Summary
في هذا البروتوكول، ونظهر تطبيق إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي لتوضيح الهيكل المتقدرية في العضلات المورفولوجية الرحلات غير المباشرة.
Abstract
الميتوكوندريا هي القوى الخلوية التي تنتج ATP، والدهون، ونواتج الأيض، فضلا عن تنظيم الكالسيوم التوازن وخلية الموت. يتم ترتيب أولتراستروكتوري غشاء مزدوج كريستاي الغنية الفريدة لهذا عضية أناقة الاضطلاع بمهام متعددة بتقسيم الجزيئات الحيوية. أولتراستروكتوري المتقدرية يرتبط ارتباطاً وثيقا بمهام مختلفة؛ بيد أن التفاصيل الدقيقة لهذه الدالة بنية العلاقات فقط بداية وصف. هنا، علينا أن نظهر تطبيق إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي لتوضيح الهيكل المتقدرية في العضلات المورفولوجية الرحلات غير المباشرة. إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي يمكن تكييفها لدراسة أي البنية الخلوية في ثلاثة أبعاد.
Introduction
المجهر الإلكتروني هو أداة قيمة لدراسة سياق الهيكلية لجمعيات سوبسيلولار والعضيات التي تقوم بالعمليات الخلوية. تم وضع أساليب للحفاظ على أولتراستروكتوري من الأنسجة أو الخلايا أما بالتثبيت الكيميائي مع الألدهيدات أو بالضغط العالي تجميد (HPF) متبوعاً بتجميد استبدال (خ)1،2. القطع جزءا لا يتجزأ من العينة قد ثم تكون مقطوع الملون ولاحظ مع انتقال إلكترون مجهر (TEM). العينة هبف يمكن أيضا معالجة ظروف البرد، كما هو الحال بتقطيع البرد أو بتركيز أيون شعاع (التعزيز) الطحن، ويراعي بالبرد-م3،4.
على الرغم من أن قسم رقيقة م يقدم أفكاراً المورفولوجية الزاخر بالمعلومات، 2D الصور الناتجة يمكن أن تكشف فقط أولتراستروكتوري لشريحة معينة. كيف يتم تنظيم أولتراستروكتوري في حجم ثلاثي الأبعاد ما زالت تحجب. من أجل تصور أولتراستروكتوري الخلوية في ثلاثة أبعاد، تم تطوير أسلوب التصوير المقطعي إلكترون حيث حصلت سلسلة من الصور إمالة والعودة المتوقعة لتوليد تعمير تمجربهك5 (الشكل 1). ويمكن جمع سلسلة مزدوجة ميل بالتناوب العينة 90°، والحصول على سلسلة ميل ثاني. وهذا سيقلل من التحف آسفين المفقودين التي تنجم عن أخذ عينات محدودة الزوايا وتحسين القرار من توموجرام.
وهنا يصف لنا تطبيق التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-قسم لدراسة أولتراستروكتوري المتقدرية المورفولوجية الرحلات غير المباشرة العضلات (IFM)6،7،،من89 . من أجل الحصول على إعادة البناء ثلاثي الأبعاد تغطي كامل الميتوكوندريا (حوالي 2.5 ميكرون سميكة)، تم الحصول على مقاطع المسلسل من كتل الأنسجة IFM المورفولوجية . جمعت توموجرامس من كل قسم على حدة باستخدام برامج جمع البيانات تلقائياً. تم إنشاؤها تمجربهك عمليات إعادة البناء وانضم توموجرامس المسلسل مع مجموعة إيمود للحصول على وحدة تخزين أعيد بناؤها في ميتوكندريا أكملها. وجرى تحليل توموجرامس انضم ببرامج 3D. كانت مجزأة كثافة mitochondrial cristae لإنشاء نموذج الانقسام التي كشفت المنظمة في ثلاثة أبعاد.
Protocol
1-قسم المورفولوجية الأنسجة مبضع بليد تهتز باستخدام
- تخدير المورفولوجية على الجليد وتزج كل ذبابة واحدة في 1 مل من 4% [اغروس] انصهار منخفضة في المخزن المؤقت للفوسفات. يسمح [اغروس] ترسيخ على الجليد. بشكل عام، تم تجهيز الذباب 4-6.
- استخدم مبضع بليد تهتز القسم [اغروس] هلام مضمن المورفولوجية إلى شرائح مع 100 ميكرون سمك وتزج في محلول مثبت يحتوي على 2.5 ٪ glutaraldehyde في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 متر.
ملاحظة: تقطيع فيبرتوم المفضل نظراً لهندسة الأنسجة لا تزال سليمة أكثر مقارنة بالأساليب الأخرى. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام تشريح ملاقط تشريح IFM في الحل مثبت يحتوي على 2.5 ٪ glutaraldehyde في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 متر.
2-إعداد العينات م بتجميد الضغط العالي وأسلوب الإحلال (هبف/خ) تجميد
- أغسل أقسام الأنسجة في 3 قطرات (~ 150 ميليلتر) من المخزن المؤقت للفوسفات، تليها 2 قطرات (~ 100 ميليلتر) العازلة الفوسفات مع جيش صرب البوسنة 20%. ثم ضع مقاطع في شركات الذهب هبف مليئة بجيش صرب البوسنة المخزن المؤقت و 20 في المائة.
- تحميل نموذج يحتوي على الناقلين في ثلاجة ذات الضغط العالي وفقا لدليل المستخدم.
- بعد تجميد، الإفراج عن ناقلات من صاحب تحت النتروجين السائل ونقل إلى تجميد استبدال جهاز تبريد إلى-140 درجة مئوية.
- تنفيذ البروتوكول تجميد استبدال كما هو مبين في الجدول 1، مع خ كوكتيل يحتوي على glutaraldehyde 2% و 2% أكسيد الاوزميوم خلات اليورانيل 0.1% في الأسيتون.
- بعناية إزالة العينات من الناقلين بإبرة وتضمين عينات في الراتنج في درجة حرارة الغرفة. بلمرة الراتنج عند 65 درجة مئوية ح 16.
ملاحظة: ينبغي تعديل البروتوكولات خ لإعداد أنواع أخرى من العينات. ويفضل هبف/خ الحفاظ أولتراستروكتوري وتقليل فقدان المحتويات الخلوية.- وبدلاً من ذلك، تطبيق بروتوكول تثبيت الكيميائي. إصلاح العينات مع 2.5 ٪ glutaraldehyde بين عشية وضحاها، وتغسل مع المخازن المؤقتة والإصلاح ثم مع أكسيد الاوزميوم 1% ل 2 حاء – المياه والصرف الصحي ويذوي بترتيب تصاعدي تركيزات إيثانول وثم التسلل وتضمين عينات في الراتنج في سبور قبل مبلمرة عند 65 درجة مئوية ل 16 (ح).
3-إعداد مقاطع المسلسل من العينات للتصوير المقطعي الإلكترون
- تقليم كتل العينة لفضح الوجه المطلوب كتلة تحتوي على الأنسجة.
- بريتريات جزيئات الذهب (10 نانومتر في القطر) مع جيش صرب البوسنة 1% عن 30 دقيقة أغسل وتعليق جزيئات الذهب في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. تراكب جزيئات الذهب في شبكات النحاس فتحه مغطاة بطبقة الكربون الفيلم لإنشاء علامات الاعتماد.
- الاختيار تحت تيم أن يكون علامات الاعتماد كافية (على الأقل 5-10 علامات) في مجال الرؤية لاقتناء التصوير المقطعي.
- قص المسلسل المقاطع، 200-250 نيوتن متر في سمك، استخدام أولتراميكروتومي.
- جمع الأجزاء المسلسل على شبكات فتحه باستخدام حلقة مثالية لمقاطع رقيقة.
- وصمة عار المقاطع مع سترات رينولد بالرصاص لمدة 10 دقائق.
- تراكب طبقة ثانية من جزيئات الذهب الاعتماد على رأس الفروع.
4-جمع التصوير المقطعي الإلكترون مزدوجة والميل
- تحميل الشبكة على حامل ثنائي-محور التصوير المقطعي وإدراج في المجهر الإلكتروني انتقال العاملة على 200 كيلو فولت.
- قم بمحاذاة المجهر في التركيز يوسينتريك.
- قم بإعداد برامج جمع البيانات تلقائياً. ضبط ومحاذاة شعاع الإلكترون في وضع التصوير متعدد المقاييس. الرجوع إلى دليل المستخدم لعملية التفصيل10 (الشكل 2).
- الحصول على المراجع كاميرا مظلمة ومشرقة في منطقة فارغة دون الفيلم الكربون تحت الإعداد جمع التصوير المقطعي.
- جمع من أطلس شبكة في تضخم منخفض. حدد الميتوكوندريا على مقاطع المسلسل كأهداف لمجموعة التصوير المقطعي.
- الحصول على سلسلة إمالة من-60 ° إلى + 60 درجة مع زيادات 2 ° على المحور-أ لكل هدف.
ملاحظة: ستواجه زوايا إمالة بتصميم لصاحب العينة ميكانيكيا. سيتم منع صاحب الشعاع في زوايا الميل العالية. - لجمع هذه السلسلة الميل الثاني، قم بتدوير صاحب العينة 90°. اكتساب أطلس جديد. حدد مواضع المقابلة والحصول على سلسلة إمالة على المحور-ب لكل هدف.
ملاحظة: تتوفر حزم البرامج الأخرى، مثل سيرياليم و Xplore3D، لجمع البيانات تلقائياً.
5-إعادة بناء توموجرامس 3D والجزء الفرعي وحدات التخزين باستخدام البرمجيات
- إعادة بناء توموجرامس صور إمالة المحور المزدوج باستخدام البرمجيات إيمود11.
- الرجوع إلى دليل المستخدم للاطلاع على التفاصيل العملية.
- قم بمحاذاة سلسلة إمالة الفردية بالمواقع لعلامات الاعتماد الذهب. إعمار توموجرامس بأسلوب "الإسقاط مرة أخرى" أو بطريقة تقنية التعمير تكرارية المتزامنة (سرت) على حد سواء، محور ومحور-ب، على التوالي (الشكل 3).
- الجمع بين توموجرامس للمحور-أ وب محور لتوليد توموجرام مزدوجة والميل مع انخفاض ملموس آسفين مفقود.
- معا توموجرامس المزدوجة والميل من مقاطع المسلسل للحصول على عمليات إعادة البناء تغطي حجم أسرة ميتوكندريا. نموذج الفجوات بين مقاطع المسلسل بالبرنامج إيمود.
- تقليم انضم توموجرامس وبن إلى حجم المطلوب لتجزئة وحدة التخزين.
- تحليل توموجرامس المسلسل المرتبط باستخدام برنامج 3D.
- الرجوع إلى دليل المستخدم للاطلاع على التفاصيل العملية.
- تصفية توموجرامس مع عامل تصفية ضبابي (أو أسلوب آخر المطلوب) تحسين على النقيض الميزات وتقليل كثافة الخلفية.
- الجزء أولتراستروكتوري الميتوكوندريا أما يدوياً أو تلقائياً.
- عرض نماذج تجزئة للسماح بالتفتيش في 3D.
- إنشاء الأفلام باستخدام الأدوات المتاحة في 3D.
Representative Results
طبقنا إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي لتحليل السمات الهيكلية ل mitochondrial cristae يعبر عن حالته النشطة والشيخوخة. لقد أظهرنا أن الميتوكوندريا من المورفولوجية IFM تشكل وحدة متكاملة كريستي ومصفوفة شبكة في 3D (الشكل 4)7. وباﻹضافة إلى ذلك، تراكم الذباب متحولة مع الحمض النووي mitochondrial النسخ المتماثل عيب والنمط الظاهري شيخوخة المتسارعة الميتوكوندريا التي تتضمن الأقسام الفرعية مثل البصل دوامات الأساسية (الشكل 5)7.
رقم 1: رسم توضيحي للتعمير التصوير المقطعي الإلكترون من سلسلة إمالة. في هذه التجربة، يتم تمرير شعاع إلكترون من خلال كائن ثلاثي الأبعاد عند تحريك الكائن بدرجات مختلفة. لكل شرط الإمالة، ولدت إسقاطاً 2D والتقاطها بكاميرا. ثم الإسقاطات 2D يتوقع العودة لإعادة بناء كائن ثلاثي الأبعاد استناداً إلى نظرية الشريحة الوسطى. في الرسم التوضيحي، يتم إظهار نفس العملية لصورة 2D الأصلي المتوقع إلى أبعاد واحدة تحت زوايا ميل مختلفة. ثم يتم استخدام الإسقاطات د 1 لإعادة بناء الصورة ثنائية الأبعاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: جمع البيانات التلقائية. عرض عارض صور من برامج عرض أطلس فتحه شبكة تحتوي على مقاطع المسلسل، مقياس متعدد استهداف الميتوكوندريا واكتسب إمالة الصور. شريط المقياس = 500 ميكرومتر (لوحة أعلى اليسار)، 100 ميكرومتر (اللوحة السفلية اليسرى)، 1 ميكرومتر (اللوحة اليمنى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: المسلسل-قسم الإلكترون التصوير المقطعي من ميتوكندريا واحدة في العضلات المورفولوجية الرحلات غير المباشرة. ميكروجرافس 2D (أ) و (ب) توموجرامس 3D من أقسام المسلسل تغطي كامل حجم ميتوكندريا. (ج) المقطع المسلسل انضم توموجرامس يتوقع أن إنشاء مقطع طولي، مع محور ع سيظهر عمودياً. جدير بالذكر أن تقطيع الأنسجة أدت إلى فقدان المواد، وترك فجوات بين انضم توموجرامس. شريط المقياس = 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: المتكاملة داخل الميتوكوندريا كريستاي والمصفوفة الشبكة كشفت في 3D- (أ) شرائح من إلكترون المتقدرية تمجربهك عرض رموز التبديل بين الأغشية رقائقي عبر محور ع إعادة البناء. (ب) الرسوم التوضيحية من cristae الملاحظة التبديل بين أنماط من اللوالب وسلم حق و/أو أعسر. تم تجزئة تمجربهك (ج) توضح دوامة أعسر في 3D كريستاي (د) التبديل بين أنماط تحليل ولون المقدمة على نموذج تجزئة (ه، و). تمجربهك شريحة عرض مصفوفة الأفقي كونفلوينسي (كثافة الظلام، تميز الأحمر) عبر أغشية كريستي (كثافة اللون الأبيض). (ز) تجزئة نموذج توموجرام في (ه) عرض مصفوفة الأفقي كونفلوينسي (باللون الأحمر) والممثل كريستي (باللون الرمادي). شريط المقياس = 50 نيوتن متر (A)، 200 نانومتر (ج)، و 300 نانومتر (د، ه، و، ز). وكان الرقم الطبع من جيانغ et al. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الميتوكوندريا مع البصل تشبه دوامات النوى المتراكمة في الذباب مع الحمض النووي mitochondrial النسخ المتماثل العيوب أثناء الشيخوخة. شرائح تمجربهك الممثل وتجزئة المقابلة (لوحات الحق) عرض طريقة عرض المقطع العرضي (أعلى) وطريقة عرض المقطع الطولي (أسفل) من نواة دوامات. تتم الإشارة إلى تجزئة وحدة التخزين بتجسيد اللون التعسفي لتسليط الضوء على جوهر دوامات. شريط الحجم: 200 نانومتر. وكان الرقم الطبع من جيانغ et al. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الخطوة | درجة الحرارة | الوقت | الحل | |||
| 1 | -140 درجة مئوية إلى 0-9 درجة مئوية | 30 دقيقة | النتروجين السائل | |||
| 2 | --90 درجة مئوية | 96 ساعة | خ كوكتيل | |||
| 3 | --90 درجة مئوية إلى-60 درجة مئوية | 6 hr (5 درجة مئوية/ساعة) | خ كوكتيل | |||
| 4 | -60 درجة مئوية | 12 ساعة | خ كوكتيل | |||
| 5 | -60 درجة مئوية إلى-25 درجة مئوية | 7 ساعة (5 درجة مئوية/ساعة) | خ كوكتيل | |||
| 6 | --25 درجة مئوية | 12 ساعة | خ كوكتيل | |||
| 7 | -25 درجة مئوية إلى 0 درجة مئوية | 5 ساعة (5 درجة مئوية/ساعة) | خ كوكتيل | |||
| 8 | 0 درجة مئوية | موارد بشرية 1 × 3 مرات | الأسيتون | |||
| 9 | درجة الحرارة في الغرفة | تسلل الراتنج | ||||
الجدول 1: استبدال تجميد البروتوكول.
Discussion
في هذا البروتوكول، يصف لنا لسير عمل أمثل لتطبيق التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-قسم لدراسة 3D أولتراستروكتوري المتقدرية المورفولوجية الرحلات غير المباشرة العضلات. المحافظة على أولتراستروكتوري في العينة هو التحدي التقني الرئيسي لهذا النوع من التحليل. وأدرجت الخطوات حفاظا على أفضل أولتراستروكتوري اثنين المنهجية. أولاً، كانت عينات الأنسجة بتقطيع مع تهتز مبضع بليد بغية الحفاظ على بنية الأنسجة بقدر الإمكان. وثانيا، كان الأمثل بروتوكول هبف/خ للحفاظ على أولتراستروكتوري عضية أثناء إعداد كتل العينة جزءا لا يتجزأ. وتم تجميد العينات تحت ضغط عال، مما يقلل من نقطة التجمد للمياه ويقلل من تكوين بلورات الجليد التي تلف أولتراستروكتوري1. يمكن الشركة إنتاج على الفور العينات سميكة مثل 0.1 ملم، وثم يتعرض لتجميد استبدال لتوليد كتل العينة لتحليل م. تحسين الحفاظ على أولتراستروكتوري من هبف/خ لوحظ عند مقارنتها بأساليب التثبيت الكيميائي. استخدام هذه السلسلة من الخطوات لإعداد عينة، تحسن كبير الحفاظ على أغشية مزدوجة mitochondrial والأغشية كريستي.
الحصول على مقاطع المسلسل للعينة هو الخطوة الأكثر تحديا للأسلوب. كشعاع الإلكترون قد تغلغل قوة محدودة، سمك الفرع يقتصر على أما 250 نيوتن متر أو 500 نانومتر استخدام تيم التشغيل في 200 كيلوفولت أو 300 كيلو فولت، على التوالي. لأنه قد يكون سمك ميتوكندريا أكثر من 2 ميكرومتر، مقاطع المسلسل مطلوبة للحصول على كامل حجم عمليات إعادة البناء. ومع ذلك، استرداد عدد كاف من مقاطع المسلسل تمتد عضية أكملها تحديا تقنيا. تقليم الوجه كتلة تكون مسطحة قدر الإمكان بين قواعد شبه منحرف السماح لشبكة فتحه لاستيعاب المزيد من المقاطع وهكذا تغطي كميات أكبر. بالإضافة إلى ذلك، استخدام حلقة مثالية لأقسام رقيقة يزيد من معدل نجاح نقل المقاطع المسلسل إلى الشبكة.
يمكن إنجاز إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي مع المعدات الأساسية م القياسية. ومع ذلك، الأسلوب يحتوي على بعض التقييدات الحتمية التي تنشأ عن القيود التقنية. واحد أن المواد تفقد حتما بين مقاطع المسلسل، ترك ثغرات في عملية إعادة إعمار انضم. وثانيها هو قطعة أثرية آسفين المفقودة، التي تنشأ بسبب زوايا الميل المحدودة التي يمكن تحقيقها. يحدث هذا القيد لأنه لا يمكن تشغيل صاحب العينة في استدارة كاملة دون عرقلة شعاع الإلكترون. وعلى الرغم من هذه القيود، يوفر التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-القسم القرار كافية للكشف عن أولتراستروكتوري الخلوية وعضيه في 3D.
للتصوير بمقياس أصغر، هو التصوير المقطعي الإلكترون البرد تكنولوجيا ناشئة التي يمكن استخدامها للحصول على هيكل الجزيئات المجمعات والجمعيات في الموقع في القرار nm أو انغستروم الفرعية في تركيبة مع sub-تمجربهك 3من إعادة الإعمار. في هذا التطبيق، وهي ضعفت الخلايا بتمزيقها أو بواسطة شعاع أيون مركزة طحن تحت النتروجين السائل. وتجمع في توموجرامس تحت ظروف البرد حيث يتم الاحتفاظ بالهياكل الجزيئية قريبة من الدولة الأصلية دون التثبيت الكيميائي، أو الجفاف، أو تضمين. في الطرف الآخر من المقياس، لتحليل كميات كبيرة من الأنسجة على حساب القرار، الميكروسكوب الإلكتروني مسح الوجه كتلة المسلسل طريقة جذابة على الرغم من أنه يتطلب وجود صك محدد4.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
الدراسات التي أجريت في لب م في معهد الخلوية والبيولوجيا أورجانيسميك ولب م cryo "سينيكا"، تايبيه، تايوان. العمل الذي أيده سينيكا ومعظم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474 (2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
