Formålet med denne undersøgelse var at evaluere i vitro lipid-sænkende narkotika effekter i modulerende morfologi af kolesterol partikler. Sammenligning af lipid-sænkende stoffer viste variationer i deres virkning i modulerende de morfologiske træk af kolesterol partikler.
Behandling af dyslipidæmi patienter med lipid-sænkende stoffer fører til en betydelig reduktion i low-density lipoprotein (LDL) niveau og et lavt til moderat niveau stigning i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol i plasma. Dog er en mulig rolle for disse stoffer i at ændre morfologi og fordeling af kolesterol partikler dårligt forstået. Her beskriver vi in vitro- vurderingen af lipid-sænkende narkotika effekter i modulerende morfologiske træk af kolesterol partikler ved hjælp af metoden plaque array i kombination med imaging flowcytometri. Billede analyser af kolesterol partikler angivet at lovastatin, simvastatin, ezetimibe, og atorvastatin inducere dannelse af kugleformede og lineær strand-formede partikler, der henviser til, at niacin, fibrater, fluvastatin og rosuvastatin fremkalde den dannelsen af kun kugleformede-formet partikler. Næste, renset meget low-density lipoprotein (VLDL) og LDL partikler inkuberes med disse stoffer viste ændringer i kolesterol morfologi og image tekstur partikler delpopulationer. Derudover afslørede screening af 50 serumprøver tilstedeværelsen af en højere grad af lineære formet HDL kolesterol partikler i fag med dyslipidæmi (gennemsnit af 18,3%) i forhold til alder-matchede normal (gennemsnit af 11,1%) prøver. Vi bemærkede også betydelige variationer i lipid-sænkende narkotika virkninger på at reducere lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i serumprøver. Disse resultater viser, at lipid-sænkende medicin, ud over deres celle-medieret hypolipidemic effekter, direkte kan modulere morfologi af kolesterol partikler af en ikke-enzymatiske virkningsmekanisme. Resultaterne af disse resultater har potentiale til at informere diagnose af åreforkalkning og forudsige optimal lipid-sænkende behandling.
Talrige kliniske undersøgelser har påvist gavnlige virkninger af lipid-sænkende medicin til at reducere plasmaniveauer af low-density lipoprotein (LDL) kolesterol og en lav til moderat niveau stigning i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol, som forhindrer både primære og sekundære forekomster af åreforkalkning-relaterede negative kardiovaskulære hændelser1,2,3,4,5. Statiner, en gruppe af HMG-CoA reduktase enzym-hæmmere, blokere endogent kolesterol syntese i leveren, i tur fører til lavere cirkulerende niveauer af LDL kolesterol i blodet6,7. Ligeledes, den lipid sænkende effekt af niacin er medieret af sin direkte og noncompetitive hæmmer af hepatocyt diacylglycerol acyltransferase-2, en nøgle leverenzym involveret i triglycerid syntese8. Relativt, reducerer ezetimibe plasma niveau af LDL ved at begrænse absorption af eksogene kolesterol ved binding til Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) protein beliggende i epitelceller af tyndtarmen9. Fenofibrate, en anden lipid-sænkende medicin, reducerer betydeligt plasmakoncentrationer af triglycerider og også moderat mindsker LDL kolesterol gennem Peroxisom proliferator-aktiverede receptorer vej10. Desuden er omega-3 fedtsyrer rapporteret at have anti-aterosklerotisk virkning på grund af dens evne til at sænke plasmaniveauer af LDL11.
Lipid-sænkende medicin, ud over deres primære virkning på at sænke LDL-kolesterol, har en række gavnlige pleiotrope effekter, herunder øge HDL-niveau, forbedrer endotel funktioner, reducere inflammation og hæmme trombocyttal sammenlægninger12,13,14. Men, den underliggende mekanisme af disse stoffer for at øge HDL kolesterol partikler og ændre deres strukturelle træk er ikke fuldt forstået. Da disse lægemidler er almindeligt ordineret til behandling af åreforkalkning-relaterede hjerte-kar-sygdomme (lidelser), er det vigtigt for yderligere at undersøge deres mulige roller i fastsættelsen af morfologiske træk og distribution af lipid partikler. Humant plasma lipidome består af cirka 600 forskellige lipider og 22 forskellige molekylære former af cholesterols, der er til stede i forskellige størrelser, former, tætheder og kompositioner15,16,17 . Analytiske metoder såsom ultra-centrifugering, NMR og gradient gelelektroforese bruges til at karakterisere LDL og HDL partikler og deres subfractions18,19. Anvendelsen af disse metoder er dog begrænset til undersøgelser med henblik på bestemmelse af virkningen af lægemidler i modulerende morfologi og samling af lipid partikler. Flow Flowcytometret baseret plaque array er en funktionel biokemiske assay udviklet til påvisning og visualisering af serum fremstillet lipid og amyloid plaque partikler20. Fordele ved in vitro- imaging metoden i denne undersøgelse aktiverer identifikation af lipid-modulerende medicin effekter i at ændre morfologi og fordeling af kolesterol partikler i buffer og serum prøver.
I almindelighed, bestemmes distribution og funktionelle egenskaber af VLDL, LDL og HDL kolesterol partikler i blodcirkulationen hovedsagelig af metaboliske, genetiske, epidemiologiske, cellulære og plasma faktorer22,23. I den foreliggende undersøgelse, undersøge virkningerne af lipid-ændring narkotika i bufferen afslørede, at meget lipofile stoffer som ezetimibe, lovastatin, simvastatin og atorvastatin induceret en højere niveau kompleksitet på morfologi af kolesterol partikler i forhold til den lavere niveau effekt observeret med stærkt hydrofilt rosuvastatin og fluvastatin narkotika. Disse resultater er i god aftale med vores tidligere undersøgelse beskriver en ikke-enzymatisk mekanisme baseret effekt af statiner i modulerende LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i buffer og serum prøver21. I overensstemmelse hermed, resultaterne fra nærværende undersøgelse åbenbaret en ikke-enzymatiske virkningsmekanisme af ezetimibe, niacin, fibrate, og omega-3 fedtsyre lægemidler, der kan spille en direkte rolle i modulerende kolesterol partikler dannelse. Det er muligt, at samspillet mellem medicin og kolesterol aggregater fører til samling af store størrelse kolesterol partikler, der er 2-60 µm2, udstiller kugleformede og lineær strand morfologier.
Desuden foreslå resultaterne ved hjælp af renset lipoprotein partikler interaktioner mellem kolesterol aggregater og plasma faktorer herunder VLDL, LDL og HDL proteiner, der kan ændre kompositioner og morfologiske egenskaber af kolesterol partikler. Stof behandlingsresultater der involverer renset lipoprotein partikler viste et højere niveau stof effekt på VLDL partikler dannelse i forhold til deres effekt observeret på LDL kolesterol partikler dannelse. Lovastatin og simvastatin ezetimibe narkotika blev brugt som pro-stoffer og deres doser i assays kan være højere end de fysiologiske koncentrationer.
Interessant, formet screening af serumprøver viste variationer af narkotikamisbrug effekt på at ændre profiler af VLDL, LDL og HDL kolesterol partikler dannelse, især deres indvirkning på formationer af lineære LDL og HDL partikler. Disse stoffer induceret reduktion på lineære formet LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i både dyslipidæmi og alder-matchede normale serumprøver. Narkotika effekter observeret på at reducere lineær formede partikler dannelse var højere i simvastatin, ezetimibe, lovastatin og niacin. Identifikation af kolesterol partikler med kugleformede og lineær strand morfologier i serumprøver normal og dyslipidæmi tyder på, at partikler med lignende morfologier kan danne i vivo betingelser. Tidligere undersøgelser har identificeret tilstedeværelsen af disken og nål-lignende kolesterol krystaller i de aterosklerotiske plaques af menneskelige og ApoE– /- og LDLR– / – mus modeller24,25,26 ,27,28.
HDL partikler cirkulerer i blodet findes som en heterogen blanding og niveauet af små og store størrelse HDL partikler sammen med funktionelle aktivitet er vigtige faktorer til at udøve deres cardio-beskyttende virkning via reverse kolesterol transport vej29,30. Nylige undersøgelser har fremhævet betydningen af at identificere HDL kolesterol partikel subfractions for belyse deres rolle i flere biologiske funktioner såsom cholesterol efflux, anti-betændelse, anti-trombotiske og anti-oxidative31 . Derudover har en række undersøgelser rapporteret effekten af lipid-sænkende behandling i stigende en lav til moderat niveau af HDL i plasma1,5,21. I overensstemmelse hermed, resultaterne fra denne undersøgelse giver ny indsigt om morfologiske træk af kolesterol partikler. Navnlig, påvisning af en højere grad af lineære formet HDL kolesterol partikler i serumprøver af dyslipidæmi fag tyder på, at de kan være den pålidelige biomarkør for både diagnose og evaluere virkningerne af lipid-ændring narkotika i patienter. Imidlertid yderligere er undersøgelse påkrævet ved brug af store klinisk prøver til bedre for at forstå kolesterol partiklerne med forskellige morfologier og deres tilknytning til CVD.
I plaque array analyse for at undersøge effekten stof på montering af kolesterol partikler, vi brugte 2 µg af fluorescens mærket kolesterol aggregater og 5 µgof hver enkelt drug fordi: (1) stoffer konkurrencedygtige binde til begge fluorescens mærket kolesterol og endogene lipider i serumprøver; (2) fra hver prøve erhvervet vi 5.000 til 10.000 kolesterol partikler, der er samlet i store størrelser og former fra ~ 2-60 µ2; (3) vi observeret en bred variationer af narkotika svar blandt serumprøver inkuberes med narkotika (doser 300 ng til 5 µg) og ~ 1-5% af dem inkuberes med høje doser viste ingen påviselige ændringer i profilen for kolesterol partikler dannelse; og (4) samspillet mellem kolesterol aggregater og lipid-sænkende stoffer er medieret af en ikke-enzymatisk proces. Koncentrationerne af de reagenser, der anvendes i analysen kan derfor være højere end deres fysiologiske niveau.
Afslutningsvis har vi med succes demonstreret fordele ved en in vitro- imaging metoden i denne undersøgelse til bestemmelse af effekten af et bredt spektrum af lipid-sænkende stoffer på modulerende morfologi og sammensætning af kolesterol partikler. Visualisere og kvantificere morfologi af lipid partikler ved at ansætte en konstellation af billede analyse algoritmer fremgangsmåde kan hjælpe både diagnosen af åreforkalkning og evaluere resultaterne af lipid-sænkende behandling hos patienter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af en Plaxgen forskning tilskud tildeles SM (PLX-1008). Vi takker Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute for indsamling serumprøver fra åreforkalkning emner under IRB godkendelse.
TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
Human normal serum | Stanford Blood center | ||
LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
96-well microtitre plates | |||
Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |