I detta protokoll visar vi tillämpningen av följetong-avsnitt elektron datortomografi att belysa mitokondriell struktur i Drosophila indirekta flyg muskel.
Mitokondrierna är cellernas kraftcentrumen som producerar ATP, lipider och metaboliter, samt reglera kalcium homeostasen och cell död. Den unika cristae-rika dubbla membran ultrastruktur av denna organell arrangeras elegant att utföra flera funktioner genom partitionering biomolekyler. Mitokondriell ultrastruktur är intimt knuten med olika funktioner; fina detaljer av dessa struktur-funktionssamband är dock bara början ska beskrivas. Här visar vi tillämpningen av följetong-avsnitt elektron datortomografi att belysa mitokondriell struktur i Drosophila indirekta flyg muskel. Följetong-avsnitt elektron tomografi kan anpassas att studera någon cellulära struktur i tre dimensioner.
Elektronmikroskopi är ett värdefullt verktyg att studera strukturella ramen för subcellulär församlingar och organeller som utför cellulära processer. Metoder har utvecklats för att bevara ultrastruktur av vävnader eller celler antingen genom kemiska fixering med aldehydes eller av högt tryck frysning (HPF) följt av frysa substitution (FS)1,2. De inbäddade Preparatsegment får sedan vara sektioneras, målat och observerade med ett transmissionselektronmikroskop (TEM). HPF preparatet kunde också bearbetas cryo-villkor, såsom cryo-snittning eller genom fokuserad ion beam (FIB) fräsning och observeras av cryo-EM3,4.
Tunn-avsnitt EM ger informativa morfologiska insikter, kan de resulterande 2D-bilderna endast avslöja ultrastruktur med en viss tvärsnitt. Hur ultrastruktur är organiserad i en 3D-volym fortfarande skyms. För att visualisera cellulära ultrastruktur i tre dimensioner, utvecklades en elektron tomografi metoden där serie tilt bilder var förvärvat och tillbaka beräknas generera en tomografiska återuppbyggnad5 (figur 1). En dubbel tilt-serien kan samlas in genom roterande provet 90° och skaffa en andra tilt-serien. Detta minimerar saknas-wedge artefakter som leder från begränsad provtagning vinklar och förbättrad upplösning av tomogram.
Här, beskriver vi tillämpningen av följetong-avsnitt elektron datortomografi att studera mitokondriell ultrastruktur Drosophila indirekta flyg muskel (IFM)6,7,8,9 . För att få 3D rekonstruktioner som täcker hela mitokondrier (cirka 2,5 µm tjock), erhölls seriell avsnitt från Drosophila IFM vävnad block. Tomograms av varje avsnitt samlades individuellt med automatisk data insamling programvara. Tomografiska rekonstruktioner genererades och seriell tomograms förenades med IMOD paketet att erhålla en rekonstruerad volym av en hela mitokondrie. De förenade tomograms analyserades av 3D-program. Tätheterna av mitokondriella cristae segmenterades för att generera en segmenteringsmodell som avslöjade organisationen i tre dimensioner.
I detta protokoll beskriver vi ett optimerat arbetsflöde för att tillämpa seriell-avsnitt elektron datortomografi för att studera 3D mitokondriell ultrastruktur Drosophila indirekta flyg muskler. Bevarandet av ultrastruktur i provet är den primära tekniska utmaningen för denna typ av analys. För att bäst bevara ultrastruktur två metodologiska ingick steg. Först, vävnad samplades av snittning med vibrerande blad mikrotomen för att upprätthålla den vävnad arkitekturen så mycket som möjligt. För det andra var ett HPF/FS protokoll optimerad för att bevara organell ultrastruktur under utarbetandet av inbäddade preparatsegment. Proverna frystes under högt tryck, som sänker fryspunkten för vatten och minskar bildandet av iskristaller som skada ultrastruktur1. Prover så tjock som 0,1 mm kan vara förglasad omedelbart, och sedan genomgå för att frysa substitution för att generera preparatsegment för EM analys. Förbättrad bevarandet av ultrastruktur av HPF/FS noterades, jämfört med kemisk fixering metoder. Med denna serie av steg för provberedning, förbättrades bevarandet av mitokondriell dubbla membran och cristae membran dramatiskt.
Erhålla seriell avsnitt av preparatet är det mest utmanande steget i metoden. Som elektronstrålen har begränsad penetration makt, tjockleken på avsnittet är begränsade till antingen 250 nm eller 500 nm med en TEM på 200 kV eller 300 kV, respektive. Eftersom tjockleken av en mitokondrie kan vara mer än 2 µm, krävs seriell avsnitt för att få full volym rekonstruktioner. Men är att återställa ett tillräckligt antal seriella sektioner att spänna en hela organell en teknisk utmaning. Trimma block ansiktet för att vara så platt som möjligt mellan baserna av trapezoiden kan tillåta ett slot-rutnät för att rymma fler sektioner och därmed täcka större volymer. Dessutom ökar använder en perfekt slinga för tunnslip andelen framgångsrika överföra seriell avsnitten till rutnätet.
Följetong-avsnitt elektron tomografi kan åstadkommas med EM core standardutrustning. Metoden har dock vissa oundvikliga begränsningar som uppstår från tekniska begränsningar. En är att materialet är oundvikligen förlorade mellan seriell avsnitt, lämnar luckor i Förenade återuppbyggnaden. Andra är saknas kil artefakt, som uppstår på grund av de begränsade lutningsvinklar som kan uppnås. Denna begränsning beror på preparathållaren inte kan stängas i ett helt varv utan att blockera elektronstrålen. Trots dessa begränsningar ger följetong-avsnitt elektron tomografi tillräcklig upplösning att avslöja mobilnät och organell ultrastruktur i 3D.
För mindre skala imaging är cryo-elektron datortomografi en ny teknik som kan användas för att få strukturen av makromolekylära komplex och församlingar i situ nm eller sub Ångström upplösning i kombination med sub-tomografiska återuppbyggnad3. I det här programmet är celler tunnas genom snittning eller fokuserad ion beam fräsning under flytande kväve. Tomograms samlas cryo-villkor där molekylära strukturer bevaras nära infödda staten utan kemiska fixeringen, uttorkning eller inbäddning. I andra änden av skalan, för att analysera stora vävnad volymer på bekostnad av upplösning, är seriell block-face skanning elektronmikroskopi en tilltalande modalitet även om det kräver en särskild rättsakt4.
The authors have nothing to disclose.
Studierna utfördes i EM kärnan vid Institutet på cellnivå och organismnivå biologi och cryo-EM kärnan i Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Arbetet stöds av Academia Sinica och mest.
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |