3d Mitochondrial Ultrastructure ऑफ Drosophila अप्रत्यक्ष उड़ान पेशी से पता चला सीरियल-सेक्शन इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम Drosophila अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी में mitochondrial संरचना स्पष्ट करने के लिए धारावाहिक धारा इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के आवेदन प्रदर्शित करता है ।

Abstract

Mitochondria का उत्पादन करने वाले सेलुलर बिजलीघर हैं, जो एटीपी, लिपिड, और चयापचयों, साथ ही कैल्शियम homeostasis और कोशिका मृत्यु को विनियमित करते हैं । इस organelle के अनूठे cristae-रिच डबल झिल्ली ultrastructure में अनेक कार्य करने के लिए सुरुचिपूर्ण ढंग से गैर-अणुओं का विभाजन करके व्यवस्थित किया जाता है. Mitochondrial ultrastructure परिचित विभिंन कार्यों के साथ जुड़ा हुआ है; हालांकि, इन संरचना-समारोह संबंधों के ठीक विवरण केवल वर्णन किया जा करने के लिए शुरू कर रहे हैं । यहाँ, हम Drosophila अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी में mitochondrial संरचना स्पष्ट करने के लिए धारावाहिक धारा इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के आवेदन का प्रदर्शन । धारावाहिक खंड इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी तीन आयामों में किसी भी सेलुलर संरचना का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेलुलर प्रक्रियाओं का प्रदर्शन है कि उपसेलुलर विधानसभाओं और organelles के संरचनात्मक संदर्भ का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । तरीकों को या तो aldehydes के साथ रासायनिक निर्धारण या उच्च दाब ठंड (HPF) द्वारा फ्रीज प्रतिस्थापन (FS)^1,2के बाद के ऊतकों या कोशिकाओं के ultrastructure के संरक्षण के लिए विकसित किया गया है । एंबेडेड नमूना ब्लॉकों तो खोदी जा सकती है, दाग, और एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (उनि) के साथ मनाया । HPF नमूना भी क्रायो के तहत कार्रवाई की जा सकती है-हालत, जैसे क्रायो द्वारा या खंड द्वारा केंद्रित आयन बीम (मिथ्या) मिलिंग, और द्वारा मनाया क्रायो-EM^3,4।

हालांकि पतली अनुभाग EM जानकारीपूर्ण रूपात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जिसके परिणामस्वरूप 2d छवियों केवल एक विशेष पार के ultrastructure-अनुभाग प्रकट कर सकते हैं । कैसे ultrastructure एक 3 डी मात्रा में आयोजित किया जाता है अस्पष्ट रहता है । आदेश में सेलुलर ultrastructure कल्पना करने के लिए तीन आयामों में, एक इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी विधि विकसित किया गया था जहां झुकाव छवियों की श्रृंखला का अधिग्रहण किया गया और वापस एक tomographic पुनर्निर्माण⁵ उत्पंन करने के लिए अनुमानित (चित्रा 1) । एक डबल झुकाव श्रृंखला नमूने ९० ° घूर्णन और एक दूसरे झुकाव श्रृंखला प्राप्त करने के द्वारा एकत्र किया जा सकता है । यह लापता कील कलाकृतियों कि सीमित नमूना कोण से परिणाम और स्कैन के समाधान में सुधार को कम करेगा ।

यहाँ, हम Drosophila अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी (IFM)^6,7,8,9 के mitochondrial ultrastructure अध्ययन करने के लिए धारावाहिक खंड इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के आवेदन का वर्णन . आदेश में पूरे mitochondria कवर 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए (लगभग २.५ µm-मोटी), धारावाहिक वर्गों के Drosophila IFM ऊतक ब्लॉकों से प्राप्त किया गया । प्रत्येक अनुभाग के Tomograms स्वचालित डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके व्यक्तिगत रूप से एकत्रित किए गए थे । Tomographic पुनर्निर्माण उत्पंन किए गए थे और सीरियल tomograms IMOD पैकेज के साथ एक पूरे mitochondrion का एक खंगाला खंड प्राप्त करने के लिए शामिल किए गए थे । कट्टे tomograms 3डी साफ्टवेयर से विश्लेषण किया गया । mitochondrial cristae के घनत्व को सेगमेंट में विभाजित किया गया जिससे संगठन को तीन-आयामों में पता चला ।

Protocol

1. धारा Drosophila एक हिल ब्लेड Microtome का उपयोग कर ऊतक Anesthetize बर्फ पर Drosophila और फॉस्फेट बफर में 4% कम पिघलने agarose के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक एकल मक्खी विसर्जित कर दिया । agarose को बर्फ पर जमना की अनुमति दें । सामान्यतया, 4-6 मक्खियों संसाधित किए गए थे । १०० µm मोटाई के साथ स्लाइस में एंबेडेड Drosophila अनुभाग agarose जेल के लिए एक हिल ब्लेड microtome का प्रयोग करें और ०.१ M फास्फेट बफर में २.५% glutaraldehyde वाले निर्धारण समाधान में विसर्जित कर दिया ।नोट: Vibratome को खोदी पसंद है क्योंकि अन्य पद्धतियों की तुलना में टिशू आर्किटेक्चर ज्यादा बरकरार रहता है । वैकल्पिक रूप से, विदारक चिमटी को टुकड़े IFM में ०.१ मीटर फॉस्फेट बफर में २.५% glutaraldehyde वाले समाधान में इस्तेमाल किया जा सकता है । 2. उच्च दबाव ठंड और जम प्रतिस्थापन (HPF/FS) विधि द्वारा उंहें तैयार नमूनों 3 बूंदें (~ १५० µ एल) फॉस्फेट बफर, 2 बूंदें (~ १०० µ एल) के साथ फॉस्फेट बफर के 20% BSA के बाद में ऊतक वर्गों धो लें । फिर बफर और 20% BSA से भरा HPF के लिए सोने के वाहक में वर्गों जगह है । उपयोगकर्ता के मैनुअल के अनुसार एक उच्च दबाव फ्रीजर में वाहक युक्त नमूना लोड । ठंड के बाद, धारक से तरल नाइट्रोजन के तहत जारी वाहक और फ्रीज-प्रतिस्थापन डिवाइस को ठंडा करने के लिए स्थानांतरण-१४० ° c । 2% glutaraldehyde, 2% आज़मियम tetroxide, और ०.१% uranyl एसीटेट एसीटोन में शामिल FS कॉकटेल के साथ, तालिका 1में दिखाए गए के रूप में फ़्रीज़-प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल निष्पादित करें । ध्यान से एक सुई और कमरे के तापमान पर राल में एंबेड नमूनों के साथ वाहक से नमूनों को हटा दें । 16 एच के लिए ६५ ° c पर राल Polymerizeनोट: FS प्रोटोकॉल अंय प्रकार के नमूनों को तैयार करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए । HPF/FS ultrastructure को संरक्षित करने और सेलुलर सामग्री की हानि को कम करने के लिए पसंद है । वैकल्पिक रूप से, एक रासायनिक निर्धारण प्रोटोकॉल लागू होते हैं । फिक्स २.५% glutaraldehyde रात भर के साथ नमूनों, बफ़र्स के साथ धोने और फिर 2 h. धोने और इथेनॉल के आरोही सांद्रता के साथ निर्जलीकरण के लिए 1% आज़मियम tetroxide के साथ ठीक है और फिर घुसपैठ और Spurr के राल में एंबेड नमूनों में polymerizing से पहले ६५ डिग्री सेल्सियस के लिए 16 h. 3. धारावाहिक तैयार-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए नमूनों की धारा नमूना ब्लॉक ट्रिम करने के लिए वांछित ब्लॉक चेहरा है कि ऊतक शामिल बेनकाब । सोने के कणों का इलाज (10 व्यास में एनएम) 30 मिनट के लिए 1% BSA के साथ धो और पंजाब के बफर में सोने के कणों को निलंबित । फिड्यूशियल मार्कर बनाने के लिए कार्बन फिल्म के साथ लेपित तांबे स्लॉट ग्रिड पर ओवरले सोने के कणों । उनि के तहत जांच करने के लिए पर्याप्त फिड्यूशियल मार्करों (ंयूनतम 5-10 मार्करों) टोमोग्राफी अधिग्रहण के दृश्य के क्षेत्र में है । कट धारावाहिक वर्गों, मोटाई में २००-२५० एनएम, एक ultramicrotome का उपयोग कर । पतली वर्गों के लिए एक सही पाश का उपयोग कर स्लॉट ग्रिड पर धारावाहिक वर्गों लीजिए. 10 मिनट के लिए है Reynold नेतृत्व साइट्रेट के साथ वर्गों दाग । वर्गों के शीर्ष पर फिड्यूशियल सोने के कणों की एक दूसरी परत ओवरले । 4. डबल झुकाव इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी लीजिए एक दोहरे अक्ष टोमोग्राफी धारक पर ग्रिड लोड और २०० केवी पर काम कर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में डालें । eucentric फोकस पर माइक्रोस्कोप संरेखित करें । स्वचालित डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर सेट करें । इलेक्ट्रॉन बीम को मल्टी स्केल इमेजिंग सेटिंग में समायोजित और संरेखित करें । ऑपरेशन विस्तार के लिए उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें10 (चित्रा 2) । टोमोग्राफी संग्रह की स्थापना के तहत कार्बन फिल्म के बिना एक खाली क्षेत्र में कैमरा अंधेरे और उज्ज्वल संदर्भ प्राप्त करें । कम आवर्धन पर एक ग्रिड एटलस ले लीजिए । टोमोग्राफी संग्रह के लिए लक्ष्य के रूप में धारावाहिक वर्गों पर mitochondria का चयन करें । प्रत्येक लक्ष्य के लिए धुरी पर 2 ° वेतन वृद्धि के साथ-६० ° करने के लिए + ६० ° से एक झुकाव श्रृंखला प्राप्त करें ।नोट: झुकाव कोण यांत्रिक नमूना धारक के डिजाइन के द्वारा विवश किया जाएगा । धारक उच्च झुकाव कोण पर बीम ब्लॉक होगा । दूसरे झुकाव श्रृंखला इकट्ठा करने के लिए, नमूना धारक ९० ° घुमाएं । एक नया एटलस प्राप्त । इसी स्थिति का चयन करें और प्रत्येक लक्ष्य के लिए अक्ष-B पर झुकाव श्रृंखला प्राप्त ।नोट: अंय सॉफ़्टवेयर पैकेज, जैसे SerialEM और Xplore3D, स्वत: डेटा संग्रह के लिए उपलब्ध हैं । 5.3 डी Tomograms और खंड उप-संस्करणों का उपयोग सॉफ्टवेयर का पुनर्निर्माण IMOD सॉफ्टवेयर11का उपयोग कर दोहरे अक्ष झुकाव छवियों के tomograms पुनर्निर्माण. कार्रवाई विवरण के लिए उपयोगकर्ता मैंयुअल का संदर्भ लें । सोने फिड्यूशियल मार्करों के पदों द्वारा व्यक्तिगत झुकाव श्रृंखला संरेखित करें । tomograms या तो वापस प्रक्षेपण विधि द्वारा या दोनों अक्ष-A और अक्ष-B के लिए एक साथ चलने पुनर्निर्माण तकनीक (SIRT) विधि द्वारा, क्रमशः (चित्र 3) का पुनर्निर्माण । अक्ष के tomograms-a और अक्ष-B का मिश्रण एक डबल झुकाव कम लापता कील विरूपण साक्ष्य के साथ स्कैन उत्पंन करने के लिए । एक साथ शामिल होने के धारावाहिक वर्गों के डबल झुकाव tomograms पूरे mitochondrion मात्रा को कवर पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए । मॉडल IMOD कार्यक्रम द्वारा धारावाहिक वर्गों के बीच अंतराल । वॉल्यूम फॉल्ट के लिए एक वांछित आकार के लिए कट्टे tomograms और बिन ट्रिम कर दीजिए । 3 डी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर जुड़े धारावाहिक tomograms विश्लेषण. कार्रवाई विवरण के लिए उपयोगकर्ता मैंयुअल का संदर्भ लें । सुविधाओं के कंट्रास्ट को बेहतर बनाने और बैकग्राउंड घनत्व को कम करने के लिए गाऊसी फ़िल्टर (या अन्य इच्छित विधि) के साथ tomograms को फ़िल्टर करें. खंड mitochondria के ultrastructure या तो मैंयुअल रूप से या स्वचालित रूप से । 3d में निरीक्षण की अनुमति देने के लिए सेगमेंटेशन मॉडल प्रदर्शित करें. 3d में उपलब्ध टूल का उपयोग करके फिल्में जेनरेट करें.

Representative Results

हम अपने ऊर्जावान राज्य और उंर बढ़ने को दर्शाता है कि mitochondrial cristae की संरचनात्मक सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए धारावाहिक खंड इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी लागू किया । हमें पता चला है कि mitochondria के Drosophila IFM एक एकीकृत cristae और 3 डी में मैट्रिक्स नेटवर्क (चित्रा 4)7फार्म । इसके अलावा, उत्परिवर्ती मक्खियों mitochondrial डीएनए प्रतिकृति दोष के साथ और एक त्वरित उंर बढ़ने phenotype संचित mitochondria कि प्याज की उपधाराओं समाहित-घूमता कोर की तरह (चित्रा 5)7। चित्रा 1: एक झुकाव श्रृंखला से इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी पुनर्निर्माण का चित्रण । प्रयोग में, एक इलेक्ट्रॉन बीम एक 3 डी वस्तु के माध्यम से पारित कर दिया है के रूप में वस्तु विभिंन डिग्री के लिए झुका है । प्रत्येक झुकाव शर्त के लिए, एक 2d प्रक्षेपण उत्पंन और एक कैमरे के साथ कब्जा कर लिया है । 2d अनुमानों को फिर से 3 डी केंद्रीय स्लाइस प्रमेय के आधार पर वस्तु पुनर्निर्माण का अनुमान है । चित्रण में, एक ही प्रक्रिया एक मूल 2d छवि है कि विभिंन झुकाव कोण के तहत एक एकल आयाम में पेश है के लिए दिखाया गया है । 1 डी अनुमानों तो 2d छवि को फिर से संगठित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्र 2: स्वचालित डेटा संग्रह. सॉफ्टवेयर के एक छवि दर्शक प्रदर्शन एक स्लॉट धारावाहिक वर्गों, बहु mitochondria के पैमाने पर लक्ष्यीकरण युक्त ग्रिड के एटलस दिखा रहा है और झुकाव छवियों को हासिल कर लिया । स्केल बार = ५०० µm (बाएं शीर्ष पैनल), १०० µm (बाएं नीचे पैनल), 1 µm (दायां पैनल) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 3: Drosophila अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी में एक एकल mitochondrion के सीरियल खंड इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी । (a) 2d माइक्रोग्राफ और (B) एक mitochondrion की संपूर्ण मात्रा को कवर करने वाले धारावाहिक अनुभागों से 3d tomograms. (ग) कट्टे किए गए धारावाहिक-खंड tomograms को अनुदैर्ध्य सेक्शन बनाने का अनुमान है, जिसमें जेड-अक्ष खड़ी दिखाई जाती है । विशेष रूप से, ऊतक सामग्री के नुकसान के लिए नेतृत्व में, कट्टे tomograms के बीच अंतराल छोड़ने. स्केल बार = ५०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 4: एकीकृत इंट्रा-mitochondria cristae और मैट्रिक्स नेटवर्क 3 डी में पता चला. (क) mitochondrial इलेक्ट्रॉन tomographic पुनर्निर्माण के स्लाइस z-अक्ष के माध्यम से lamellar झिल्ली के बीच स्विच दिखा । (ख) मनाया cristae के चित्र सही हाथ के स्विचन पैटर्न और/या बाएं हाथ बढ़ता है । (ग) Tomographic फॉल्ट 3 डी (डी) में एक बाएं हाथ सर्पिल चित्रण Cristae स्विचन पैटर्न और विश्लेषण किया गया रंग-विभाजन मॉडल (ई, एफपर गाया) । Tomographic टुकड़ा दिखा पार्श्व मैट्रिक्स प्रवाह (डार्क घनत्व, लाल चिह्नित) cristae झिल्ली (सफेद घनत्व) के पार । (छ) में स्कैन के विभाजन मॉडल (ई) में पार्श्व मैट्रिक्स प्रदर्शित (लाल) और प्रतिनिधि cristae (ग्रे में) दिखा । स्केल बार = ५० एनएम (ए), २०० एनएम (सी), और ३०० एनएम (डी, ई, एफ, जी) । यह आंकड़ा जियांग एट अल से पुनर्मुद्रण का था । 7 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 5: प्याज के साथ Mitochondria-mitochondrial डीएनए प्रतिकृति उंर बढ़ने के दौरान दोष के साथ मक्खियों में संचित घूमता कोर की तरह । प्रतिनिधि tomographic स्लाइसें और इसी विभाजन (सही पैनलों) एक पार अनुभागीय दृश्य (ऊपर) और एक घूमता हुआ कोर के एक अनुदैर्ध्य-अनुभाग दृश्य (नीचे) दिखा । वॉल्यूम फॉल्ट घूमता हुआ कोर को हाइलाइट करने के लिए मनमाने रंग रेंडरिंग द्वारा इंगित किया गया है । स्केल बार: २०० एनएम । यह आंकड़ा जियांग एट अल से पुनर्मुद्रण का था । 7 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । कदम temp समय समाधान 1 -१४० ° c करने के लिए-9 0 ° c 30 min तरल नाइट्रोजन 2 -९० ° c ९६ hr एफएस कॉकटेल 3 -९० डिग्री सेल्सियस से-६० ° c 6 hr (5 ° c/ एफएस कॉकटेल 4 -६० ° c 12 hr एफएस कॉकटेल 5 -६० डिग्री सेल्सियस से-25 ° c 7 hr (5 ° c/ एफएस कॉकटेल 6 -25 डिग्री सेल्सियस 12 hr एफएस कॉकटेल 7 -25 ° c से 0 ° c 5 hr (5 ° c/ एफएस कॉकटेल 8 0 ° c 1 hr x 3 बार एसीटोन 9 कक्ष temp राल घुसपैठ तालिका 1: फ़्रीज़-प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम Drosophila अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी के 3d mitochondrial ultrastructure का अध्ययन करने के लिए धारावाहिक-खंड इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी लागू करने के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह का वर्णन । नमूने में ultrastructure के संरक्षण के विश्लेषण के इस प्रकार के लिए प्राथमिक तकनीकी चुनौती है । आदेश में सबसे अच्छा ultrastructure के संरक्षण के लिए दो methodological कदम शामिल थे । सबसे पहले, ऊतक के रूप में संभव के रूप में ज्यादा ऊतक वास्तुकला को बनाए रखने के लिए ब्लेड microtome हिल के साथ खोदी द्वारा नमूना था । दूसरा, एक HPF/FS प्रोटोकॉल एंबेडेड नमूना ब्लॉकों की तैयारी के दौरान organelle ultrastructure को संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया गया था । नमूनों उच्च दबाव है, जो पानी की ठंड बिंदु को कम करती है और बर्फ क्रिस्टल के गठन कि नुकसान ultrastructure¹कम कर देता है के तहत जमे हुए थे । ०.१ mm के रूप में मोटी नमूनों तुरंत vitrified जा सकता है, और फिर प्रतिस्थापन फ्रीज करने के लिए उंहें विश्लेषण के लिए नमूना ब्लॉकों उत्पंन अधीन । HPF/एफएस द्वारा ultrastructure के सुधार संरक्षण, रासायनिक निर्धारण के तरीकों की तुलना में जब उल्लेख किया गया था । नमूना तैयारी, mitochondrial डबल झिल्ली और cristae झिल्ली के संरक्षण के लिए कदम की इस श्रृंखला का उपयोग नाटकीय रूप से सुधार हुआ था ।

नमूना के धारावाहिक वर्गों प्राप्त करने के लिए विधि का सबसे चुनौतीपूर्ण कदम है । के रूप में इलेक्ट्रॉन बीम सीमित पैठ शक्ति है, खंड की मोटाई या तो २५० एनएम या ५०० एनएम २०० केवी या ३०० केवी, क्रमशः में एक उनि ऑपरेटिंग प्रयोग का उपयोग करने के लिए प्रतिबंधित है । एक mitochondrion की मोटाई से अधिक 2 µm हो सकता है, क्योंकि सीरियल अनुभागों पूर्ण वॉल्यूम reकंस्ट्रक्शन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । हालांकि, एक पूरे organelle अवधि के लिए धारावाहिक वर्गों की एक पर्याप्त संख्या ठीक एक तकनीकी चुनौती है । ब्लॉक चेहरा ट्रिमिंग चतुर्भुज के ठिकानों के बीच संभव के रूप में फ्लैट के रूप में हो सकता है एक स्लॉट ग्रिड अधिक वर्गों को समायोजित करने के लिए अनुमति देते हैं और इस प्रकार बड़ी मात्रा को कवर कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, पतले वर्गों के लिए एक परिपूर्ण पाश का उपयोग धारावाहिक वर्गों ग्रिड को स्थानांतरित करने की सफलता की दर बढ़ जाती है.

धारावाहिक खंड इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी मानक EM कोर उपकरणों के साथ पूरा किया जा सकता है । हालांकि, विधि कुछ अपरिहार्य सीमाएं है कि तकनीकी बाधाओं से उत्पंन होता है । एक यह है कि सामग्री अनिवार्य रूप से धारावाहिक वर्गों के बीच खो दिया है, शामिल पुनर्निर्माण में अंतराल जा रहा है । दूसरा लापता कील विरूपण साक्ष्य है, जो सीमित झुकाव कोण है कि प्राप्त कर रहे है के कारण उठता है । यह प्रतिबंध इसलिए होता है क्योंकि नमूना धारक इलेक्ट्रॉन बीम को अवरुद्ध किए बिना एक पूर्ण रोटेशन में नहीं दिया जा सकता. इन सीमाओं के बावजूद, धारावाहिक खंड इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 3 डी में सेलुलर और organelle ultrastructure प्रकट करने के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान करता है ।

छोटे स्केल इमेजिंग के लिए, क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी एक उभरती हुई तकनीक है जिसका उपयोग उप-tomographic के संयोजन में एनएम या उप-angstrom संकल्प पर सीटू में macromolecular परिसरों और सभाओं की संरचना प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है । पुनर्निर्माण³। इस आवेदन में, कोशिकाओं को खंड या तरल नाइट्रोजन के तहत मिलिंग आयन बीम को ध्यान केंद्रित करके thinned रहे हैं । tomograms क्रायो-शर्तों के तहत एकत्र कर रहे हैं, जहां आणविक संरचनाओं रासायनिक निर्धारण, निर्जलीकरण, या embedding बिना देशी राज्य के करीब संरक्षित कर रहे हैं । पैमाने के दूसरे छोर पर, संकल्प की कीमत पर बड़े ऊतक संस्करणों का विश्लेषण करने के लिए, सीरियल ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक अपील मोडल है, भले ही यह एक विशिष्ट साधन⁴की आवश्यकता है ।

Materials

vibrating blade microtome	Leica	VT1200S	Tissue sectioning
high-pressure freezer	Leica	EM HPM100	Specimen preparation
freeze-substitution device	Leica	EM AFS2	Specimen preparation
ultramicrotome	Leica	EM UC7	Ultra-thin sectioning
dual-axis tomography holder	Fischione	Model 2040	tomography collection
transmission electron microscope	FEI	Tecnai F20	tomography collection
CCD	Gatan	UltraScan 1000	tomography collection
Leginon	NRAMM/AMI		tomography collection
IMOD	Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells		Tomography reconstruction
Avizo 3D	FEI		Tomography analysis