在本协议中, 我们展示了在果蝇间接飞行肌肉中应用的序列切片电子断层扫描来阐明线粒体结构。
线粒体是细胞的动力, 产生 ATP, 脂质和代谢物, 以及调节钙稳态和细胞死亡。独特的嵴丰富的双膜超微结构的这个细胞是优雅的安排, 以执行多种功能的划分生物分子。线粒体超微结构与各种功能密切相关;然而, 这些结构-函数关系的细微细节才刚刚开始被描述。在这里, 我们展示了在果蝇间接飞行肌肉中应用的序列切片电子断层扫描来阐明线粒体结构。串联电子断层扫描可用于研究三维的任何细胞结构。
电子显微镜是一个有价值的工具, 研究的结构上下文的亚细胞组装和设备, 执行蜂窝过程。方法已经开发, 以保持组织或细胞的超微结构, 无论是通过化学固定醛或高压冷冻 (HPF) 后, 冷冻置换 (FS)1,2。嵌入的标本块, 然后可以切片, 染色, 并观察用透射电子显微镜 (TEM)。HPF 标本也可以在低温条件下处理, 如冷冻切片或聚焦离子束 (纤维蛋白原) 铣削, 并通过低温 EM3,4观察。
虽然薄片 EM 提供了丰富的形态学洞察力, 结果2D 图像只能揭示特定截面的超微结构。在3D 体积中组织超微结构的方法仍然模糊不清。为了使三维的细胞超微结构可视化, 在获得了一系列倾斜图像并将其投影到生成层析重建5 (图 1) 的情况下, 开发了一种电子断层扫描方法。双倾斜系列可通过旋转样品90°并获得第二倾斜系列来收集。这将减少因取样角度有限而导致的缺少楔形工件, 并提高图的分辨率。
在这里, 我们描述了用于研究果蝇间接飞行肌 (IFM)6、7、8、9的连续切片电子断层扫描的应用。.为了获得覆盖整个线粒体 (大约2.5 µm 厚) 的3D 重建, 序列切片从果蝇IFM 组织块获得。每个部分的断层使用自动数据收集软件单独收集。层析重建和串行断层与 IMOD 包, 以获得重建体积的整个线粒体。通过3D 软件对加入的断层进行了分析。对线粒体嵴的密度进行了细分, 产生了一个在三维度中揭示组织的分割模型。
在本协议中, 我们描述了一个优化的工作流程, 应用序列切片电子断层扫描研究的3D 线粒体超微结构的果蝇间接飞行肌肉。在样品中保存超微结构是这类分析的主要技术挑战。为了更好地保存超微结构, 包括两个方法步骤。首先, 用振动叶片切片切片对组织进行取样, 以尽可能地保持组织结构。其次, 对 HPF/FS 协议进行了优化, 以保留细胞的超微结构, 在准备嵌入标本块。试样在高压下被冻结, 降低了水的冰点, 减少了冰晶的形成, 破坏了超微结构的1。厚度为0.1 毫米的试样可以瞬间被玻璃化, 然后进行冷冻置换, 生成标本块进行 EM 分析。与化学固定方法相比, HPF/FS 对超微结构的保存有明显改善。利用这一系列步骤进行样品制备, 线粒体双层膜和嵴膜的保存得到了明显的改善。
获取试样的连续截面是该方法最具挑战性的步骤。由于电子束的穿透力有限, 因此该截面的厚度分别限制为 250 nm 或 500 nm, 使用 TEM 运行在200伏或300伏。由于线粒体的厚度可能超过2µm, 因此需要连续的部分才能获得完整的体积重建。但是, 恢复足够数量的串行部分来跨越整个细胞是一个技术难题。在梯形的基座之间尽可能平整地修剪块面, 可以使插槽网格容纳更多的截面, 从而覆盖较大的卷。此外, 对于精简部分, 使用一个完美的循环会增加将串行部分转移到网格的成功率。
串联电子断层扫描可以用标准的 EM 核心设备来完成。然而, 由于技术的限制, 该方法有一些不可避免的局限性。一是材料不可避免地在连续的区段之间丢失, 在联接的重建留下空白。第二是缺少的楔形工件, 这是由于有限的倾斜角度, 是可以实现的。这种限制发生的原因是, 试样持有者不能完全旋转而不堵塞电子束。尽管有这些限制, 连续切片电子断层扫描提供了足够的分辨率, 以揭示细胞和器官的超微结构在3D。
对于较小规模的成像, 低温电子断层扫描是一种新兴的技术, 可用于获得结构的大分子复合体和程序集原位在 nm 或 sub-angstrom 分辨率与 sub-tomographic 结合重建3。在这种应用中, 细胞通过切片或聚焦离子束在液氮下铣削而变薄。断层是在低温条件下收集的, 在这种情况下, 分子结构保存在靠近原生状态的地方, 没有化学固定、脱水或嵌入。在天平的另一端, 以牺牲分辨率为代价来分析大的组织体积, 串口扫描电子显微镜是一种吸引人的方式, 尽管它需要特定的仪器4。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是在细胞和有机体生物学研究所和台湾台北中央研究院的低温 em 核心进行的。这项工作得到了中央研究院和大多数的支持。
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |