Summary
Met deze methode kunt selectieve kleuring en kwantificering van DNA in gels door inweken de gel in een groene SYBR ik / Nitro blauwe Tetrazolium oplossing en vervolgens blootstelling aan zonlicht of een blauwe lichtbron. Dit produceert een zichtbaar neerslag en bijna geen apparatuur, waardoor het ideaal is voor gebruik van veld vereist.
Abstract
DNA kleuring methoden zijn zeer belangrijk voor biomedisch onderzoek. We ontwierpen een eenvoudige methode waarmee DNA visualisatie met het blote oog door de vorming van een gekleurde neerslag. Het werkt door het onderdompelen van de acrylamide of DNA agarose gel in een oplossing van 1 x (equivalent aan 2,0 µM) SYBR Green ik (SG ik) en 0,20 mM nitro blauwe tetrazolium die produceert een paars neerslaan van formazan bij blootstelling aan zonlicht of specifiek blauw licht. Ook werden DNA-herstel-tests uitgevoerd met behulp van een ampicilline-resistentie plasmiden in een agarose gel bevlekt met onze methode. Een groter aantal kolonies werd verkregen met onze methode dan met traditionele kleuring met SG ik met ultraviolet verlichting. De beschreven methode is snel, specifieke en niet-toxisch voor de detectie van DNA, waardoor de visualisatie van biomoleculen met het "blote oog" zonder een transilluminator, en is goedkoop en geschikt is voor gebruik van het veld. Om deze redenen heeft onze nieuwe DNA kleuring methode potentiële voordelen voor zowel onderzoek en industrie.
Introduction
Met de vooruitgang in de biochemie en moleculaire biologie moeten de studies waarbij DNA betere technieken voor het analyseren van DNA. De eerste methode voor DNA kleuring was zilver vlekken, die zeer gevoelig is maar mist selectiviteit en monster herstel niet mogelijk. Later, toegestaan de ontwikkeling van fluorescente DNA kleuring de selectieve kwantificering van DNA met de mogelijkheid van herstel van de steekproef. Een van de eerste fluorescente kleurstoffen gebruikt voor DNA kwantificering was ethidium bromide (en)1, die is mutageen2. Echter, nu zijn er betere fluorescente kleurstoffen die veiliger en gevoeliger, zoals GelRed en SYBR groen ik (SG ik)3; maar al deze fluorescente kleurstoffen vereisen het gebruik van een ultraviolet (UV) transilluminator of fluorimeter.
Er zijn andere technieken voor de kleuring zichtbaar DNA, zoals methyleenblauw4 en kristalviolet5,6,7,8,9, maar al deze last van verminderde gevoeligheid en selectiviteit. De tetrazolium zouten zijn organische stoffen gevoelig voor vermindering, en wanneer dit gebeurt vormen ze een onoplosbaar en gekleurde formazan precipiteren10,11. Onlangs, sommige zouten bivalente tetrazolium gebleken binden aan DNA als gevolg van hun positieve tetrazolium ringen12.
In een recente publicatie13, werd een nieuwe zichtbaar techniek voor vlekken en kwantificeren van DNA in polyacrylamide gels voorgesteld, met behulp van de vermindering van een tweewaardig tetrazolium zout genaamd nitro blauwe tetrazolium (NBT) en fluorescente kleurstoffen zoals ethidiumbromide, GelRed, SYBR groene ik en SYBR goud. Deze reactie werkte in het bijzijn van blauw licht of zonlicht en toegestaan monster herstel met verbeterde kwaliteit in vergelijking met het gebruik van SG ik met een UV-transilluminator. Het doel van deze paper is om een gedetailleerd protocol van de kleuring techniek met behulp van tetrazolium zouten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiden en uitvoeren van het Gel
- De niet-denaturering 12% polyacrylamidegel gels met behulp van het natrium Dodecyl Sulfaat-Polyacrylamide Gel elektroforese (SDS-PAGE) recept gevonden in Sambrook en Russell14 maar met behulp van water in plaats van SDS voor te bereiden.
- Om voor te bereiden 5 mL oplossen van gel, 1,7 mL gedestilleerd water, 2 mL van acrylamide/bis acrylamide (30/0,8% w/v), 1.3 mL 1.5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL 10% ammoniumnitraat persulfate en 0,002 mL van TEMED te gebruiken.
- Ter voorbereiding van 2 mL van stapelen gel 1,5 mL water, 0,33 mL van acrylamide/bis acrylamide (30/0,8% w/v), 0,25 mL 1 M Tris pH 6.8, 0,02 mL 10% ammoniumnitraat persulfate en 0,002 mL TEMED gebruiken. De afmetingen van de gel zijn 7.3 x 8,2 cm x 0,075 cm (l x w x d).
Opmerking: Gebruik een 15 goed kam van 0,75 mm dikte voor de beste gevoeligheid.
- Voeg de juiste hoeveelheid 6 x laden buffer en DNA-monster tot een 1,5 mL microcentrifuge koker (bijvoorbeeld gebruik 1 µL van 6 x laden buffer 5 µL van het DNA-monster).
- Plaats de gel in de zaal van de verticale elektroforese.
- De kamer vullen met 750 mL 1 x TAE buffer te voeren 2 gels. Te bereiden 1 L 50 x TAE, 442 g voor Tris base, 57.1 mL ijsazijn en 100 mL 0,5 M EDTA pH 8 gebruiken. Voeg gedistilleerd water tot een eindvolume van 1 L.
- Laden van de monsters in de gel. De gel op 100 V voor 2 h uitvoeren.
- U kunt ook een 1 x TAE agarose gel met behulp van het recept gevonden in Sambrook14te bereiden.
- Voeg 300 mL 1 x TAE aan de horizontale elektroforese kamer. Stel de gel gedurende 45 minuten bij 100 V.
2. NBT-SG ik vlekken (Figuur 1).
-
Acrylamide Gel kleuring.
- Bereiden van de oplossingen: 0,1% w/v NBT en 1.2 x SG ik.
Opmerking: Het is mogelijk om het gebruik van ethidiumbromide, GelRed en gouden SYBR in plaats van SG ik, maar ik had de beste prestaties SG. - Giet 16.75 milliliters 1.2 x SYBR groene ik oplossing in een container van passende omvang.
Opmerking: We gebruikten de deksel van een pipet tip doos als een container, en deze volumes worden berekend ter dekking van de gel met behulp van deze container; de afmetingen zijn 11.6 x 7,6 cm x 2.6 cm (l x w x d). - Plaats de gel in de oplossing. Voeg 3,25 mL 0,1% w/v NBT oplossing te geven van 0,2 mM NBT en 1 x (equivalent aan 2,0 µM) SG ik eindconcentraties.
- Verzegelen van de container met plastic folie, en volledig wikkel de container met aluminiumfolie te blokkeren elke omgevingslicht.
Opmerking: De plastic folie wordt gebruikt om te voorkomen dat spatten en om te voorkomen dat de reactie van de aluminium-folie met de kleurstofoplossing. - Schud gedurende 25 minuten op een roteerschudapparaat op 60 rpm.
- Aluminium en plastic deksel verwijderen. Blootstellen aan zonlicht gedurende 90 minuten maximaal. Controleer elke 5 minuten tot de band van belang wordt weergegeven.
- Voor het gebruik van blauw licht, bereiden een protoboard met 3 lichtdioden (LED) en plaats de LED's ongeveer 5 mm van het oppervlak van de gel (Controleer de kleuring voortdurend, als de tijd die nodig van de intensiteit van de LED-lichtbron afhangen zal).
- Bereiden van de oplossingen: 0,1% w/v NBT en 1.2 x SG ik.
-
Agarose Gel kleuring.
- Na het voorbereiden en uitvoeren van een 1% agarose gel zoals beschreven in paragrafen 1.4 (de afmetingen zijn 1 x 6,2 cm x 7 cm; l x w x d), dezelfde stappen zoals in 2.1 met deze wijzigingen:
- Giet 41.9 milliliters 1.2 x SG ik oplossing in de deksel van een pipet tip doos; de afmetingen zijn 11.6 x 7,6 cm x 2.6 cm (l x w x d). Voeg 8.1 mL 0,1% NBT oplossing.
- Verzegelen van de container met plastic folie, en vervolgens wikkel volledig de container met aluminiumfolie te blokkeren elke omgevingslicht.
- Laat gedurende 1 h op een roteerschudapparaat op 60 rpm.
3. data-analyse.
-
NBT-SG ik kalibratiekrommen.
- Verkrijgen gel beelden door het scannen met 1200 dpi.
- Open software voor beeldanalyse. Strek de beelden met behulp van een image-editor. Een afbeelding densitometrie uitvoeren
- Bereken de oppervlakte onder de kromme. Een grafiek van de signaal/signaalMax versus DNA concentratie voor te bereiden.
4. DNA herstel.
- Bereiden van een 1% agarose gel in 1 x TAE met behulp van het recept gevonden in Sambrook14.
- Voeg 300 mL 1 x TAE aan de horizontale elektroforese kamer. Laden 4 µL van 100 ng/µL pDJ10015 plasmide en DNA-ladder na de regeling gegeven in Figuur 2. Stel de gel gedurende 1 uur bij 100 V.
- Markeer en wegen twee 2 mL microcentrifuge buizen.
- Snijd de gel in het midden om twee gelijke helften. Ieder moet de ladder en het monster plasmide te vergelijken van de verschillende kleuring technieken bevatten. Een schematische weergave is in Figuur 2.
- Vlek een helft met NBT-SG ik zoals in stap 2.
- Knip uit het plasmide band met behulp van een schone scalpel. Sla het stuk gel in een buis en wegen.
- Het andere deel van de gel met SG vlek ik met 50 mL 1 x SG ik oplossing en langzaam schud (60 rpm) de gel gedurende 1 uur in de duisternis.
- Plaats de gel op een transilluminator en bloot voor 2 min. Knip uit het plasmide band met behulp van een schone scalpel.
- Sla het stuk gel in de andere buis en wegen.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken terwijl de buizen bij-20 ° C.
- Plasmide extractie met behulp van een commerciële gel extractie kit uitvoeren.
5. plasmide normalisatie.
- Voeg in een 1,5 mL microcentrifuge buis, 10 µL van uitgepakte plasmide en 60 µL van type ik water. Mix en overbrengen in een cuvet van 60 µL kwarts of 2 µL rechtstreeks in een Nanodrop gebruiken.
- Meten van absorptiespectra tussen 230 tot 320 nm. Berekenen van het monster plasmide concentratie met de volgende formule:
waar is D de verdunningsfactor toegepast (in dit geval is het 70/10), Ax is absorptie bij x nm, en 50 is de omrekeningsfactor tot µg/mL voor dsDNA. - Verdun te 9.1 ng/µL monsters.
- Transformeren van Escherichia coli (E. coli) bevoegde cellen (bijvoorbeeld XL10 goud) na de Inoue transformatie procedure16 met 5 µL van verdunde monster.
- Tel het aantal kolonies op de petrischaaltjes en noteer de verdunning. Berekenen van de kolonie vormen eenheden (kve) met de volgende formule17:
Hierbij is D de verdunningsfactor toegepast vanaf de eerste cultuur. - Het uitvoeren van een ongepaard t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een paarse formazan neerslag ontstaat waar zich het DNA bevindt (gecontroleerd door massaspectrometrie13). In het experiment, was een DNA-ladder geladen om uit te maken van een ijkcurve (Figuur 3). Het protocol werkt voor zowel acrylamide en agarose gel, maar het heeft een lagere intensiteit en vergt een langere tijd in de agarose. Echter, het gebruik van agarose gel maakt het herstel van het monster met behulp van een commercieel beschikbare kit en het niet interfereert met de extractie. De monsters hersteld met behulp van deze methode met blauwe LED's hebben een betere kwaliteit in vergelijking met SG ik met behulp van een transilluminator (Figuur 4).
Figuur 1. Analyse van schematische van NBT-SG I DNA-kleuring en kwantificering. De stappen zijn: A. toevoegen SG ik en NBT oplossingen voor de gel. B. bloot de gel aan zonlicht of blauw licht. C. scannen de gel op 1200 dpi. D. analyseren de gel beeld door een beeld processing software om de intensiteit van de band. E. uitzetten van de gegevens in een intensiteit versus concentratie plot. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Schematische van DNA herstel en integriteit vergelijking assay. A. DNA elektroforese. B. snijden gel in twee stukken. C. kleuring met de twee verschillende kleuring methoden (SG ik en NBT-SG ik). D. het uitsnijden van plasmide DNA band. E. DNA gel met kit voor extractie extractiemethode. F. DNA kwantificering door spectrofotometrie meting. G. DNA concentratie normalisatie te vergelijken van de twee methoden. H. bacteriële transformatie met de monsters na normalisatie I. kolonie tellen en data analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Ijkkromme van DNA bij 1500 bp met behulp van de NBT-SG I: 12,5% polyacrylamide gels geladen met verschillende concentraties van DNA-ladder. Gels werden uitgevoerd op 100 V voor 2 h in 1 x TAE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Vergelijking van transformatie efficiëntie tussen DNA gevisualiseerd met SG I en een transilluminator en NBT-SG I: de pDJ100-plasmide was geladen in een 1% agarose gel en uitgevoerd bij 100 V voor 1 h in 1 x TAE. Dan de gel werd gesneden in twee helften. De helft was gekleurd met SG, ik en de andere helft van de gel met NBT-SG ik. De plasmide-band werd vervolgens gewonnen uit de gel met een gel-kit voor extractie. Tot slot was het uitgepakte plasmide genormaliseerd en gebruikt om te transformeren van E. coli bevoegde cellen. De transformaties werden uitgevoerd n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een gevoelige en roman DNA kleuring methode gebaseerd op de vermindering van de NBT en het gebruik van SG ik werd gepresenteerd in dit artikel. De kritische stap in dit protocol is de incubatietijd van de gel in de NBT-SG ik oplossing en de concentratie van NBT. De kleuring tijd voor agarose gel is langer dan voor acrylamide gels vanwege de grotere dikte van agarose gel. Deze methode werkt niet goed in het bijzijn van de SDS zoals NBT in contact met het precipitaten. Als de gel een paarse achtergrond verkrijgt, is het aan te raden dat een andere gel worden voorbereid en ter vermindering van de tijd van blootstelling aan licht. Als een agarose gel is gekleurd en er niet genoeg gevoeligheid is, is het raadzaam om de tijd van blootstelling aan licht. Als er een gebrek aan gevoeligheid en een opalen neerslag aanwezig in de gel is, zou dit het resultaat van SDS besmetting. In dat geval bereiden een nieuwe gel en het spoelen alvorens toe te voegen de kleuring reagentia.
De neerslag ontstaat door blauwe lichte verlichting, of kopen bij het licht van een blauwe LED of het blauwe licht huidige natuurlijk zonlicht. Wegens dit is een beperking van de techniek de lichtbron. Als er geen lichtbron, een blauwe lichtbron nodig is, als de lichtbron niet homogeen is, het is niet mogelijk om te doen een vergelijking en om dezelfde reden, het is niet mogelijk om te doen kwantificering. De resultaten zullen echter enigszins afhankelijk van de lichtbron wordt gebruikt. Als de lichtbron niet consistent of uniform (bijvoorbeeld als gevolg van veranderingen in de intensiteit van zonlicht tijdens de dag of de niet-homogene blauwe lichtbron), het zal moeilijker te directe vergelijkingen of kwantificering van verschillende steekproeven op verschillende niveaus tijden.
Deze methode heeft geen behoefte aan speciale instrumentatie te visualiseren het DNA, waardoor het ideaal is voor gebruik van het veld. Voor kwantitatieve resultaten, kan men gebruik maken van een high-resolution camera of een office-toepassingen zoals bleek in dit werk.
We hopen dat deze techniek in de toekomst uitbreiden door eventueel in combinatie met de kleuring van andere biomoleculen door het gebruik van twee verschillende kleuring technieken (bijvoorbeeld NBT-SG I met Coomassie) in de zelfde gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Fondo Nacional de Desarrollo Científico y autonoom (Fondecyt), Chili, Project 11130263 (naar CW), Project CONICYT + NERC Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (naar CW) en U-inicia van de Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (naar CW).
Bedankt aan Tatiana Naranjo-Palma voor de hulp in de eerste fase van dit Project, Dr. Jorge Babul en Diego Quiroga-Roger voor nuttige discussie, Robert Lesch voor de herziening van het manuscript en de Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas van Universidad de Chile. Dank ook aan Marcelo Pérez voor het bewerken van de video en Neil Stevens voor het corrigeren van de tekst en Errol Watson voor het verstrekken van de voice-over.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).
