Neste protocolo, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila .
As mitocôndrias são potências celulares que produzem ATP, lipídios e metabólitos, bem como regulam a morte de homeostase e celular de cálcio. A ultraestrutura exclusivos ricos em cristas de membrana dupla desta organela é elegantemente disposta a desempenhar as múltiplas funções de particionamento de biomoléculas. Ultraestrutura mitocondrial está intimamente ligada com várias funções; no entanto, os detalhes dessas relações estrutura-função estão apenas começando a ser descrito. Aqui, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila . Tomografia computadorizada serial-seção elétron pode ser adaptada para estudar qualquer estrutura celular em três dimensões.
Microscopia eletrônica é uma ferramenta valiosa para estudar o contexto estrutural de organelas que executam processos celulares e subcelulares assemblies. Métodos têm sido desenvolvidos para preservar a ultraestrutura dos tecidos ou células ou por fixação química com aldeídos ou pela alta pressão frio (HPF) seguido por congelar a substituição (FS)1,2. Os blocos da amostra incorporado podem então ser seccionados, manchados e observados com um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O espécime de HPF também poderia ser processado sob cryo-condição, tais como secionando cryo ou pelo feixe de íon focalizado (FIB) moagem e observado pela cryo-EM3,4.
Embora EM fino-seção fornece introspecções morfológicas informativas, as imagens 2D resultantes só podem revelar a ultraestrutura de uma secção específica. Como a ultraestrutura é organizada em um volume 3D permanece obscurecida. Para visualizar a ultraestrutura celular em três dimensões, um método de tomografia computadorizada do elétron foi desenvolvido onde série de imagens de inclinação foram adquirido e volta projetada para gerar uma reconstrução tomográfica5 (Figura 1). Uma série de dupla inclinação pode ser coletada pela amostra de 90° de giro e aquisição de uma segunda série de inclinação. Isto minimizará faltando-Cunha artefatos que resultam de ângulos de amostragem limitada e melhorar a resolução da tomografia.
Aqui, descrevemos a aplicação da tomografia computadorizada serial-seção elétron para estudar a ultraestrutura mitocondrial de Drosophila voo indirecto muscular (IFM)6,7,8,9 . A fim de obter reconstruções 3D cobrindo toda mitocôndria (aproximadamente 2,5 µm de espessura), seriais seções foram obtidas de blocos de tecido IFM de Drosophila . Tomograms de cada seção foram coletados individualmente usando software de coleta de dados automática. Reconstruções tomográficas foram geradas e seriais tomograms juntaram-se com o pacote IMOD para obter um volume reconstruído de uma mitocôndria inteira. Os tomograms apensos foram analisados pelo software 3D. As densidades de cristas mitocondriais foram segmentadas para gerar um modelo de segmentação que revelou a organização em três dimensões.
Neste protocolo, descrevemos um fluxo de trabalho otimizado para a aplicação de tomografia computadorizada serial-seção elétron para estudar 3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto de Drosophila . Preservação da ultraestrutura na amostra é o principal desafio técnico para este tipo de análise. Para melhor preservar a ultraestrutura dois metodológicas passos foram incluídos. Primeiro, o tecido foi sampleado por seccionamento com micrótomo de lâmina de vibração, a fim de manter a arquitetura do tecido tanto quanto possível. Em segundo lugar, um protocolo de HPF/FS foi otimizado para preservar a ultraestrutura organela durante a preparação dos blocos da amostra incorporado. Espécimes foram congelados sob alta pressão, que abaixa o ponto de congelamento da água e reduz a formação de cristais de gelo que danificam a ultraestrutura1. Espécimes tão grossos como 0,1 mm podem ser vitrificados instantaneamente e em seguida submetidos para congelar a substituição para gerar blocos de amostra para análise EM. Melhor preservação da ultraestrutura HPF/FS observou-se, quando comparado aos métodos de fixação química. Preservação das membranas mitocondriais de duplas e membranas de cristas usando esta série de etapas para a preparação da amostra, foi drasticamente melhorada.
Obtenção de secções seriais do espécime é a etapa mais desafiadora do método. Como o feixe de elétrons tem limitado o poder de penetração, a espessura da seção é restrita a qualquer 250 nm ou 500 nm, utilizando uma temperatura de funcionamento em 200 kV ou 300 kV, respectivamente. Porque a espessura de uma mitocôndria pode ser superior a 2 µm, seções seriais são necessários para obter reconstruções de volume completo. No entanto, recuperar um número suficiente de seções seriais para abranger uma organela inteira é um desafio técnico. Aparar a face do bloco para ser tão liso quanto possível entre as bases do trapézio pode permitir que uma grade de slot acomodar mais seções e, assim, cobrir a volumes maiores. Além disso, usando um loop perfeito para seções finas aumenta a taxa de sucesso de transferir as seções seriais para a grade.
Tomografia computadorizada serial-seção elétron pode ser realizada com equipamento de núcleo EM padrão. No entanto, o método tem algumas limitações inevitáveis que surgem a partir as limitações técnicas. Uma é que o material é inevitavelmente perdido entre seções seriais, deixando lacunas na reconstrução se juntou. Em segundo lugar está o artefato ausente da Cunha, que surge devido os ângulos de inclinação limitado que são realizáveis. Essa restrição ocorre porque o suporte de amostra não pode ser transformado em uma rotação completa sem bloquear o feixe de elétrons. Apesar dessas limitações, a tomografia computadorizada serial-seção elétron fornece resolução suficiente para revelar a ultraestrutura celular e das organelas em 3D.
Para a imagem latente de escala menor, tomografia computadorizada do cryo-elétron é uma tecnologia emergente que pode ser usada para obter a estrutura macromolecular complexos e montagens em situ em resolução nm ou sub angstrom em combinação com subtomográfica reconstrução3. Nesta aplicação, as células são diluídas por corte ou por feixe de íon focalizado sob nitrogênio líquido de moagem. Os tomograms são coletados sob condições de cryo onde estruturas moleculares são preservadas perto do estado nativo sem fixação química, desidratação ou incorporação. No extremo oposto da escala, para analisar volumes grandes de tecido, em detrimento da resolução, serial bloco-rosto microscopia eletrônica é uma modalidade de atraente mesmo que requer um instrumento específico4.
The authors have nothing to disclose.
Os estudos foram realizados no núcleo no Instituto de celular e biologia organísmica e o núcleo de cryo-EM da Academia Sinica, Taipei, Taiwan. O trabalho foi apoiado pela Academia Sinica e a maioria.
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |