L’obiettivo di questo studio era di valutare in vitro riduzione dei lipidi droga effetti nel modulare la morfologia delle particelle di colesterolo. Confronto di farmaci ipolipemizzanti rivelato variazioni nel loro effetto nel modulare le caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo.
Trattamento della dislipidemia pazienti con farmaci ipolipemizzanti conduce ad una riduzione significativa nel livello di lipoproteine a bassa densità (LDL) e un basso a moderato livello di aumento del colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) nel plasma. Tuttavia, un ruolo possibile di questi farmaci nell’alterare la morfologia e distribuzione delle particelle di colesterolo è capito male. Qui, descriviamo la valutazione in vitro di effetti di farmaci ipolipemizzanti nel modulare le caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo utilizzando il metodo di matrice della placca in combinazione con imaging citometria a flusso. Analisi di immagine delle particelle di colesterolo hanno indicato che la lovastatina, simvastatina ezetimibe e atorvastatina inducono la formazione di particelle a forma di filo lineare e globulare, mentre niacina, fibrati, fluvastatina e rosuvastatina indurre il Formazione di particelle solo a forma globulare. Successiva, molto purificata lipoproteina a bassa densità (VLDL) e particelle di LDL incubate con queste droghe hanno mostrato i cambiamenti nella morfologia e immagine texture di colesterolo sottopopolazioni di particelle. Inoltre, la selezione di 50 campioni di siero ha rivelato la presenza di un livello superiore di lineare a forma particelle di colesterolo di HDL nei soggetti con dislipidemia (media del 18,3%) rispetto ai campioni normali di pari età (una media di 11,1%). Abbiamo anche osservato variazioni considerevoli in effetti ipolipemizzanti di droga sulla riduzione lineare a forma di formazione di particelle colesterolo LDL e HDL in campioni di siero. Questi risultati indicano che farmaci ipolipemizzanti, oltre ai loro effetti ipolipidici cellulo-mediata, direttamente possono modulare la morfologia delle particelle di colesterolo da un meccanismo non-enzimatica dell’azione. I risultati di questi risultati hanno potenziale per informare la diagnosi di aterosclerosi e prevedere la terapia ottimale di riduzione dei lipidi.
Numerosi studi clinici hanno dimostrato gli effetti benefici dei farmaci ipolipemizzanti nella riduzione dei livelli plasmatici di colesterolo lipoproteine a bassa densità (LDL) e un basso a moderato livello di aumento del colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL), che previene le incidenze di primarie e secondarie di eventi cardiovascolari avversi correlati aterosclerosi1,2,3,4,5. Le statine, un gruppo di inibitori di HMG-CoA reduttasi enzima, bloccano la sintesi di colesterolo endogeno nel fegato che a sua volta portare ad abbassare livelli circolanti di colesterolo LDL nel sangue6,7. Allo stesso modo, l’effetto di niacina ipolipemizzanti sono mediato da sua inibizione diretta e non competitivo dell’epatocita diacilglicerolo aciltransferasi-2, un enzima del fegato chiave coinvolti nella sintesi di trigliceride8. Comparativamente, ezetimibe riduce il livello del plasma di LDL limitando l’assorbimento del colesterolo esogeno legandosi alla proteina Niemann-Pick C1 1 (NPC1L1) si trova nelle cellule epiteliali del piccolo intestino9. Fenofibrato, un’altra droga di riduzione dei lipidi, riduce sostanzialmente le concentrazioni plasmatiche di trigliceridi e anche moderatamente fa diminuire il colesterolo LDL attraverso le via di recettori proliferator-attivato peroxisome10. Inoltre, acido grasso omega-3 è segnalato per avere l’effetto anti-aterosclerotica grazie alla sua capacità di abbassare i livelli plasmatici di LDL11.
I farmaci ipolipemizzanti, oltre al loro effetto primario sull’abbassamento del colesterolo LDL, hanno un numero di effetti pleiotropici benefici tra cui potenziare il livello di HDL, miglioramento delle funzioni endoteliali, riducendo l’infiammazione e d’inibizione della piastrina le aggregazioni12,13,14. Tuttavia, il meccanismo di fondo di queste droghe in aumento le particelle del colesterolo di HDL e modificare le loro funzioni strutturali non sono completamente capito. Poiché questi farmaci sono ampiamente prescritti per trattare malattie cardiovascolari aterosclerosi (CPV), è essenziale per analizzare ulteriormente il loro possibile ruolo nel determinare le caratteristiche morfologiche e distribuzione delle particelle lipidiche. Il lipidome di plasma umano è costituito da circa 600 lipidi distinti e 22 tipi diversi di molecolari di colesterolo che sono presenti in varie dimensioni, forme, densità e composizioni15,16,17 . Metodi analitici come ultra-centrifugazione, NMR ed elettroforesi del gel di pendenza sono utilizzati per caratterizzare le particelle di LDL e HDL e loro subfractions18,19. Tuttavia, applicazione di questi metodi è limitata agli studi volti a determinare l’effetto delle droghe nel modulare la morfologia e l’assemblaggio delle particelle del lipido. La matrice di base placca citometro a flusso è un’analisi biochimica funzionale sviluppato per rilevazione e visualizzazione del siero derivato del lipido e amiloide placca particelle20. I vantaggi di in vitro metodo descritto in questo studio di imaging consentono l’identificazione del lipido-modulazione degli effetti della droga nell’alterare la morfologia e distribuzione delle particelle di colesterolo in campioni di siero e buffer.
In generale, la distribuzione e le proprietà funzionali delle particelle di colesterolo VLDL, LDL e HDL nella circolazione sanguigna sono determinata principalmente dal metaboliche, genetiche, epidemiologici, cellulari e al plasma fattori22,23. Nello studio presente, esaminando gli effetti di dimodificazione farmaci nel buffer ha rivelato che altamente lipofiliche droghe quali ezetimibe, lovastatina, simvastatina e atorvastatina ha indotto un più elevato livello di complessità sulla morfologia delle particelle di colesterolo confrontato all’effetto di livello inferiore osservato con farmaci altamente idrofili di rosuvastatina e fluvastatina. Questi risultati sono in buon accordo con il nostro studio precedente che descrive un meccanismo non-enzimatica basato effetto delle statine nella modulazione della formazione di particelle colesterolo LDL e HDL nel buffer e siero campioni21. Di conseguenza, i risultati dallo studio presente ha rivelato un non-enzimatica meccanismo d’azione di ezetimibe, niacina, fibrata e farmaci di acido grasso omega-3 che possono svolgere un ruolo diretto nella formazione di particelle del colesterolo di modulazione. È possibile che le interazioni tra farmaci e aggregati di colesterolo conduce all’Assemblea delle particelle di colesterolo di grandi dimensioni che sono 2-60 µm2, esibendo morfologie globulare e lineare del filo.
Inoltre, i risultati ottenuti utilizzando particelle della lipoproteina purificata indicano interazioni tra aggregati di colesterolo e di fattori plasmatici tra cui proteine VLDL, LDL e HDL che possono alterare le composizioni e le proprietà morfologiche del colesterolo particelle. I risultati di trattamento della droga che coinvolgono particelle della lipoproteina purificata ha indicato un effetto di droga livello superiore su formazione di particelle di VLDL rispetto al loro effetto osservato su formazione di particelle del colesterolo di LDL. La lovastatina e simvastatina ezetimibe droghe sono state usate come pro-farmaci e loro dosi nei saggi possono essere superiori a concentrazioni fisiologiche.
Interessante, lo screening di campioni di siero hanno mostrati le variazioni dell’effetto della droga su alterare i profili di formazione di particelle di colesterolo VLDL, LDL e HDL, particolarmente il loro effetto sulle formazioni di lineare a forma di particelle di LDL e HDL. Queste droghe ha indotto riduzione il lineare a forma di formazione di particelle colesterolo LDL e HDL in dislipidemia e campioni di siero normali di pari età. Gli effetti di droga osservati sulla riduzione della formazione di particelle a forma lineare era più alta in ezetimibe, simvastatina, lovastatina e la niacina. L’identificazione di particelle di colesterolo con morfologie globulare e lineare del filo in campioni di siero normale e dislipidemia suggerisce che particelle con morfologie simili possono formare in condizioni in vivo . Precedenti studi hanno identificato la presenza del disco e cristalli aghiformi di colesterolo nelle placche aterosclerotiche di umani e ApoE– / – e LDLR– / – topi modelli24,25,26 ,27,28.
Le particelle di HDL circolanti nel sangue esistano come una miscela eterogenea e il livello di particelle di HDL di piccole e grandi dimensioni con attività funzionale sono fattori importanti per esercitare il loro effetto cardio-protettivo tramite il trasporto inverso del colesterolo Via29,30. Recenti studi hanno evidenziato l’importanza dell’identificazione subfractions di particelle di HDL colesterolo per chiarire il loro ruolo nelle funzioni biologiche quali efflusso di colesterolo, anti-infiammatorio, anti-trombotica e anti-ossidativo31 . Inoltre, una serie di studi hanno riferito l’effetto della terapia di riduzione dei lipidi nell’aumento di un livello basso per moderare il livello di HDL nel plasma1,5,21. Di conseguenza, i risultati da questo studio forniscono nuove intuizioni su caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo. In particolare, la rilevazione di un livello superiore di lineare a forma particelle di colesterolo di HDL nei campioni del siero di soggetti di dislipidemia suggerisce che essi possono essere il biomarcatore affidabile per la diagnosi e la valutazione degli effetti di dimodificazione farmaci nei pazienti. Tuttavia, ulteriore indagine è richiesta utilizzando grandi campioni clinici per capire meglio le particelle di colesterolo con morfologie distinte e la loro associazione di CVD.
Nell’analisi di matrice della placca per esaminare l’effetto della droga il montaggio delle particelle di colesterolo, abbiamo usato 2 µ g di fluorescenza etichettato come aggregati di colesterolo e 5 µgof ogni droga perché: (1) farmaci modo competitivo legano entrambi fluorescenza etichettato colesterolo e lipidi endogeni presenti nei campioni del siero; (2) da ciascun campione, abbiamo acquisito da 5.000 a 10.000 particelle di colesterolo che vengono assemblate in grandi dimensioni e forme che vanno da ~ 2-60 µ2; (3) abbiamo osservato un ampie variazioni di risposta ai farmaci tra i campioni di siero incubato con le droghe (dosi 300 ng a 5 µ g) e ~ 1-5% di loro incubate con dosi elevate ha mostrate nessun cambiamento rilevabile nel profilo della formazione di particelle di colesterolo; e (4) l’interazione tra gli aggregati di colesterolo e lipidi droga è mediata da un processo non enzimatico. Quindi, le concentrazioni dei reagenti utilizzati nel test possono essere superiore al loro livello fisiologico.
In conclusione, abbiamo dimostrato con successo i vantaggi di un in vitro imaging metodo descritto in questo studio per determinare l’effetto di un ampio spettro di farmaci ipolipemizzanti sulla modulazione morfologia e composizione del colesterolo particelle. L’approccio di visualizzare e quantificare la morfologia delle particelle lipidiche impiegando una costellazione di algoritmi di analisi di immagine può aiutare sia la diagnosi di aterosclerosi e di valutare i risultati della terapia di riduzione dei lipidi in pazienti.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato da una ricerca Plaxgen sovvenzione conferito alla SM (PLX-1008). Ringraziamo Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute per la raccolta di campioni di siero da soggetti di aterosclerosi sotto approvazione IRB.
TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
Human normal serum | Stanford Blood center | ||
LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
96-well microtitre plates | |||
Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |