En este protocolo, demostramos la aplicación de la tomografía electrónica serie-sección para dilucidar la estructura mitocondrial en músculo de vuelo indirecto de Drosophila .
Las mitocondrias son las principales compañías celulares que producen ATP, lípidos y metabolitos, así como regulan el calcio homeostasis y muerte celular. La ultraestructura de la única rica en cristae doble membrana de este orgánulo se arregla elegante para llevar a cabo funciones múltiples dividiendo biomoléculas. La ultraestructura mitocondrial está íntimamente ligada con varias funciones; sin embargo, los detalles de estas relaciones de estructura y función están sólo empezando a describir. Aquí, demostramos la aplicación de la tomografía electrónica serie-sección para dilucidar la estructura mitocondrial en músculo de vuelo indirecto de Drosophila . Tomografía electrónica serie-sección puede adaptarse a cualquier estructura celular en tres dimensiones de estudio.
La microscopia electrónica es una herramienta valiosa para estudiar el contexto estructural de organelos que llevan a cabo procesos celulares y subcelulares asambleas. Se han desarrollado métodos para preservar la ultraestructura de tejidos o células, ya sea por fijación química con aldehídos o por alta presión (HPF) de congelación seguida de congelación de sustitución (FS)1,2. Los bloques integrados muestra luego se ser seccionados, manchados y observados con un microscopio electrónico de transmisión (TEM). La muestra de HPF también podría ser procesada bajo condición de crio, como dividiendo el cryo o por la viga de ion enfocada (FIB) fresado y observados por cryo-EM3,4.
Aunque EM de la fino-sección proporciona penetraciones morfológicas informativos, las imágenes 2D sólo pueden revelar la ultraestructura de una sección particular. Cómo se organiza la ultraestructura en un volumen 3D sigue siendo obscured. Para poder visualizar la ultraestructura celular en tres dimensiones, un método de tomografía electrónica fue desarrollado donde serie de imágenes de inclinación se adquirió nuevo proyecta para generar una reconstrucción tomográfica5 (figura 1). Puede recoger una serie de doble inclinación girando la muestra 90° y adquisición de una segunda serie de inclinación. Esto minimizará la cuña que faltan artefactos que resultan de ángulos limitado muestreo y mejoran la resolución de la tomografía de tórax.
Aquí, describimos el uso de tomografía electrónica serie-sección para el estudio de la ultraestructura mitocondrial de Drosophila vuelo indirecto músculo (IFM)6,7,8,9 . Para obtener reconstrucciones 3D que cubre todas mitocondrias (aproximadamente 2.5 μm de espesor), se obtuvieron las secciones seriales de bloques de tejido IFM de Drosophila . Los tomogramas de cada sección se colectaron individualmente usando software de recopilación automática de datos. Reconstrucciones tomográficas fueron generadas y los tomogramas serie se unieron con el paquete IMOD para obtener un volumen reconstruido de una mitocondria entera. Los tomogramas se unieron fueron analizados mediante software 3D. Las densidades de los cristae mitocondriales fueron segmentadas para generar un modelo de segmentación que reveló la organización en tres dimensiones.
En este protocolo, se describe un flujo de trabajo optimizado para la aplicación de la tomografía electrónica serie-sección para estudiar 3D ultraestructura mitocondrial del músculo de vuelo indirecto de Drosophila . Preservación de la ultraestructura de la muestra es el principal desafío técnico para este tipo de análisis. Para mejor preservar ultraestructura dos metodológicos incluyeron los pasos. En primer lugar, tejido fue muestreado por el seccionamiento con micrótomo de cuchilla de vibración con el fin de mantener la arquitectura de tejido tanto como sea posible. En segundo lugar, un protocolo de HPF/FS fue optimizado para preservar la ultraestructura orgánulo durante la preparación de bloques de muestra incorporado. Las muestras fueron congeladas bajo alta presión, que disminuye el punto de congelación del agua y reduce la formación de cristales de hielo que dañan la ultraestructura1. Muestras de espesor 0,1 mm puede ser vitrificado instantáneamente y luego sometido a congelación de sustitución para generar bloques de muestras para análisis de EM. Se observó la conservación mejorada de ultraestructura por HPF/FS, comparado con métodos de fijación química. Usando esta serie de pasos para la preparación de la muestra, preservación de las membranas dobles mitocondriales y membranas cristae mejoró dramáticamente.
Obtención de secciones seriadas de la muestra es el paso más difícil del método. Como el haz de electrones ha limitado poder de penetración, el espesor de la sección se limita a cualquiera de los dos 250 nm o 500 nm con un TEM operando a 200 kV o 300 kV, respectivamente. Porque el grosor de una mitocondria puede ser más de 2 μm, las secciones seriales están obligadas a obtener reconstrucciones de volumen completo. Sin embargo, recuperar un número suficiente de secciones seriadas para abarcar un organelle entero es un desafío técnico. Recortar la cara de bloque para ser tan plano como sea posible entre las bases de la distorsión trapezoidal puede permitir una cuadrícula de ranura acomodar más secciones y así cubrir mayores volúmenes. Además, utiliza un circuito perfecto para secciones finas aumenta la tasa de éxito de la transferencia de las secciones seriadas a la red.
Tomografía de serie-sección electrónica puede realizarse con equipo estándar de la base de la EM. Sin embargo, el método tiene algunas limitaciones inevitables que surgen de restricciones técnicas. Uno es que el material es inevitablemente perdido entre las secciones seriales, dejando huecos en la reconstrucción se unieron. En segundo lugar es el que falta artefacto de cuña, que surge debido a la inclinación limitada que es alcanzables. Esta restricción se produce porque el sostenedor del espécimen no se puede activar en una rotación completa sin necesidad de bloquear el haz de electrones. A pesar de estas limitaciones, la tomografía electrónica serie-sección ofrece suficiente resolución para revelar la ultraestructura celular y organelas en 3D.
Para la proyección de imagen de escala más pequeña, tomography del cryo-electrón es una tecnología emergente que puede utilizarse para obtener la estructura de macromoleculares complejos y ensambles en situ en resolución nanómetro o el angstrom en combinación con sub-tomográfica reconstrucción3. En esta aplicación, las células están enrarecidas por seccionamiento o por haz de iones enfocado fresado bajo nitrógeno líquido. Los tomogramas se recogen condiciones de cryo donde se conservan estructuras moleculares cerca el estado nativo sin fijación química, deshidratación o incrustación. En el otro extremo de la escala, para analizar los volúmenes grandes de tejido a expensas de la resolución, microscopía electrónica de serie de cara de bloque es una modalidad atractiva aunque necesita un instrumento específico4.
The authors have nothing to disclose.
Los estudios fueron realizados en la base de EM en el Instituto de biología celular y organísmica y el núcleo de cryo-EM de la Academia Sinica, Taipei, Taiwán. El trabajo fue apoyado por la Academia Sínica y más.
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |