I denne protokol viser vi anvendelsen af seriel-sektion elektron tomografi at belyse mitokondrie struktur i Drosophila indirekte flyvning muskel.
Mitokondrier er cellulære kraftcentre, der producerer ATP, lipider og metabolitter samt regulere calcium homeostase og celle død. Unikke cristae-rige dobbelt membran ultrastruktur af denne organelle er elegant indrettet til at udføre flere funktioner ved partitionering biomolekyler. Mitokondrie ultrastruktur er nært forbundet med forskellige funktioner; de fine detaljer af disse struktur-funktion relationer er dog kun begyndelsen til at blive beskrevet. Her, viser vi anvendelsen af seriel-sektion elektron tomografi at belyse mitokondrie struktur i Drosophila indirekte flyvning muskel. Seriel-sektion elektron tomografi kan tilpasses studere ethvert cellulære struktur i tre dimensioner.
Elektronmikroskopi er et værdifuldt redskab til at studere den strukturelle forbindelse subcellulært forsamlingers og organeller, der udfører cellulære processer. Metoder er blevet udviklet for at bevare ultrastruktur af væv eller celler enten ved kemisk fiksering med aldehyder eller af højtryk frysning (HPF) efterfulgt af fryse substitution (FS)1,2. De integrerede model blokke kan derefter sectioned, farves og observeret med et transmissions-elektronmikroskop (TEM). HPF modellen kunne også behandles under cryo-tilstand, som ved cryo-skæring eller fokuseret ion beam (FIB) fræsning, og observeret af cryo-EM3,4.
Selv om tynde-sektion EM giver informativ morfologiske indsigt, kan de resulterende 2D billeder kun afsløre ultrastruktur af et bestemt udsnit. Hvordan ultrastruktur er organiseret i en 3D-version forbliver skjult. For at visualisere cellulære ultrastruktur i tre dimensioner, blev en elektron tomografi metode udviklet hvor serie af tilt billeder blev erhvervet og tilbage forventes for at generere en tomografisk genopbygning5 (figur 1). En dobbelt tilt serie kan indsamles af roterende prøve 90° og erhverve en anden tilt serie. Dette vil minimere mangler kile artefakter, der skyldes begrænset prøveudtagning vinkler og forbedre løsningen af tomogram.
Her, beskriver vi anvendelsen af seriel-sektion elektron tomografi at studere mitokondrie ultrastruktur af Drosophila indirekte flyvning muskel (IFM)6,7,8,9 . For at få 3D rekonstruktioner dækker hele mitokondrier (ca 2,5 µm-tyk), blev seriel afsnit indhentet fra Drosophila IFM væv blokke. Tomogrammer hver sektion blev indsamlet individuelt med automatisk data collection software. Tomografisk rekonstruktioner blev genereret og seriel Tomogrammer blev forenet med pakken IMOD at opnå en rekonstrueret volumen af en hel mitochondriet. De joinforbundne Tomogrammer blev analyseret af 3D-software. Tætheder af mitokondrie cristae blev opdelt for at generere en segmentering model, der afslørede organisation i tre dimensioner.
I denne protokol beskriver vi en optimeret arbejdsprocessen for at anvende serie-sektion elektron tomografi for at studere 3D mitokondrie ultrastruktur af Drosophila indirekte flyvning muskel. Bevarelse af ultrastruktur i prøveopløsningen er den primære tekniske udfordring for denne form for analyse. Bedste bevare ultrastruktur to metodologiske blev skridt inkluderet. Først, væv blev samplet af skæring med vibrerende klinge mikrotom for at opretholde væv arkitektur så meget som muligt. For det andet var en HPF/FS protokol optimeret til at bevare organelle ultrastruktur under udarbejdelsen af integrerede modellen blokke. Prøver var frosset under højt tryk, hvilket sænker frysepunktet for vand og reducerer dannelsen af iskrystaller, der skader ultrastruktur1. Prøver så tyk som 0.1 mm kan forglasset øjeblikkeligt, og derefter udsat for at fryse substitution for at generere modellen blokke til EM analyse. Forbedret bevarelse af ultrastruktur af HPF/FS blev bemærket, i forhold til kemisk fiksering metoder. Ved hjælp af denne serie af trin for prøveforberedelse, var bevarelse af mitokondrie dobbelt membraner og cristae membraner dramatisk forbedret.
At opnå seriel dele af modellen er den mest udfordrende skridt af metoden. Da elektronstrålen har begrænset penetration magt, tykkelse af afsnittet er begrænset til enten 250 nm eller 500 nm med en TEM opererer på 200 kV eller 300 kV, henholdsvis. Fordi tykkelsen af en mitokondriet muligvis mere end 2 µm, skal seriel sektioner opnå fuld volumen rekonstruktioner. Men at inddrive et tilstrækkeligt antal serielle sektioner til at spænde en hele organelle er en teknisk udfordring. Trimning blok ansigtet for at være så fladt som muligt mellem baserne af trapez kan tillade et slot gitter til at rumme flere sektioner og dermed dække større mængder. Derudover øger bruger en perfekt sløjfe for tyndslib succesraten for overførsel seriel sektionerne til gitteret.
Seriel-sektion elektron tomografi kan opnås med EM core standardudstyr. Men metoden har visse uundgåelige begrænsninger, der skyldes tekniske begrænsninger. En er, at materialet er uundgåeligt tabt mellem seriel sektioner, forlader huller i den joinforbundne genopbygning. For det andet er den manglende kile artefakt, der opstår på grund af de begrænsede tilt vinkler, der er opnåelige. Denne begrænsning opstår, fordi præparatholderen ikke kan slås i en fuld rotation uden at blokere elektronstrålen. På trods af disse begrænsninger giver seriel-sektion elektron tomografi nok opløsning til at afsløre cellulære og organelle ultrastruktur i 3D.
For mindre skala imaging er cryo-elektron tomografi en ny teknologi, der kan bruges til at få struktur i makromolekylære komplekser og samlinger uden for levestedet ved nm eller sub Ångstrøm opløsning i kombination med sub-tomografisk genopbygning3. I denne ansøgning, er celler tyndet ved skæring eller fokuseret ion beam fræsning under flydende kvælstof. Tomogrammer indsamles cryo-betingelser hvor molekylære strukturer er bevaret tæt på hjemstat uden kemisk fiksering, dehydrering, eller integrering. I anden enden af skalaen, til at analysere store væv diskenheder på bekostning af opløsning, er seriel blok-ansigt scanning elektronmikroskopi en tiltalende modalitet selvom det kræver et særligt instrument4.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelserne blev udført i EM kernen på Institut for Cellulær og organismens biologi og cryo-EM kernen i Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Arbejdet var støttet af Academia Sinica og de fleste.
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |