В этом протоколе мы продемонстрировать применение серийный Секция электрон томографии для выяснения митохондриальной структуры в дрозофилы косвенные полет мышцы.
Митохондрии являются сотовой тяжеловесы, которые производят АТФ, липиды и метаболитов, а также регулировать кальция гомеостаза и клеток смерть. Ультраструктура уникальное макул богатые двойной мембраной этой органелле элегантно организовал для выполнения нескольких функций путем разбиения биомолекул. Митохондриальной Ультраструктура тесно связана с различными функциями; Однако мелкие детали этих отношений структура функции являются только начинают быть описаны. Здесь мы демонстрируем применение серийный Секция электрон томографии для выяснения митохондриальной структуры в дрозофилы косвенные полет мышцы. Томография серийный Секция электрон может быть адаптирована для изучения любой сотовой структуры в трех измерениях.
Электронная микроскопия является ценным инструментом для изучения структурного контекста субцеллюлярные сборок и органеллы, которые выполняют клеточные процессы. Были разработаны методы для сохранения Ультраструктура ткани или клетки, либо путем химической фиксации с альдегидов или под высоким давлением замораживания (HPF), а затем заморозить замещения (FS)1,2. Встроенный образец блоки затем секционного, витражи и наблюдается с просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА). HPF образец также может быть обработан при крио условии, таких как, крио резании или целенаправленного ионного пучка (FIB) фрезерные и под наблюдением крио ет3,4.
Хотя тонкие секции EM предоставляет информативный морфологического исследования, результате 2D изображения можно только раскрыть Ультраструктура определенного сечения. Как Ультраструктура организуется в 3D-объем по-прежнему неясными. Для того, чтобы визуализировать сотовой Ультраструктура в трех измерениях, был разработан метод томография электрона, где серии наклона изображения были приобретены и обратно, согласно прогнозам, генерировать томографических реконструкции5 (рис. 1). Двойной наклон серии могут быть собраны путем вращения образца 90° и приобретения второй серии наклона. Это сведет к минимуму пропавших без вести клин артефактов, которые в результате ограниченной выборки углов и улучшить разрешение томограмм.
Здесь мы описывают применение серийный Секция электрон томографии для изучения митохондриальной Ультраструктура дрозофилы косвенные полет мышцы (IFM)6,7,8,9 . Для того, чтобы получить 3D реконструкций, охватывающих весь митохондрии (примерно 2,5 мкм толстый), последовательный разделы были получены от дрозофилы IFM блоков ткани. Томограмм каждой секции были собраны индивидуально с помощью программного обеспечения для сбора данных. Томографические реконструкций были созданы и серийный томограмм были соединены с IMOD пакет для получения восстановленных объем всего митохондрий. Соединяемые томограмм были проанализированы 3D программного обеспечения. Плотности митохондриальной макул были сегментирована сформировать модель сегментации, которые показали Организации в трех измерениях.
В этом протоколе мы описываем Оптимизированный рабочий процесс для применения серийный Секция электрон томографии для изучения 3D митохондриальной Ультраструктура дрозофилы косвенные полет мышцы. Сохранение Ультраструктура в образце является основной технической проблемой для этого типа анализа. Для того, чтобы лучше сохранить Ультраструктура два методологических шаги были включены. Во-первых был пробы ткани при резании с вибрационным ножа микротома для поддержания тканей архитектуры как можно больше. Во-вторых HPF/FS протокола был оптимизирован для сохранения Ультраструктура органелл в ходе подготовки блоков встроенного образца. Образцы были заморожены под высоким давлением, который понижает точку замерзания воды и уменьшает образование кристаллов льда, которые повреждают Ультраструктура1. Образцы толщиной 0,1 мм может быть мгновенно керамические, а затем подвергается заморозить замещения для создания образца блоки для анализа EM. Было отмечено улучшение сохранения Ультраструктура, HPF/FS, когда по сравнению с методами химической фиксации. С помощью этой серии шагов для пробоподготовки, сохранение митохондриальной двойной мембраны и мембраны макул был значительно улучшен.
Получение последовательных секций образца является наиболее сложным шагом метода. Как электронного луча, имеет ограниченную проникающей способностью, толщина секции ограничивается либо 250 Нм или 500 Нм, используя ТЭМ на 200 кв или 300 кв, соответственно. Потому что толщина митохондрий могут быть более чем 2 мкм, для получения полном объеме реконструкций необходимы последовательные секции. Однако восстановление достаточное количество последовательных разделы охватывают весь органеллы — техническая задача. Отделка блок лицо, чтобы быть как плоский как можно между основания трапеции может позволить слот grid для размещения более секций и таким образом охватывать большие объемы. Кроме того использование идеальный цикл для тонких слоев увеличивает успех скорость передачи последовательных секций в сетке.
Томография серийный Секция электрон может осуществляться со стандартным оборудованием основных EM. Однако этот метод имеет некоторые неизбежные ограничения, которые вытекают из технических ограничений. То, что материал неизбежно теряется между последовательным разделами, оставляя пробелы в присоединился к реконструкции. Во-вторых, отсутствует клин артефакт, который возникает из-за ограниченной наклона углов, которые достижимы. Это ограничение возникает потому, что держатель образца не может быть включен в полное вращение без блокирования электронного луча. Несмотря на эти ограничения серийный Секция электрон томографии обеспечивает достаточное разрешение раскрыть клеточного и органелл Ультраструктура в 3D.
Для меньшего масштаба изображений, крио электронная томография является новой технологией, которая может использоваться для получения структура макромолекулярных комплексов и сборки на месте в резолюции Нм или суб ангстрем в сочетании с суб томографических Реконструкция3. В этом приложении клетки разбавленной путем разрезания или целенаправленного ионный луч, фрезерование под жидкого азота. Томограмм собираются в крио условиях где молекулярные структуры сохранились недалеко от родного государства без химической фиксации, обезвоживание или встраивание. На другом конце шкалы для анализа больших ткани тома за счет резолюции, последовательный блок лицо растровая электронная микроскопия является привлекательным механизм, даже несмотря на то, что он требует определенного инструмента4.
The authors have nothing to disclose.
Исследования проведены в ядре EM в Институт сотовой и организмический биологии и крио EM ядро Синика, Тайбэй, Тайвань. Работа была поддержана Синика и большинство.
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |