ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .
המיטוכונדריה הם תחנות כוח הסלולר לייצר ATP, ליפידים ו מטבוליטים, כמו גם לווסת הומאוסטזיס סידן ומוות תא. Ultrastructure ייחודי עשיר cristae קרום כפול של אברון זה מסודר באלגנטיות כדי לבצע פונקציות מרובות על-ידי חלוקה למחיצות של מולקולות. Ultrastructure מיטוכונדריאלי קשורה בטבורה עם פונקציות שונות; עם זאת, הפרטים הקטנים של מערכות היחסים הללו מבנה פונקציה הם רק ההתחלה ראוייה. . הנה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה . טומוגרפיה סדרתי-סעיף אלקטרון עשוי להיות מותאם כדי ללמוד כל המבנה התאי של שלושה ממדים.
מיקרוסקופ אלקטרונים הוא כלי חשוב ללמוד את ההקשר המבני של הרכבות subcellular ואת organelles לבצע תהליכים תאיים. פותחו שיטות כדי לשמר ultrastructure של רקמות או תאים או על ידי קיבוע כימי עם aldehydes או על ידי לחץ גבוה קפוא (HPF) ואחריו להקפיא החלפת (FS)1,2. הבלוקים הדגימה מוטבע ייתכן ואז להיות למחלקה, צבעונית, נצפתה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). הדגימה HPF יכול גם לעבד בתנאי הקפאה, כגון על ידי חלוקתה הקפאה או יון ממוקדת קרן (שיקרתי) כרסום, שנצפה על ידי הקפאה-EM3,4.
למרות סעיף דק EM מספק תובנות מורפולוגיות אינפורמטיבי, תמונות דו-ממדיות וכתוצאה מכך יכול לחשוף רק את ultrastructure של חתך מסוים. איך ultrastructure מאורגן תלת-ממדי נשאר מעורפל. על מנת להמחיש ultrastructure הסלולר בשלושה ממדים, פותחה שיטת טומוגרפיה אלקטרון שבו סדרה של תמונות הטיה היו רכשה, מוקרן בחזרה כדי ליצור שחזור טומוגרפי5 (איור 1). סדרה הטיה זוגי ניתן לאסוף על ידי סיבוב המדגם 90° ורכישת סדרה הטיה השניה. הדבר יצמצם את חפצי טריז-חסר לגרום מזוויות דגימה מוגבל ומשפרים ברזולוציה של tomogram…
כאן, אנו מתארים את היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה ללמוד ultrastructure מיטוכונדריאלי דרוזופילה טיסה עקיף שריר (IFM)6,7,8,9 . על מנת לקבל שחזורים תלת-ממד כיסוי כל המיטוכונדריה (כ 2.5 מיקרומטר-עבה), סעיפים טורי התקבלו מבלוקים רקמות IFM דרוזופילה . Tomograms של כל אחד מהמקטעים נאספו בנפרד באמצעות תוכנה איסוף נתונים אוטומטי. שחזורים טומוגרפי נוצרו, tomograms טורי הצטרפו עם החבילה IMOD כדי לקבל נפח המשוחזרת מיטוכונדריון כולו. Tomograms הצטרף נותחו על ידי תוכנה תלת-ממד. הצפיפויות של cristae מיטוכונדריאלי היו מחולקים כדי ליצור מודל פילוח חשף הארגון שלושה ממדים.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים זרימת עבודה מיטביים להחלת סדרתי-סעיף אלקטרון טומוגרפיה ללמוד 3D ultrastructure מיטוכונדריאלי של שריר טיסה עקיף דרוזופילה . שימור ultrastructure במדגם הוא האתגר הטכני העיקרי עבור סוג זה של ניתוח. על מנת לשמר בצורה הטובה ביותר ultrastructure שני מתודולוגי נכללו צעדים. ראשית, רקמות. בדקנו על ידי חלוקתה עם רטט מיקרוטום להב על מנת לשמור על הארכיטקטורה רקמות ככל האפשר שנית, פרוטוקול HPF/FS אופטימלי כדי לשמר את אברון ultrastructure במהלך הכנת גושי הדגימה מוטבעים. דגימות קפאו בלחצים גבוהים, אשר מוריד את נקודת קיפאון של מים ומפחית היווצרות של גבישי קרח נזק ultrastructure1. דגימות עבה כמו 0.1 מ מ יכול להיות vitrified באופן מיידי, נתון ואז להקפיא החלפת להפקת בלוקים הדגימה לבדיקה EM. שימור משופרת של ultrastructure על ידי HPF/FS צוין, לעומת שיטות קיבוע כימי. באמצעות סדרת צעדים עבור הכנת הדוגמא, שימור ממברנות זוגי מיטוכונדריאלי וממברנות cristae היה השתפרו באופן דרמטי.
קבלת מקטעים טורי של הדגימה היא הצעד המאתגר ביותר של השיטה. כפי כשקרן האלקטרונים מוגבל כוח חדירה, העובי של הסעיף היא מוגבלת או 250 ננומטר או 500 ננומטר באמצעות TEM פועל ב 200 kV או 300 kV, בהתאמה. בגלל העובי של מיטוכונדריון עשוי להיות יותר מ 2 מיקרומטר, סעיפים טורי נדרשים להשיג שחזורים בפול ווליום. עם זאת, שחזור מספר מספיק של טורי מקטעים כדי להתפרס על אברון כולה היא אתגר טכני. זמירה פני בלוק להיות שטוח ככל האפשר בין הבסיסים של טרפז באפשרותך לאפשר רשת חריץ להכיל מקטעים נוספים, ובכך מכסה אחסון גדולים יותר. בנוסף, באמצעות לולאה מושלם עבור מקטעים דק גדל שיעור ההצלחה של העברת הסעיפים טורי לרשת.
טומוגרפיה סדרתי-סעיף אלקטרון יכול להתבצע באמצעות ציוד סטנדרטי של הליבה EM. אולם, השיטה יש כמה מגבלות נמנע מהתבטאויות אילוצים טכניים. אחד הוא חומר זה נמצא באופן בלתי נמנע לאיבוד בין מקטעים טורי, עוזב פערים שחזור המצורפים. השני הוא החפץ טריז חסר, אשר מתעורר עקב הזוויות ההטיה מוגבלת זה השגה. הגבלה זו מתרחשת כיוון לא פנה בעל הדגימה סיבוב מלא בלי לחסום את קרן אלקטרונים. למרות מגבלות אלו, טומוגרפיה סדרתי-סעיף אלקטרון מספק רזולוציה מספיק כדי לחשוף את ultrastructure הסלולר והדואר אברון ב- 3D.
עבור הדמיה בקנה מידה קטן יותר, הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה היא טכנולוגיה מתפתחים יכול לשמש כדי להשיג את המבנה של macromolecular מתחמי וההרכבות בחיי עיר ברזולוציה ננומטר או תת אנגסטרום בשילוב עם תת-טומוגרפי שחזור3. ביישום זה, התאים הם מדולל על ידי חלוקתה או יון ממוקדת קרן כרסום תחת חנקן נוזלי. Tomograms נאספים בתנאים-הקפאה שבו מבנים מולקולריים נשמרים קרוב למצב מקורי ללא קיבוע כימי, התייבשות או הטבעה. בקצה השני של הסקאלה, לנתח אמצעי אחסון רקמות גדולים על חשבון ברזולוציה, מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה פרצוף-בלוק טורי הוא מודאליות מושך למרות זה דורש מכשיר ספציפי4.
The authors have nothing to disclose.
המחקרים בוצעו הליבה EM-מכון של הטלפון הסלולרי וביולוגיה אורגניזם, ליבת הקפאה-EM אקדמיה Sinica, טאיפיי, טייוואן. העבודה נתמך על ידי האקדמיה Sinica ואת רוב.
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |