८, ०.०२ मिलीलीटर की 10% अमोनियम persulfate, और ०.००२ मिलीलीटर की TEMED । जेल के आयाम ७.३ cm x ८.२ cm x ०.०७५ cm (एल एक्स डब्ल्यू एक्स डी) हैं ।
      नोट: सबसे अच्छा संवेदनशीलता के लिए ०.७५ मिमी मोटाई के एक 15 अच्छी तरह से कंघी का प्रयोग करें ।
  2. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए 6x लोड हो रहा है बफर और डीएनए नमूने की उचित मात्रा में जोड़ें (उदाहरण के लिए उपयोग 1 µ एल के 6x लोड हो रहाहै बफर डीएनए नमूने के 5 µ एल).
  3. जेल को वर्टिकल ट्रो चैंबर में रखें ।
    1. के साथ चैंबर भरें 1x ताे 2 जैल चलाने के लिए बफर के ७५० मिलीलीटर । तैयार करने के लिए 1 L का 50x ताे, Tris बेस का ४४२ ग्राम, ५७.१ मिलीलीटर का हिमनदों एसिटिक एसिड, और १०० मिलीलीटर का ०.५ मीटर EDTA पीएच 8 का उपयोग करें । 1 एल के अंतिम खंड में आसुत जल जोड़ें
    2. जेल में नमूने लोड । 2 ज के लिए १०० वी पर जेल चलाते हैं ।
  4. वैकल्पिक रूप से, Sambrook14में पाया नुस्खा का उपयोग कर एक 1x ताे agarose जेल तैयार करें ।
    1. इसमें ३०० एमएल का 1x ताे डालकर क्षैतिज ट्रो चैंबर में डालें । चलाने के लिए जेल ४५ मिनट में १०० V.

2. एनबीटी-एसजी मैं धुंधला (चित्रा 1) ।

  1. Acrylamide जेल दाग ।
    1. समाधान तैयार करें: ०.१% w/v NBT and 1.2 x एसजी I.
      नोट: यह ethidium ब्रोमाइड, GelRed और SYBR सोने के बजाय एसजी मैं का उपयोग करने के लिए संभव है, लेकिन एसजी मैं सबसे अच्छा प्रदर्शन किया था ।
    2. उचित आकार के एक कंटेनर में 1.2 x SYBR ग्रीन मैं समाधान के १६.७५ मिलीलीटर डालो ।
      नोट: हम एक कंटेनर के रूप में एक पिपेट टिप बॉक्स के ढक्कन का इस्तेमाल किया, और इन संस्करणों इस कंटेनर का उपयोग कर जेल कवर करने के लिए गणना कर रहे हैं; इसके आयामों में ११.६ सेमी x ७.६ सेमी x २.६ सेमी (एल एक्स डब्ल्यू एक्स डी) हैं ।
    3. समाधान में जेल प्लेस । जोड़ें ३.२५ मिलीलीटर की ०.१% w/v nbt सॉल्यूशन को ०.२ mM NBT एंड 1x (२.० µ m के बराबर) एसजी मैं अंतिम सांद्रता दे ।
    4. प्लास्टिक की फिल्म के साथ कंटेनर सील, और पूरी तरह से एल्यूमीनियम पंनी के साथ कंटेनर लपेटो किसी भी परिवेश प्रकाश ब्लॉक ।
      नोट: प्लास्टिक फिल्म छप रोकने के लिए और धुंधला समाधान के साथ एल्यूमीनियम पंनी की प्रतिक्रिया से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    5. ६० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर 25 मिनट के लिए हिलाओ ।
    6. एल्यूमीनियम और प्लास्टिक कवर निकालें । ९० मिनट अधिकतम के लिए सूर्य के रोशनी को बेनकाब । हर 5 मिनट की जांच करें जब तक ब्याज की बैंड दिखाई देता है ।
    7. नीले प्रकाश का उपयोग करने के लिए, 3 प्रकाश उत्सर्जक डायोड के साथ एक protoboard तैयार (एलईडी) और जेल की सतह से 5 मिमी के बारे में एल ई डी जगह (लगातार दाग की जाँच करें, एलईडी प्रकाश स्रोत की तीव्रता पर निर्भर करेगा समय की जरूरत के रूप में).
  2. Agarose जेल दाग ।
    1. एक 1% agarose जेल के रूप में खंड १.४ (आयाम है 1 सेमी x ६.२ cm x 7 सेमी; एल एक्स डब्ल्यू एक्स डी) में वर्णित के रूप में तैयार करने और चलाने के बाद, इन संशोधनों के साथ २.१ में के रूप में एक ही चरणों का पालन करें:
    2. एक पिपेट टिप बॉक्स के ढक्कन में 1.2 x एसजी मैं समाधान के ४१.९ मिलीलीटर डालो; इसके आयामों में ११.६ सेमी x ७.६ सेमी x २.६ सेमी (एल एक्स डब्ल्यू एक्स डी) हैं । ८.१ mL की ०.१% जोड़ें NBT solution.
    3. प्लास्टिक की फिल्म के साथ कंटेनर सील, और फिर पूरी तरह से एल्यूमीनियम पंनी के साथ कंटेनर लपेटो किसी भी परिवेश प्रकाश ब्लॉक ।
    4. ६० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर 1 घंटे के लिए हिलाओ ।

3. डेटा विश्लेषण ।

  1. एनबीटी-एसजी मैं अंशांकन घटता है ।
    1. १२०० डीपीआई पर स्कैनिंग द्वारा जेल छवियों को प्राप्त करें ।
    2. छवि विश्लेषण के लिए खुला सॉफ्टवेयर । एक छवि संपादक का उपयोग कर छवियों को सीधा । कोई छवि densitometry चलाएं ।
    3. वक्र के तहत क्षेत्र की गणना करें । डीएनए एकाग्रता बनाम सिग्नलमैक्स का ग्राफ तैयार करें ।

4. डीएनए वसूली ।

  1. 1x में 1% agarose जेल तैयार करें ताे Sambrook14में मिले रेसिपी का प्रयोग करें ।
  2. इसमें ३०० एमएल का 1x ताे डालकर क्षैतिज ट्रो चैंबर में डालें । चित्रा 2में दी गई योजना के बाद १०० एनजी/µ l pDJ10015 प्लाज्मिड और डीएनए सीढ़ी का भार 4 µ l १०० V पर 1 ज के लिए जेल चलाते हैं ।
  3. मार्क और वजन दो 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों ।
  4. आदेश में दो समान आधा है के लिए नीचे के बीच जेल में कटौती । हर एक सीढ़ी और नमूना प्लाज्मिड अलग धुंधला तकनीक की तुलना में शामिल होना चाहिए । एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 2में है ।
  5. NBT के साथ एक-डेढ़ दाग-एसजी मैं चरण 2 में के रूप में ।
    1. एक साफ स्केलपेल का उपयोग कर प्लाज्मिड बैंड कट । एक ट्यूब और वजन में जेल टुकड़ा बचाओ ।
  6. मैं के साथ जेल के अंय भाग दाग 1x एसजी मैं समाधान के ५० मिलीलीटर और धीरे शेक (६० rpm) अंधेरे में 1 ज के लिए जेल के साथ ।
    1. एक transilluminator पर जेल प्लेस और 2 मिनट के लिए बेनकाब । प्लाज्मिड बैंड एक साफ स्केलपेल का उपयोग कर बाहर कट ।
    2. अंय ट्यूब और वजन में जेल टुकड़ा बचाओ ।
      नोट: -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों रखते हुए प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  7. एक वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर प्लाज्मिड निष्कर्षण बाहर ले ।

५. प्लाज्मिड सामान्यीकरण.

  1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, निकाले प्लाज्मिड के 10 µ एल और प्रकार मैं पानी की ६० µ एल जोड़ें । मिश्रण और एक ६० µ एल क्वार्ट्ज cuvette करने के लिए स्थानांतरण या एक Nanodrop में सीधे 2 µ एल का उपयोग करें ।
  2. २३० से ३२० एनएम के बीच अवशोषण स्पेक्ट्रा उपाय । नमूना है प्लाज्मिड निंन सूत्र का उपयोग कर एकाग्रता की गणना:
    Equation 1
    जहां D कमजोर पड़ने वाले पहलू को लागू किया जाता है (इस मामले में यह 70/10 है), Ax x एनएम पर अवशोषण होता है, और ५० dsDNA के लिए µ g/mL को रूपांतरण कारक है ।
  3. ९.१ एनजी/µ एल के नमूनों को पतला
  4. ई कोलाई (ई. कोलाई) सक्षम कोशिकाओं को बदलने (जैसे XL10 गोल्ड) Inoue परिवर्तन प्रक्रिया के बाद16 पतला नमूना के 5 µ एल का उपयोग कर ।
  5. पेट्री व्यंजन पर कालोनियों की संख्या की गणना और कमजोर पड़ने पर ध्यान दें । निंनलिखित सूत्र के साथ कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) की गणना17:
    Equation 2
    जहां D प्रारंभिक संस्कृति से लागू होने वाले कमजोर कारक है ।
  6. कोई ख़राब t-परीक्षण निष्पादित करें ।

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Representative Results

एक बैंगनी formazan हाला दिखाई देता है जहां डीएनए स्थित है (मास स्पेक्ट्रोमेट्री13द्वारा सत्यापित) । प्रयोग में, एक डीएनए सीढ़ी एक अंशांकन वक्र बनाने के लिए लोड किया गया था (चित्रा 3) । प्रोटोकॉल acrylamide और agarose जैल दोनों के लिए काम करता है, लेकिन यह एक कम तीव्रता है और agarose में एक लंबा समय लगता है । हालांकि, agarose जैल का उपयोग नमूना एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर की वसूली की अनुमति देता है, और यह निष्कर्षण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । नमूने नीले एल ई डी के साथ इस विधि का उपयोग कर बरामद एक बेहतर गुणवत्ता एसजी मैं एक transilluminator (चित्रा 4) का उपयोग करने की तुलना में है.

