Summary
Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.
Abstract
DNA-Färbung Methoden sind sehr wichtig für die biomedizinische Forschung. Wir haben eine einfache Methode, die DNA-Visualisierung mit dem bloßen Auge durch die Bildung von farbigen Niederschlag ermöglicht entwickelt. Es funktioniert durch Einweichen der Acrylamid oder DNA Agarose-gel in einer Lösung aus 1 X (entspricht 2,0 µM) SYBR Green ich (SG ich) und 0,20 mM Nitro blau Tetrazoliumsalz, die eine lila produziert Niederschlag von Formazan bei Sonneneinstrahlung oder speziell blaues Licht. Auch wurden DNA-Recovery Tests durchgeführt mit einem Ampicillin resistent Plasmid in einem Agarosegel mit unserer Methode befleckt. Eine größere Zahl von Kolonien wurde erreicht mit unserer Methode als mit traditionellen Färbung mit SG ich mit UV-Beleuchtung. Das beschriebene Verfahren ist schnell, spezifisch und nicht toxisch für DNA-Nachweis, so dass Visualisierung von Biomolekülen mit dem "bloßen Auge" ohne ein Transilluminator und ist billig und für den mobilen Einsatz geeignet. Aus diesen Gründen hat unsere neue DNA Färbung Methode potenzielle Nutzen für Forschung und Industrie.
Introduction
Mit den Fortschritten in der Biochemie und Molekularbiologie haben die Studien mit DNA bessere Techniken zur DNA Analyse erforderlich. Die erste Methode für DNA-Färbung wurde Silber Färbung, die sehr empfindlich ist, aber ermangelt Selektivität und erlaubt keine Probenrückgewinnung. Später, erlaubt die Entwicklung von fluoreszierenden DNA-Färbung die selektive Quantifizierung der DNA mit der Möglichkeit der Probenrückgewinnung. Eines der ersten Fluoreszenzfarbstoffen verwendet für DNA-Quantifizierung war Interkalation Bromid1, mutagene2. Allerdings gibt es nun verbesserte fluoreszierende Farbstoffe, die sicherer und empfindlicher, wie GelRed und SYBR Green sind ich (SG ich)3; aber alle diese Leuchtstofffärbungen erfordern den Einsatz eines ultravioletten (UV) Transilluminator oder Fluorimeter.
Es gibt andere Techniken zum Färben sichtbar DNA, wie Methylenblau4 und Kristallviolett5,6,7,8,9, aber all diese Leiden verringerte Empfindlichkeit und Selektivität. Die Tetrazolium-Salze sind organische Verbindungen, die anfällig für Reduktion, und in diesem Fall bilden sie eine unlösliche und farbigen Formazan überstürzen sich10,11. Vor kurzem zeigten einige bivalenten Tetrazoliumsalz Salze aufgrund ihrer positiven Tetrazoliumsalz Ringe12an DNA zu binden.
In den letzten Veröffentlichung13wurde eine neue sichtbare Technik zu färben und zu quantifizieren DNA in Polyacrylamid-Gele vorgeschlagen, mit der Reduktion von bivalenten Tetrazoliumsalz Salz namens Nitro blau Tetrazoliumsalz (NBT) und Fluoreszenz-Farbstoffen wie Interkalation Bromid, GelRed, SYBR Green I und SYBR Gold. Diese Reaktion bei Anwesenheit von blauem Licht oder Sonnenlicht gearbeitet und erlaubt Probenrückgewinnung mit verbesserter Qualität gegenüber dem Einsatz von SG ich mit einem UV-Transilluminator. Das Ziel dieses Papiers ist ein detailliertes Protokoll der Färbung Technik mit Tetrazoliumsalz bieten Salze.
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Protocol
1. Vorbereitung und Ausführung der Gel
- Bereiten Sie die nicht Denaturierung 12 % Polyacrylamid-Gel Gele Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Rezept fand in Sambrook und Russell14 , aber mit Wasser anstelle von SDS.
- Verwenden Sie um 5 mL Lösung Gel vorzubereiten, 1,7 mL destilliertem Wasser, 2 mL Acrylamid/Bis-Acrylamid (30/0,8 % w/V), 1,3 mL 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL 10 % Ammonium bleichen und 0,002 mL TEMED.
- Zur Vorbereitung verwenden 2 mL Stapeln Gel 1,5 mL Wasser 0,33 mL Acrylamid/Bis-Acrylamid (30/0,8 % w/V), 0,25 mL 1 M Tris pH 6.8, 0,02 mL 10 % Ammonium bleichen und 0,002 mL TEMED. Die Abmessungen des Gels sind 7,3 x 8,2 cm x 0,075 cm (l x w x d).
Hinweis: Verwenden Sie einen 15 gut Kamm von 0,75 mm Dicke für die optimale Empfindlichkeit.
- Fügen Sie die entsprechenden Beträge von 6 x laden Puffer und DNA-Probe zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch (z.B. Verwendung 1 µL 6 X laden Puffer 5 µL DNA-Probe).
- Legen Sie das Gel in der vertikalen Elektrophorese-Kammer.
- Füllen Sie die Kammer mit 750 mL 1 X TAE Puffer 2 Gele ausgeführt. 1 L 50 vorbereiten X TAE, 442 g Tris-Base, 57,1 mL Eisessig und 100 mL 0,5 M EDTA pH 8 zu verwenden. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein finales Volumen von 1 L.
- Laden Sie die Proben in das Gel. Führen Sie das Gel bei 100 V 2 h.
- Alternativ bereiten Sie eine 1 X TAE Agarose-Gel Rezept gefunden in Sambrook14.
- Geben Sie 300 mL 1 X TAE der horizontalen Elektrophorese-Kammer. Führen Sie das Gel für 45 min bei 100 V.
(2) NBT-SG ich Färbung (Abbildung 1).
-
Acrylamid-Gel Färbung.
- Bereiten Sie die Lösungen: 0,1 % w/V NBT und 1,2 x SG ich.
Hinweis: Es ist möglich, verwenden Sie Interkalation Bromid, GelRed und SYBR Gold statt SG ich, aber ich hatte die beste Leistung SG. - Gießen Sie 16,75 mL 1.2 X SYBR grün I Lösung in ein Gefäß passender Größe.
Hinweis: Wir den Deckel einer Pipette-Tipp-Box als Container verwendet, und diese Bände werden berechnet, um das Gel mit diesem Container abzudecken; seine Abmessungen sind 11,6 x 7,6 cm x 2,6 cm (l x w x d). - Legen Sie das Gel in die Lösung. Hinzufügen von 3,25 mL 0,1 % w/V NBT-Lösung 0,2 mM NBT geben und 1 X (entspricht 2,0 µM) SG ich Endkonzentrationen.
- Verschließen Sie den Behälter mit Kunststoff-Folie, und wickeln Sie komplett den Behälter mit Aluminiumfolie, Umgebungslicht zu blockieren.
Hinweis: Die Kunststoff-Folie wird verwendet, um Spritzer zu vermeiden und um Reaktion der Aluminiumfolie mit der Färbelösung zu vermeiden. - 25 min auf einem Orbitalschüttler bei 60 u/min schütteln.
- Entfernen Sie Aluminium und Kunststoff-Abdeckung. Für 90 min. maximale Sonnenbestrahlung aussetzen. Überprüfen Sie alle 5 Minuten, bis die Band von Interesse erscheint.
- Um blaues Licht zu verwenden, bereiten Sie eine Lochrasterplatinen mit 3 Leuchtdioden (LED) und legen Sie die LEDs ca. 5 mm von der Geloberfläche (überprüfen Sie die Färbung kontinuierlich, wie die Zeit von der Intensität der LED-Lichtquelle abhängen wird benötigt).
- Bereiten Sie die Lösungen: 0,1 % w/V NBT und 1,2 x SG ich.
-
Agarosegel Färbung.
- Nach der Vorbereitung und Ausführung einer 1 % Agarose gel wie in den Abschnitten 1.4 beschrieben (die Maße sind 1 x 6,2 cm x 7 cm; l x w x t), die gleichen Schritte wie in 2.1 mit diesen Änderungen:
- Gießen Sie 41,9 mL 1,2 x SG ich Lösung in den Deckel einer Pipette-Tipp-Box; seine Abmessungen sind 11,6 x 7,6 cm x 2,6 cm (l x w x d). 8,1 mL 0,1 % NBT-Lösung zugeben.
- Verschließen Sie den Behälter mit Kunststoff-Folie, und dann wickeln Sie vollständig den Behälter mit Aluminiumfolie, Umgebungslicht zu blockieren.
- 1 h auf einem Orbitalschüttler bei 60 u/min schütteln.
(3) Datenanalyse.
-
NBT-SG ich Kalibrierkurven.
- Gelbilder durch Scannen bei 1200 dpi zu erhalten.
- Offene Software für die Bildanalyse. Die Bilder mit einem Bildbearbeitungsprogramm zu begradigen. Führen Sie eine Bild-Densitometrie.
- Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve. Bereiten Sie ein Diagramm der Signal/SignalMax im Vergleich zu DNA-Konzentration.
4. DNA-Recovery.
- Bereiten Sie eine 1 % Agarose-Gel in 1 X TAE mit dem Rezept in Sambrook14gefunden.
- Geben Sie 300 mL 1 X TAE der horizontalen Elektrophorese-Kammer. Laden Sie 4 µL von 100 ng/µL pDJ10015 Plasmid DNA-Leiter nach dem Schema in Abbildung 2angegeben. Führen Sie das Gel für 1 h bei 100 V.
- Markieren Sie und wiegen Sie zwei 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- Schneiden Sie das Gel in der Mitte um zwei identische Hälften haben. Jeder sollte die Leiter und das Probe-Plasmid, vergleichen Sie die verschiedenen befleckenden Techniken enthalten. Eine schematische Darstellung ist in Abbildung 2.
- Flecken auf einer Hälfte mit NBT-SG I wie in Schritt 2.
- Die Plasmid-Band mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten. Speichern Sie das Gel-Stück in eine Röhre und wiegen.
- Fleck, den andere Teil des Gels mit SG ich mit 50 mL 1 x SG ich Lösung und langsam schütteln (60 u/min) das Gel für 1 h in der Dunkelheit.
- Legen Sie das Gel auf ein Transilluminator und für 2 min. Schnitt aus dem Plasmid-Band mit einem sauberen Skalpell aussetzen.
- Speichern Sie das Gel Stück in die zweite Röhre und wiegen.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden, wobei die Rohre bei-20 ° C.
- Plasmid Extraktion mithilfe eines kommerziellen Gel Extraction Kits führen.
(5) Plasmid Normalisierung.
- Fügen Sie in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 10 µL des extrahierten Plasmid und 60 µL des Typs, den ich Wasser hinzu. Mix und übertragen auf eine 60 µL-Quarz-Küvetten oder 2 µL direkt in eine Nanodrop verwenden.
- Messen Absorptionsspektren zwischen 230 und 320 nm. Berechnen Sie das Beispiel Plasmid Konzentration anhand der folgenden Formel:
wo D ist der Verdünnungsfaktor angewendet (in diesem Fall ist es 70/10), AX ist die Absorption bei x nm und 50 ist der Umrechnungsfaktor µg/ml für DsDNA. - Verdünnte Proben auf 9,1 ng/µL.
- Escherichia coli (E. Coli) kompetente Zellen (z. B. XL10 Gold) zu verwandeln nach der Inoue Transformation Verfahren16 mit 5 µL der verdünnten Probe.
- Die Anzahl der Kolonien in den Petrischalen und beachten Sie die Verdünnung. Berechnen Sie die Kolonie Bildenden Einheiten (KBE) mit der folgenden Formel17:
wo D ist der Verdünnungsfaktor von der ursprünglichen Kultur angewendet. - Führen Sie einen ungepaarten t-Test.
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Representative Results
Ein violette Formazan Niederschlag erscheint (verifiziert durch Massenspektrometrie13) wo die DNA befindet. Im Experiment wurde eine DNA-Leiter geladen zu einer Kalibrierkurve (Abbildung 3). Das Protokoll arbeitet für Acrylamid und Agarose Gele, aber es hat eine geringere Intensität und nimmt eine längere Zeit in Agarose. Jedoch die Verwendung von Agarose-Gele ermöglicht die Rückgewinnung der Probe mit einem kommerziell erhältlichen Kit, und es stört nicht bei der Extraktion. Die Proben gewonnen werden unter Verwendung dieser Methode mit blauen LEDs haben eine bessere Qualität im Vergleich zu SG ich benutze ein Transilluminator (Abbildung 4).
Abbildung 1. Schema der NBT-SG I DNA-Färbung und Quantifizierung Analyse. Die Schritte sind: A. Adding SG ich und NBT-Lösungen für das Gel. B. auszusetzen das Gel Sonnenlicht oder blaues Licht. C. Scannen das Gel bei 1200 dpi. D. Analyse Gelbild durch ein Bildbearbeitungsprogramm um Band Intensität zu erhalten. E. zeichnen die Daten in einer Intensität versus Konzentration Plot. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Schaltplan des DNA-Erholung und Integrität Vergleich Test. A. DNA Elektrophorese. B. Schneiden Gel in zwei Stücke. C. Färbung mit den zwei verschiedenen befleckenden Methoden (SG I und NBT-SG ich). D. Ausschneiden Plasmid DNA-Band. E. DNA-Gel-Extraktionsverfahren mit Extraktion Kit. F. DNA Quantifizierung Spektrophotometrie gemessen. G. DNA Konzentration Normierung auf die beiden Methoden zu vergleichen. H. bakterielle Transformation mit den Proben nach Normalisierung I. Kolonie zählen und Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Kalibrierkurve des DNA bei 1500 bp mit NBT-SG I: 12,5 % Polyacrylamid-Gele beladen mit verschiedenen Konzentrationen von DNA-Leiter. Gele wurden bei 100 V für 2 h in 1 laufen X TAE. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Vergleich der Transformationseffizienz zwischen DNA visualisiert mit SG I und ein Transilluminator und NBT-SG I: pDJ100 Plasmid wurde in einem 1 % Agarosegel geladen und laufen bei 100 V für 1 h in 1 X TAE. Dann wurde das Gel in zwei Hälften geschnitten. Eine Hälfte wurde mit SG befleckt, ich und andere Hälfte des Gels mit NBT-SG ich. Die Plasmid-Band wurde dann das Gel mit einem Gel Extraction Kit entnommen. Schließlich war die extrahierte Plasmid normalisiert und kompetente E. Coli Zellen zu verwandeln. Die Transformationen wurden durchgeführt, n = 3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Eine sensible und Roman DNA Färbung Methode anhand der Reduzierung der NBT und die Verwendung von SG, die ich in diesem Artikel vorgestellt wurde. Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll ist die Inkubationszeit des Gels in der NBT-SG ich Lösung und die Konzentration der NBT. Die Färbung Agarose-Gele dauert länger als bei Acrylamid Gele wegen der größeren Dicke Agarose-Gele. Diese Methode funktioniert nicht gut im Beisein von SDS, wie NBT mit ihm in Berührung ausfällt. Wenn das Gel einen violetten Hintergrund erhält, wird empfohlen, ein anderes Gel vorbereitet zu sein und die Belichtungszeit zu reduzieren. Wenn eine Agarosegel gefärbt wird, und es nicht genügend Sensibilität gibt, empfiehlt es sich, die Belichtungszeit zu erhöhen. Wenn es einen Mangel an Sensibilität gibt und eine schillernde Niederschlag im Gel vorhanden ist, könnte dies das Ergebnis der SDS Kontamination sein. In diesem Fall bereiten ein neue Gel und spülen sie vor dem Hinzufügen der Färbung Reagenzien.
Die Fällung erfolgt durch die blaue Beleuchtung, ob durch das Licht einer blauen LED oder das blaue Licht vorhanden natürlich im Sonnenlicht versorgt. Aus diesem Grund ist eine Einschränkung der Technik der Lichtquelle. Wenn dort keine Lichtquelle, eine blaue Lichtquelle benötigt wird, und wenn die Lichtquelle nicht homogen ist, es ist nicht möglich, einen Vergleich zu tun, und aus dem gleichen Grund ist es nicht möglich, Quantifizierung zu tun. Die Ergebnisse werden jedoch etwas abhängig von der verwendeten Lichtquelle. Wenn die Lichtquelle nicht übereinstimmt oder Uniform (z.B. aufgrund von Änderungen in der Intensität der Sonneneinstrahlung während des Tages oder nicht-homogene blaue Lichtquelle), es wird schwieriger, Vergleiche zu lenken, zu tun oder eine Quantifizierung der verschiedenen Proben an verschiedenen Zeiten.
Diese Methode benötigt keine besondere Instrumentierung, die DNA, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz zu visualisieren. Eine können für quantitative Ergebnisse eine hochauflösende Kamera oder Scanner ein Office-Anwendungen wie in dieser Arbeit gezeigt wurde.
Wir hoffen, diese Technik in Zukunft erweitern, indem Sie möglicherweise in Kombination mit der Färbung von anderen Biomolekülen durch den Einsatz von zwei verschiedenen befleckenden Techniken (z.B. NBT-SG I mit Coomassie) im gleichen Gel.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von Fondo Nacional de Desarrollo y Científico Tecnológico (Fondecyt), Chile, Projekt 11130263 (für CW), Projekt CONICYT ++ NERC Programa de Überwachung Internacional PCI-PII20150073 (für CW) und U-Inicia aus der Vicerrectoría-de Investigación Universidad de Chile (CW).
Danke an Tatiana Naranjo-Palma für die Hilfe in der Anfangsphase des Projekts, Dr. Jorge Babul und Diego Quiroga-Roger für hilfreiche Diskussion, Robert Lesch für die Überarbeitung des Manuskripts und Dirección de Extensión De La spielte de Ciencias Químicas y Farmacéuticas von Universidad de Chile. Vielen Dank auch an Marcelo Pérez für die Videobearbeitung und Neil Stevens zum Korrigieren von Text und Errol Watson für die Bereitstellung von der Voice-over.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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