Het doel van deze studie was om te evalueren in vitro lipide-verlagende drug effecten bij het moduleren van de morfologie van cholesterol deeltjes. Vergelijking van lipide-verlagende geneesmiddelen toonde variaties in hun effect bij het moduleren van de morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes.
Behandeling van dyslipidemia patiënten met lipide-verlagende medicijnen leidt tot een aanzienlijke vermindering van low-density lipoproteins (LDL) niveau en een lage tot matige hoeveelheid toename van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol in plasma. Een mogelijke rol van deze drugs veranderen morfologie en verdeling van de deeltjes van cholesterol is echter slecht begrepen. Hier beschrijven we de evaluatie in vitro van lipide-verlagende drug effecten bij het moduleren van de morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes met de plaque matrix methode in combinatie met stroom cytometry imaging. Beeld analyses van de deeltjes die cholesterol aangegeven dat Lovastatine, simvastatine en ezetimibe Atorvastatine de vorming van zowel lineaire als bolvormige strand-vormige deeltjes veroorzaken, overwegende dat niacine, fibrates en Fluvastatine Rosuvastatine veroorzaken de vorming van alleen bolvormige-vormige deeltjes. Volgende, gezuiverde zeer low-density lipoprotein (VLDL) en LDL deeltjes geïncubeerd met deze drugs toonde veranderingen in de morfologie en afbeelding textuur van cholesterol deeltjes subpopulaties. Bovendien, screening van 50 serummonsters bleek de aanwezigheid van een hoger niveau van lineaire gevormde HDL cholesterol deeltjes bij patiënten met dyslipidemia (gemiddelde van 18,3%) in vergelijking met de normale leeftijd-matched (gemiddelde van 11,1%) monsters. Wij merkte tevens aanzienlijke verschillen in lipide-verlagende drug effecten op het verminderen van lineaire LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in serummonsters gevormd. Deze bevindingen wijzen erop dat lipide-verlagende geneesmiddelen, naast de cel-gemedieerde hypolipidemic gevolgen ervan, rechtstreeks morfologie van cholesterol deeltjes door een niet-enzymatische mechanisme van actie moduleren kunnen. De resultaten van deze resultaten hebben potentieel te informeren van de diagnose van atherosclerose en voorspellen van optimale lipide-verlagende therapie.
Talrijke klinische studies hebben aangetoond dat gunstige effecten van de lipide-verlagende geneesmiddelen bij het verminderen van plasma niveaus van low-density lipoproteins (LDL) cholesterol en een lage tot matige hoeveelheid toename van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol, die Hiermee voorkomt u dat zowel primaire als secundaire gevallen van atherosclerose-nadelige cardiovasculaire gebeurtenissen1,2,3,4,5. Statines, een groep van HMG-CoA reductase enzym remmers, blokkeren endogene cholesterol synthese in de lever dat in beurt leiden tot lagere niveau van LDL-cholesterol in het bloed6,7 circulerende. Evenzo is de lipide verlagen effect van niacine gemedieerd door zijn directe en concurrerend remming van de hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, een belangrijke leverenzym triglyceride synthese8deelnemen. Betrekkelijk, vermindert ezetimibe plasma niveau van LDL door absorptie van exogene cholesterol door binding aan eiwitten van Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) gelegen in de epitheliale cellen van de dunne darm9te beperken. Fenofibraat, een andere lipide-verlagende drug, aanzienlijk vermindert de plasmaconcentraties van triglyceriden en vermindert ook matig LDL cholesterol via de peroxisome proliferator-geactiveerde receptoren traject10. Bovendien, omega-3 vetzuur is gemeld dat het anti-atherosclerotische effect vanwege haar vermogen om lagere niveaus van het plasma van LDL11.
De lipide-verlagende geneesmiddelen, naast hun primaire effect op het verlagen van LDL cholesterol, hebben een aantal gunstige pleiotropic effecten, met inbegrip van de verbetering van het HDL-niveau, verbetering van endothelial functies, vermindering van ontsteking en remming van de bloedplaatjes aggregaties12,13,14. Het onderliggende mechanisme van deze drugs in de verhoging van HDL cholesterol deeltjes en wijzigen hun structurele kenmerken zijn echter niet volledig begrepen. Aangezien deze geneesmiddelen zijn algemeen voorgeschreven voor de behandeling van atherosclerose-gerelateerde cardiovasculaire aandoeningen (CVDs), is het essentieel om hun mogelijke rol bij het bepalen van de morfologische kenmerken en verdeling van de deeltjes lipide verder te onderzoeken. De menselijk plasma lipidome bestaat uit ongeveer 600 verschillende lipiden en 22 verschillende moleculaire soorten cholesterols die aanwezig in verschillende maten, vormen, densiteiten en composities15,16,17 zijn . Analytische methoden zoals ultra-centrifugeren en NMR gradiënt gelelektroforese worden gebruikt voor het karakteriseren van de LDL en HDL-deeltjes en hun subfractions18,19. Toepassing van deze methoden is echter beperkt tot studies gericht op het vaststellen van het effect van drugs bij het moduleren van de morfologie en de assemblage van de lipide-deeltjes. De stroom cytometer gebaseerde plaque array is een functionele biochemische assay ontwikkeld voor detectie en visualisatie van serum verkregen lipide en amyloid plaque deeltjes20. De voordelen van in vitro imaging in deze studie beschreven methode inschakelen identificatie van lipide-modulerende effecten van de drug in het veranderen van de morfologie en de verdeling van de deeltjes van de cholesterol in buffer en serum monsters.
In het algemeen, worden de distributie en de functionele eigenschappen van VLDL, LDL en HDL cholesterol deeltjes in de bloedsomloop voornamelijk bepaald door metabole, genetische, epidemiologische, mobiele en plasma factoren22,23. In de huidige studie, onderzoek naar de effecten van het lipide-aanpassen drugs in de buffer is gebleken dat zeer lipofiele geneesmiddelen zoals ezetimibe, simvastatine, Lovastatine en Atorvastatine een hogere niveau complexiteit op de morfologie van cholesterol deeltjes veroorzaakte vergeleken met het lagere niveau effect waargenomen met zeer hydrofiele Rosuvastatine en Fluvastatine drugs. Deze resultaten zijn in goede overeenstemming met onze eerdere studie met een beschrijving van een niet-enzymatische mechanisme gebaseerd effect van statines bij het moduleren van de LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in de buffer en serum monsters21. Dienovereenkomstig, de resultaten van de huidige studie bleek een niet-enzymatische werkingsmechanisme van ezetimibe, niacine, fibrate, en omega-3 vetzuur drugs die een directe rol bij het moduleren van de vorming van cholesterol deeltjes kunnen spelen. Het is mogelijk dat de interacties tussen geneesmiddelen en cholesterol aggregaten leidt tot de vergadering van groot formaat cholesterol deeltjes die groter zijn 2-60 µm2, bolvormige en lineaire strand morphologies exposeren.
Bovendien, suggereren de resultaten verkregen met behulp van gezuiverde lipoproteïne deeltjes interacties tussen cholesterol aggregaten en plasma factoren zoals VLDL, LDL en HDL eiwitten die de composities en morfologische eigenschappen van de cholesterol veranderen kunnen deeltjes. De drug behandelingsresultaten met gezuiverde lipoproteïne deeltjes aangegeven een hoger niveau drug effect op VLDL-deeltjes vorming in vergelijking met hun effect waargenomen op LDL cholesterol deeltjes vorming. De Lovastatine, simvastatine en ezetimibe drugs werden gebruikt als pro-drugs en hun doses bij de testen mag hoger zijn dan de fysiologische concentraties.
Interessant, vormige screening van serummonsters toonde variaties van drug effect op het veranderen van de profielen van VLDL, LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming, met name hun effect op de formaties van lineaire LDL en HDL-deeltjes. Deze drugs geïnduceerde korting op lineaire LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in zowel dyslipidemia als leeftijd-matched normale serummonsters gevormd. De effecten van de drug waargenomen op het verminderen van lineaire gevormde deeltjes formatie was hoger in ezetimibe, simvastatine, Lovastatine en niacine. De identificatie van cholesterol deeltjes met bolvormige en lineaire strand morphologies in de normale en dyslipidemia serummonsters suggereert dat deeltjes met soortgelijke morphologies in in vivo voorwaarden kunnen ontstaan. Eerdere studies gebleken dat de aanwezigheid van schijf en cholesterol van naald-achtige kristallen in de atherosclerotische plaques van ApoE– / – de mens en de LDLR– / – muizen modellen24,25,26 ,27,28.
De HDL-deeltjes circuleren in het bloed aanwezig zoals een heterogene mengsel en het niveau van kleine en grote HDL-deeltjes samen met functionele activiteit zijn belangrijke factoren om te oefenen hun cardio-beschermende effect via de reverse cholesteroltransport traject29,30. Recente studies hebben gewezen op het belang van de identificatie van de HDL cholesterol deeltje subfractions voor het ophelderen van hun rol in meerdere biologische functies zoals cholesterol efflux, anti-ontsteking, anti-trombotische en anti-oxidatieve31 . Daarnaast hebben een aantal studies het effect van therapie bij het vergroten van een laag om te matigen HDL-niveau in het plasma1,5,21lipide-verlagende gemeld. Dienovereenkomstig, de resultaten van deze studie geven nieuwe inzichten over morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes. Met name de detectie van een hoger niveau van lineaire gevormde HDL cholesterol deeltjes in de serummonsters van dyslipidemia onderwerpen suggereert dat ze kunnen de betrouwbare biomerker voor zowel diagnose en evaluatie van de gevolgen van het wijzigen van het lipide medicijnen in patiënten. Er is echter verder onderzoek vereist grote klinische monsters met de cholesterol deeltjes met verschillende morphologies en hun deelname aan CVD beter te begrijpen.
In de plaque matrix assay voor de behandeling van het effect van de drug op de vergadering van cholesterol deeltjes, gebruikten we 2 µg fluorescentie met cholesterol aggregaten en 5 µgof elke drug omdat het label: (1) drugs concurrerend binden aan beide fluorescentie label cholesterol en endogene lipiden aanwezig in het serummonsters; (2) van elk monster verkregen we 5.000 tot 10.000 cholesterol deeltjes die zijn gemonteerd in grote maten en vormen variërend van ~ 2-60 µ2; (3) we waargenomen een grote verschillen van drug reactie onder serummonsters geïncubeerd met de drugs (doses 300 ng 5 µg) en ~ 1-5% van hen geïncubeerd met hoge doses toonde geen waarneembare veranderingen in het profiel van de vorming van de deeltjes van de cholesterol; en (4) de interactie tussen cholesterol aggregaten en lipide-verlagende geneesmiddelen wordt gemedieerd door een niet-enzymatische proces. Vandaar, de concentraties van de in de test gebruikte reagentia kunnen hoger zijn dan hun fysiologische niveau.
Kortom, we met succes is gebleken dat de voordelen van een in vitro imaging methode beschreven in deze studie voor het bepalen van het effect van een breed spectrum van lipide-verlagende geneesmiddelen op het moduleren van de morfologie en de samenstelling van de cholesterol deeltjes. De aanpak van visualiseren en kwantificeren van de morfologie van lipide deeltjes door gebruik te maken van een constellatie van afbeelding analyse algoritmen kan zowel de diagnose van atherosclerose en te evalueren van de resultaten van lipide-verlagende therapie bij patiënten helpen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door een Plaxgen onderzoek subsidie aan SM (PLX-1008). Wij danken Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute voor het verzamelen van serummonsters van atherosclerose onderwerpen onder goedkeuring van de IRB.
TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
Human normal serum | Stanford Blood center | ||
LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
96-well microtitre plates | |||
Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |