Dans ce protocole, nous démontrons l’application de la tomographie électronique série-section d’élucider la structure mitochondriale dans les muscles de vol indirect de drosophile .
Les mitochondries sont des éléments cellulaires puissants qui produisent des métabolites ATP et lipides, mais aussient de régulent le calcium l’homéostasie et la mort cellulaire. L’ultrastructure unique riche en crêtes double membrane de cet organite est élégamment disposé à remplir plusieurs fonctions en partitionnant les biomolécules. Ultrastructure mitochondriale est intimement liée à différentes fonctions ; Toutefois, les détails de ces relations structure-fonction commencent seulement à être décrite. Ici, nous démontrons l’application de la tomographie électronique série-section d’élucider la structure mitochondriale dans les muscles de vol indirect de drosophile . La tomographie électronique série-section peut être adaptée pour étudier toute structure cellulaire en trois dimensions.
Microscopie électronique est un outil précieux pour étudier le contexte structural des assemblées subcellulaires et organites qui effectuent les processus cellulaires. Méthodes ont été développées afin de préserver l’ultrastructure des cellules ou des tissus soit par fixation chimique avec les aldéhydes ou par haute pression gel (HPF) suivie de congeler substitution (FS)1,2. Les blocs de spécimen incorporé peuvent alors être sectionnés, teintés et observées avec un microscope électronique à transmission (TEM). Le spécimen de HPF pourrait également être traité conformément cryo-État, comme par cryo-sectionnement ou par faisceau ionique focalisé (FIB) fraisage et observé par cryo-EM3,4.
Bien que la section mince EM donne un aperçu morphologiques informative, les images 2D qui en résulte peuvent révéler seulement l’ultrastructure d’une coupe particulière. Comment l’ultrastructure est organisé en un volume 3D reste masqué. Afin de visualiser l’ultrastructure cellulaire en trois dimensions, une méthode de tomographie électronique a été développée où série d’images de l’inclinaison ont été acquis et retour prévu pour générer une reconstruction tomographique5 (Figure 1). Une série de double inclinaison peut être collectée en tournant l’échantillon de 90° et d’acquérir une deuxième série d’inclinaison. Ceci minimisera les artefacts des coins manquants qui résultent des angles de l’échantillonnage limité et améliorer la résolution de la tomodensitométrie :.
Nous décrivons ici l’application de la tomographie électronique série-section pour étudier l’ultrastructure mitochondriale de Drosophila vol indirect muscle (IFM)6,7,8,9 . Afin d’obtenir des reconstructions 3D couvrant toute mitochondries (environ 2,5 µm d’épaisseur), coupes sériées proviennent de blocs de tissus Drosophila IFM. Tomographies de chaque section ont été prélevés individuellement à l’aide de logiciels de collecte automatique de données. Reconstruction tomographique ont été obtenues des tomographies séries ont été jointes avec le package IMOD pour obtenir un volume reconstruit d’une mitochondrie ensemble. Les tomographies jointes ont été analysées par le logiciel 3D. Les densités des crêtes mitochondriales sont segmentées pour générer un modèle de segmentation qui a révélé l’organisation en trois dimensions.
Dans ce protocole, nous décrivons un workflow optimisé pour l’application de tomographie électronique série-section Etudier 3D ultrastructure mitochondriale des muscles de vol indirect de drosophile . Préservation de l’ultrastructure dans l’échantillon est le principal défi technique pour ce type d’analyse. Afin de mieux préserver l’ultrastructure deux méthodologiques, des mesures ont été inclus. Tout d’abord, le tissu a été échantillonné en sectionnant avec vibration microtome de lame afin de maintenir l’architecture tissulaire autant que possible. Deuxièmement, un protocole de HPF/FS a été optimisé pour préserver l’ultrastructure organites lors de la préparation des blocs d’échantillons embarqués. Échantillons ont été congelés sous haute pression, ce qui abaisse le point de congélation de l’eau et réduit la formation de cristaux de glace qui endommagent l’ultrastructure1. Spécimens aussi épais que 0,1 mm peuvent être vitrifiés instantanément et ensuite soumis pour cryo-substitution pour générer des blocs de l’échantillon pour l’analyse de l’EM. La conservation améliorée de l’ultrastructure de HPF/FS a été notée, par rapport aux méthodes de fixation chimique. Avec cette série d’étapes pour la préparation de l’échantillon, préservation des membranes mitochondriales de doubles et des membranes de crêtes a été considérablement améliorée.
L’étape la plus difficile de la méthode est d’obtenir des coupes sériées du spécimen. Le faisceau d’électrons a limité la capacité de pénétration, l’épaisseur de la section se limite à deux 250 nm ou 500 nm en utilisant un TEM fonctionnant à 200 kV ou 300 kV, respectivement. Parce que l’épaisseur d’une mitochondrie peut être plus de 2 µm, coupes sériées sont tenus d’obtenir des reconstructions de volume complet. Cependant, récupérer un nombre suffisant de coupes sériées pour enjamber un organite ensemble est un défi technique. Tailler la face du bloc pour être aussi plate que possible entre les bases du trapèze peut permettre à une grille de fente accueillir plus de sections et couvre donc les plus gros volumes. En outre, en utilisant une boucle parfaite pour les coupes minces augmente le taux de réussite de transférer les coupes sériées au réseau.
La tomographie électronique série-section peut être accomplie avec équipement de base standard EM. Toutefois, la méthode a quelques limitations inévitables résultant de contraintes techniques. Un est que le matériau est inévitablement perdue entre coupes sériées, laissant de larges vides dans la reconstruction jointe. Deuxième est l’artefact de coin manquant, qui se pose en raison des angles d’inclinaison limitée qui sont réalisables. Cette restriction se produit parce que le porte-échantillon ne peut pas être activé dans une rotation complète sans bloquer le faisceau d’électrons. Malgré ces limites, la tomographie électronique série-section fournit une résolution suffisante pour révéler l’ultrastructure cellulaire et les organites en 3D.
Pour l’imagerie plus petite échelle, la tomographie cryo-électronique est une technologie émergente qui peut être utilisée pour obtenir la structure macromoléculaire complexes et assemblées sur place à résolution nm ou angström auxiliaire en combinaison avec sub-tomographique 3de reconstruction. Dans cette application, les cellules sont éclaircis par découpe ou par faisceau ionique focalisé Rainurez dans l’azote liquide. Les tomographies sont recueillis en vertu de la cryo-conditions où les structures moléculaires sont conservés à proximité de l’état natif sans fixation chimique, déshydratation ou incorporation. À l’autre bout de l’échelle, pour analyser des volumes grand tissu au détriment de la résolution, microscopie électronique à balayage îlot serial est une modalité attrayante même si elle nécessite un instrument spécifique4.
The authors have nothing to disclose.
Les études ont été effectuées dans la base de EM à l’Institut de biologie cellulaire et organismique et la cryo-EM de l’Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Le travail a été soutenu par l’Académie chinoise des sciences et de la plupart.
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |