Summary
Denne metode giver selektiv farvning og kvantificering af DNA i geler af iblødsætning gel i en SYBR Green jeg / Nitro blå Tetrazolium løsning og derefter udsætter det for sollys eller en blå lyskilde. Dette frembringer en synlig bundfald og kræver næsten ingen udstyr, hvilket gør den ideel til feltet brug.
Abstract
DNA farvning metoder er meget vigtige for biomedicinsk forskning. Vi har udviklet en simpel metode, der giver mulighed for DNA visualisering med det blotte øje ved dannelsen af en farvede bundfald. Det virker ved iblødsætning af acrylamid eller Agarosen DNA gel i en opløsning af 1 x (svarende til 2,0 µM) SYBR Green jeg (SG jeg) og 0,20 mM nitro blå tetrazolium, der producerer en lilla bundfald af formazankoncentrationen når de udsættes for sollys eller specifikt blåt lys. Også, DNA opsving tests blev udført ved hjælp af en ampicillin resistente plasmid i en agarosegel farves med vores metode. Et større antal kolonier blev opnået med vores metode end med traditionelle farvning bruge SG jeg med ultraviolet belysning. Den beskrevne metode er hurtig, specifik og ugiftigt for DNA påvisning, tillade visualisering af biomolekyler til "blotte øje" uden en transilluminator, og er billig og passende for feltet brug. Af disse grunde har vores nye DNA farvning metode potentielle fordele for både forskning og industri.
Introduction
Med fremskridt inden for biokemi og molekylær biologi, har de undersøgelser, der involverer DNA kræves bedre teknikker til at analysere DNA. Den første metode til DNA farvning var sølvfarvning, som er meget følsomme, men mangler selektivitet og tillader ikke prøve opsving. Udviklingen af fluorescerende DNA farvning tillod senere, selektiv kvantificering af DNA med mulighed for prøve opsving. En af de første fluorescerende farvestoffer anvendes til DNA kvantificering var ethidium bromid1, som er mutagent2. Men nu der er forbedret fluorescerende farvestoffer, der er sikrere og mere følsom, såsom GelRed og SYBR Green jeg (SG jeg)3; men alle disse fluorescerende farvestoffer kræver brug af en ultraviolet (UV) transilluminator eller fluorimeter.
Der er andre teknikker for synligt farvning DNA, såsom methylene blå4 og krystalviolet5,6,7,8,9, men alle disse lider af nedsat følsomhed og selektivitet. Tetrazolium salte er organiske forbindelser modtagelige for reduktion, og når dette sker de danner et uopløseligt og farvede formazankoncentrationen bundfald10,11. For nylig, nogle bivalent tetrazolium salte har vist sig at binde til DNA på grund af deres positive tetrazolium ringe12.
I en nylig publikation13foreslog en ny synlig teknik til at pletten og kvantificere DNA i polyacrylamidgeler, ved hjælp af reduktion af en bivalent tetrazolium salt kaldet nitro blå tetrazolium (NBT) og fluorescerende farvestoffer som ethidiumbromid, GelRed, SYBR Green jeg og SYBR guld. Denne reaktion arbejdede blåt lys eller sollys og tilladt prøve opsving med forbedret kvalitet sammenlignet med brugen af GS jeg med en UV transilluminator. Formålet med dette papir er at give en detaljeret protokol af farvning teknik bruger tetrazolium salte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse og kører Gel
- Forberede de ikke-denatureringen 12% polyacrylamid gel gels brug Sodium Dodecyl sulfat-polyacrylamid Gel elektroforese (SDS-PAGE) opskrift fundet i Sambrook og Russell14 men med vand i stedet for SDS.
- For at forberede 5 mL løsning gel, bruge 1,7 mL destilleret vand, 2 mL af acrylamid/bis acrylamid (30/0,8% w/v), 1,3 mL 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL 10% ammonium persulfat og 0.002 mL af TEMED.
- For at forberede bruge 2 mL af stabling gel 1,5 mL vand, 0,33 mL af acrylamid/bis acrylamid (30/0,8% w/v), 0,25 mL 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL 10% ammonium persulfat og 0.002 mL af TEMED. Dimensioner af gel er 7,3 cm x 8,2 cm x 0.075 cm (l x b x d).
Bemærk: Brug en 15 godt kam 0,75 mm tykkelse for den bedste følsomhed.
- Tilføj de relevante beløb af 6 x loading bufferen og DNA-prøve til en 1,5 mL microcentrifuge tube (f.eks. brug 1 µL af 6 x loading bufferen til 5 µL DNA-prøve).
- Sted gel i lodret elektroforese kammer.
- Fyld salen med 750 mL af 1 x TAE buffer til at køre 2 geler. At forberede 1 L 50 x TAE, bruge 442 g af Tris base, 57,1 mL iseddike og 100 mL 0,5 M EDTA pH 8. Der tilsættes destilleret vand, en endelige mængden af 1 L.
- Indlæse prøver i gelen. Kør gelen på 100 V til 2 h.
- Alternativt kan du forberede en 1 x TAE agarosegel ved hjælp af opskriften fundet i Sambrook14.
- Der tilsaettes 300 mL af 1 x TAE til vandrette elektroforese kammer. Kør gelen i 45 min. på 100 V.
2. NBT-SG jeg farvning (figur 1).
-
Acrylamid Gel farvning.
- Forberede løsningerne: 0,1% w/v NBT og 1.2 x SG jeg.
Bemærk: Det er muligt at bruge ethidiumbromid, GelRed og SYBR guld i stedet for SG jeg, men SG jeg havde den bedste ydeevne. - Hæld 16.75 mL af 1,2 x SYBR grøn jeg løsning i en beholder af passende størrelse.
Bemærk: Vi brugte låget af en pipette tip box som en beholder, og disse mængder er beregnet til at dække gel ved hjælp af denne objektbeholder; dens dimensioner er 11,6 cm x 7.6 cm x 2,6 cm (l x b x d). - Sted gel i løsningen. Tilføje 3.25 mL af 0,1% w/v NBT løsning at give 0,2 mM NBT og 1 x (svarende til 2,0 µM) SG jeg endelige koncentrationer.
- Forsegle container med plastfolie, og helt wrap beholderen med aluminiumsfolie til at blokere omgivende lys.
Bemærk: Plastfolie er brugt at undgå sprøjt og undgå reaktion alufolie med Farvningsopløsningen. - Ryst i 25 minutter på en orbitalryster ved 60 rpm.
- Fjern aluminium og plastik cover. Udsættes for sollys i 90 min. maksimalt. Kontrollere hvert 5 min, indtil bandet af interesse vises.
- Du kan bruge blåt lys, udarbejde en protoboard med 3 lysemitterende dioder (LED) og placere lysdioderne ca 5 mm fra gel overflade (check farvning kontinuerligt, som tiden behov afhænger af intensiteten af LED lyskilde).
- Forberede løsningerne: 0,1% w/v NBT og 1.2 x SG jeg.
-
Agarosegel farvning.
- Efter forbereder og kører en 1% Agarosen gel som beskrevet i afsnit 1.4 (dimensioner er 1 cm x 6,2 cm x 7 cm, l x w x d), Følg de samme trin som 2.1 med disse ændringer:
- Hæld 41.9 mL af 1,2 x SG jeg løsning i låget af en pipette tip box; dens dimensioner er 11,6 cm x 7.6 cm x 2,6 cm (l x b x d). Tilføje 8,1 mL af 0,1% NBT løsning.
- Forsegle container med plastfolie, og derefter helt wrap beholderen med aluminiumsfolie til at blokere omgivende lys.
- Rystes 1 time på en orbitalryster ved 60 rpm.
3. data analyse.
-
NBT-SG jeg kalibreringskurver.
- Få gel billeder ved scanning på 1200 dpi.
- Åben software til billedanalyse. Glatte billeder ved hjælp af et billedredigeringsprogram. Køre et billede densitometri.
- Beregn arealet under kurven. Forberede en graf af Signal/SignalMax versus DNA koncentration.
4. DNA opsving.
- Forberede en 1%-agarosegel i 1 x TAE ved hjælp af opskriften fundet i Sambrook14.
- Der tilsaettes 300 mL af 1 x TAE til vandrette elektroforese kammer. Læg 4 µL af 100 ng/µL pDJ10015 plasmid og DNA ladder efter ordningen i figur 2. Kør gelen for 1 h 100 V.
- Mark og vejer to 2 mL microcentrifuge rør.
- Skære gel ned i midten for at have to identiske halvdele. Hver enkelt bør indeholde stigen og prøve plasmid at sammenligne de forskellige farvning teknikker. En skematisk fremstilling er i figur 2.
- Plette en halv med NBT-SG I som i trin 2.
- Skære plasmid bandet ved hjælp af en ren skalpel. Gemme gel stykke i et rør og veje.
- Plette anden del af gel med SG jeg med 50 mL af 1 x SG jeg løsning og langsomt shake (60 rpm) gel for 1 h i mørket.
- Placer gel på en transilluminator og udsætte for 2 min. skæres ud plasmid bandet ved hjælp af en ren skalpel.
- Gemme gel stykke i andre røret og veje.
Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt her samtidig holde rør ved-20 ° C.
- Udføre plasmid udvinding ved hjælp af en kommerciel gel udvinding kit.
5. plasmid normalisering.
- I en 1,5 mL microcentrifuge rør, tilsæt 10 µL af uddraget plasmid og 60 µL af typen jeg vand. Mix og overføre til en 60 µL kvarts kuvette eller bruge 2 µL direkte i en Nanodrop.
- Måle absorptionsspektre mellem 230 og 320 nm. Beregne den prøve plasmid koncentration ved hjælp af følgende formel:
hvor D er fortyndingsfaktoren anvendes (i dette tilfælde det er 70/10), Ax er absorption på x nm, og 50 er omregningsfaktor til µg/mL for dsDNA. - Fortynd prøver til 9,1 ng/µL.
- Omdanne Escherichia coli (E. coli) kompetente celler (f.eks. XL10 guld) efter Inoue transformation procedure16 ved hjælp af 5 µL fortyndede prøve.
- Tæl antallet af kolonier på Petriskålene og Bemærk fortynding. Beregne koloni danner enheder (CFU) med den følgende formel17:
hvor D er fortyndingsfaktoren anvendes fra den oprindelige kultur. - Udføre en uparret t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En lilla formazankoncentrationen bundfald vises hvor DNA er placeret (verificeret af massespektrometri13). I forsøget, var en DNA ladder indlæst for at gøre en kalibreringskurve (figur 3). Protokollen virker for både acrylamid og Agarosen geler, men det har en lavere intensitet og tager længere tid i agarosegelelektroforese. Men brugen af agarosegelitris tillader inddrivelse af prøven ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit, og det interfererer ikke med udvinding. Prøverne inddrives ved hjælp af denne metode med blå lysdioder har en bedre kvalitet i forhold til SG jeg ved hjælp af en transilluminator (figur 4).
Figur 1. Skematisk af NBT-SG I DNA farvning og kvantificering analyse. Trinene er: A. tilføje SG jeg og NBT løsninger på gelen. B. udsætter gel for sollys eller blåt lys. C. scanning gel på 1200 dpi. D. analysere gel billedet af en billedbehandling software for at få bandet intensitet. E. plotte dataene i en intensitet versus koncentration plot. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Skematisk af DNA opsving og integritet sammenligning assay. A. DNA elektroforese. B. skæring gel i to stykker. C. farvning med de to forskellige farvning metoder (SG jeg og NBT-SG jeg). D. opskæring ud plasmid DNA band. E. DNA gel ekstraktionsmetode ved hjælp af udvinding kit. F. DNA kvantificering af spektrofotometri måling. G. DNA koncentration normalisering at sammenligne de to metoder. H. bakteriel omdannelse med prøverne efter normalisering I. koloni optælling og data analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Kalibreringskurven DNA på 1500 bp bruger NBT-SG I: 12,5% polyacrylamidgeler fyldt med forskellige koncentrationer af DNA ladder. Gels blev kørt på 100 V til 2 h i 1 x TAE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Sammenligning af transformation effektivitet mellem DNA visualiseret med SG jeg og en transilluminator og NBT-SG I: pDJ100 plasmid blev lagt i en 1%-agarosegel og køre på 100 V i 1 time i 1 x TAE. Derefter gelen var skåret i to halvdele. Ene halvdel var plettet med SG jeg og anden halvdel af gel med NBT-SG jeg. Plasmid bandet blev derefter udvundet fra gel ved hjælp af en gel udvinding kit. Endelig blev den udpakkede plasmid normaliseret og bruges til at transformere E. coli kompetente celler. Transformationerne blev gennemført n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En følsom og roman DNA farvning metode baseret på reduktion af NBT og brugen af SG jeg blev præsenteret i denne artikel. Den kritiske trin i denne protokol er inkubationstiden gel i NBT-SG jeg løsning og koncentrationen af NBT. Agarosegelitris farvning tid er længere end for acrylamid geler på grund af den større tykkelse af agarosegelitris. Denne metode fungerer ikke godt i overværelse af SDS, som NBT udfældes i kontakt med det. Hvis gelen opnår en lilla baggrund, anbefales det, at en anden gel forberedes og at reducere tid, lys eksponering. Hvis en agarosegel er plettet og der er ikke tilstrækkelig følsomhed, anbefales det at øge lys eksponeringstid. Hvis der er mangel på følsomhed og en opaliserende bundfaldet er til stede i gelen, kunne dette være resultatet af SDS forurening. I så fald forberede en ny gel og skyl det før du tilføjer de farvning reagenser.
Udfældning sker ved blå lys belysning, om leveret af på baggrund af en blå LED eller blåt lys til stede naturligt i sollys. På grund af dette er en begrænsning af teknikken lyskilden. Hvis der ingen lyskilde, en blå lyskilde er nødvendig, og hvis lyskilden ikke er homogene, det er ikke muligt at gøre en sammenligning, og af samme grund er det ikke muligt at gøre kvantificering. De opnåede resultater vil dog lidt afhængig af den anvendte lyskilde. Hvis lyskilden ikke er konsekvent eller uniform (f.eks. på grund af ændringer i intensiteten af sollys i løbet af dagen eller uensartet blå lyskilde), det vil være vanskeligere at direkte sammenligninger eller kvantificering af forskellige prøver på forskellige gange.
Denne metode behøver ikke særlige instrumentering til at visualisere DNA, hvilket gør den ideel til feltet brug. For kvantitative resultater, kan man bruge en høj opløsning kamera eller en office-scanner, som blev vist i dette arbejde.
Vi håber at udvide denne teknik i fremtiden ved at eventuelt kombinere det med farvning af andre biomolekyler ved hjælp af to forskellige farvning teknikker (f.eks. NBT-SG jeg med Coomassie) i samme gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, projekt 11130263 (til CW), projekt CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (til CW) og U-inicia fra Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (til CW).
Tak til Tatiana Naranjo-Palma for hjælpen i den indledende fase af dette projekt, Dr. Jorge Babul og Diego Quiroga-Roger for nyttig diskussion, Robert Lesch for revision af manuskript og Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas fra Universidad de Chile. Tak for at Marcelo Pérez til redigering af video og Neil Stevens til at korrigere tekst og Errol Watson for at give voice-over.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).