Figure 1
चित्र 1। एनबीटी की योजनाबद्ध-एसजी मैं डीएनए धुंधला और ठहराव विश्लेषण । कदम हैं: A. जोड़ने एसजी मैं और एनबीटी जेल के लिए समाधान । बी सूरज की रोशनी या नीली बत्ती को जेल उजागर । C. १२०० डीपीआई पर जेल स्कैनिंग । D. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर द्वारा जेल छवि का विश्लेषण बैंड तीव्रता पाने के लिए । E. एक तीव्रता बनाम एकाग्रता साजिश में डेटा की साजिश रचने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . डीएनए वसूली और अखंडता की तुलना परख के योजनाबद्ध । A. डीएनए ट्रो. B. दो टुकड़ों में काटना जेल । C. दो अलग धुंधला तरीके (एसजी मैं और एनबीटी-एसजी मैं) के साथ धुंधला । D. बाहर प्लाज्मिड डीएनए बैंड काटना । ई. डीएनए जेल निष्कर्षण प्रक्रिया निष्कर्षण किट का उपयोग कर । F. spectrophotometry माप द्वारा डीएनए ठहराव । जी डीएनए एकाग्रता सामांयीकरण दो विधियों की तुलना करने के लिए । एच. सामान्यीकरण के बाद नमूनों के साथ बैक्टीरियल रूपांतरण मैं कॉलोनी गिनती और डेटा विश्लेषण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . १५०० बीपी पर डीएनए के अंशांकन वक्र का उपयोग एनबीटी-एसजी मैं: १२.५% polyacrylamide जैल डीएनए सीढ़ी के विभिन्न सांद्रता के साथ भरी हुई है । जैल 1x ताे में 2 ज के लिए १०० वी पर रन थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . डीएनए के बीच परिवर्तन दक्षता की तुलना एसजी मैं और एक transilluminator और एनबीटी के साथ visualized-एसजी मैं: pDJ100 प्लाज्मिड एक% agarose जेल में भरी हुई थी और 1 के लिए १०० वी में चलाने के लिए V 1x ताे में । इसके बाद दो हिस्सों में जेल काट दिया गया । एक आधा एसजी मैं और एनबीटी के साथ जेल के दूसरे आधे-एसजी मैं के साथ दाग था । प्लाज्मिड बैंड तो जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर जेल से निकाला गया था । अंत में, निकाली प्लाज्मिड सामान्यीकृत और ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं को बदलने के लिए इस्तेमाल किया गया था । रूपांतरणों n = 3 बाहर किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एनबीटी की कमी और एसजी के इस्तेमाल के आधार पर एक संवेदनशील और उपन्यास डीएनए धुंधलाने की विधि इस लेख में प्रस्तुत की गई । इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम है nbt-एसजी I सॉल्यूशन और एनबीटी की एकाग्रता में जेल का मशीनी समय । agarose जैल के लिए धुंधला समय agarose जैल की अधिक मोटाई की वजह से acrylamide जैल के लिए से अधिक है । इस विधि एसडीएस की उपस्थिति में अच्छी तरह से काम नहीं करता है के रूप में एनबीटी इसके साथ संपर्क में हाला । जेल एक बैंगनी पृष्ठभूमि प्राप्त करता है, तो हम अनुशंसा करते हैं कि एक और जेल तैयार हो और प्रकाश जोखिम समय को कम करने के लिए । एक agarose जेल दाग है और वहाँ पर्याप्त संवेदनशीलता नहीं है, तो यह प्रकाश जोखिम समय बढ़ाने के लिए सिफारिश की है । यदि संवेदनशीलता की कमी है और एक आपल हाला जेल में मौजूद है, यह एसडीएस संदूषण का परिणाम हो सकता है । उस मामले में, एक नया जेल तैयार करने और यह धुंधला रिएजेंट जोड़ने से पहले कुल्ला ।

नीले प्रकाश रोशनी से वर्षा होती है, चाहे एक नीली एलईडी के प्रकाश या सूर्य के प्रकाश में स्वाभाविक रूप से मौजूद नीली बत्ती के द्वारा आपूर्ति की जाती है । इस के कारण, तकनीक की एक सीमा प्रकाश स्रोत है । यदि कोई प्रकाश स्रोत, एक नीला प्रकाश स्रोत की जरूरत है, और यदि प्रकाश स्रोत सजातीय नहीं है, यह एक तुलना करने के लिए संभव नहीं है, और एक ही कारण के लिए, यह ठहराव करना संभव नहीं है । हालांकि, प्राप्त परिणाम कुछ हद तक प्रकाश स्रोत पर निर्भर किया जाएगा । यदि प्रकाश स्रोत या समान नहीं है (उदा दिन या गैर-सजातीय नीला प्रकाश स्रोत के दौरान सूरज की रोशनी की तीव्रता में परिवर्तन करने के लिए), यह और अधिक मुश्किल हो जाएगा प्रत्यक्ष तुलना या अलग नमूनों की ठहराव पर विभिंन बार.

इस विधि विशेष उपकरण की जरूरत नहीं है डीएनए कल्पना, यह क्षेत्र के उपयोग के लिए आदर्श बना रही है । मात्रात्मक परिणामों के लिए, एक उच्च संकल्प कैमरा या एक कार्यालय स्कैनर के रूप में इस काम में दिखाया गया था का उपयोग कर सकते हैं ।

हम संभवतः यह दो अलग धुंधला तकनीकों के प्रयोग के माध्यम से अंय अंय अणुओं के दाग के साथ संयोजन द्वारा भविष्य में इस तकनीक का विस्तार करने की उंमीद (उदा एनबीटी-एसजी मैं Coomassie के साथ) एक ही जेल में ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), चिली, परियोजना १११३०२६३ (cw), परियोजना CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional पीसीआई-PII20150073 (cw) और यू-inicia से Vicerrectoría de द्वारा समर्थित किया गया Investigación Universidad डे चिली (CW) ।

इस परियोजना के प्रारंभिक चरण में मदद के लिए तातियाना Naranjo-पाल्मा के लिए धंयवाद, डॉ जॉर्ज Babul और डिएगो Quiroga-सहायक चर्चा के लिए रोजर, रॉबर्ट Lesch पांडुलिपि और Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y संशोधन के लिए Universidad डे चिली से Farmacéuticas । धंयवाद भी संपादन के लिए वीडियो और नील स्टीवंस के लिए Marcelo Pérez पाठ और आवाज प्रदान करने के लिए Errol वाटसन से अधिक को ठीक करने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nitro blue tetrazolium Gold Biotechnology 298-83-9 reagent used in the staining
SYBR Green I 10000X Thermo-Fisher S7563 reagent used in the staining
Gel extraction kit QIAGEN 28704 used to extract plasmid from the gel in integrity assay
DNA ladder Thermo-Fisher SM 1331 used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay
Agar Agar Merck used to make LB-ampicillin culture plates 
sodium chloride Merck 1064045000 used to make LB-ampicillin culture plates 
yeast extract Becton, Dickinson and Company 212750 used to make LB-ampicillin culture plates 
peptone Merck 72161000 used to make LB-ampicillin culture plates 
TEMED AMRESCO 761 used to make polyacrylamide gels
ammonium persulfate Calbiochem 2310 used to make polyacrylamide gels
acrylamide invitrogen 15512-023 used to make polyacrylamide gels
bisacrylamide SIGMA 146072 used to make polyacrylamide gels
Tris-base Merck 1083821000 used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
EDTA J.T. Baker 8993-01 used to make TAE buffer
Acetic acid Merck 1,000,632,500 used to make TAE buffer
agarose Merck 16802 used to make TAE buffer
spectrophotometer Tecan infinite 200 pro used to quantify DNA plasmid
water purificatiom unit Merck Elix 100 use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\
distilled water - used in gels, culture medium, stainings and general solutions
HCl J.T. Baker 9535-03 used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
6X DNA loading dye Thermo-Fisher R0610
5 mm Blue LED Jinyuan electronics SP-021 light source used in integrity assay
protoboard KANDH KH102 light source support and circuit 
9 V battery Duracell - used to power the LED's
horizontal electrophoresis chamber Biorad 1704486EDU used to make and run agarose gel in integrity assay
vertical electrophoresis kit Biorad 1658002EDU used to run polyacrylamide gels in calibration curves
power supply Biorad 1645050  used to power the electrophoresis

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References

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जैव रसायन १३१ अंक डीएनए धुंधला डीएनए अखंडता डीएनए ठहराव SYBR ग्रीन Formazan नाइट्रो ब्लू Tetrazolium ब्लू लाइट
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Paredes, A. J.,… More

Paredes, A. J., Alfaro-Valdés, H. M., Wilson, C. A. M. DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure. J. Vis. Exp. (131), e56528, doi:10.3791/56528 (2018).

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