इस अध्ययन का उद्देश्य कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान का नियमन करने में इन विट्रो लिपिड कम दवा प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । लिपिड कम दवाओं की तुलना कोलेस्ट्रॉल कणों की रूपात्मक सुविधाओं नियमन में उनके प्रभाव में भिन्नता का पता चला.
लिपिड कम दवाओं के साथ डिसलिपिडेमिया रोगियों का उपचार कम घनत्व लिपो (एलडीएल) स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है और उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन (एचडीएल) प्लाज्मा में कोलेस्ट्रॉल में वृद्धि के मध्यम स्तर के लिए एक कम है । फिर से, कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान और वितरण में फेरबदल में इन दवाओं की एक संभावित भूमिका खराब समझ है । यहाँ, हम कोलेस्ट्रॉल के संयोजन में पट्टिका सरणी विधि का उपयोग कर इमेजिंग प्रवाह cytometry के साथ रूपात्मक सुविधाओं का नियमन करने में लिपिड कम दवा प्रभाव का इन विट्रो मूल्यांकन का वर्णन. कोलेस्ट्रॉल कणों की छवि विश्लेषण संकेत दिया कि lovastatin, simvastatin, ezetimibe, और atorvastatin दोनों गोलाकार और रैखिक किनारा के आकार का कणों के गठन के लिए प्रेरित, जबकि नियासिन, fibrates, fluvastatin, और rosuvastatin प्रेरित केवल गोलाकार के आकार के कणों का गठन । अगले, शुद्ध बहुत कम घनत्व लिपोप्रोटीन (VLDL) और एलडीएल इन दवाओं के साथ मशीन के कणों की आकृति विज्ञान और कोलेस्ट्रॉल कण उपजनसंख्या की छवि बनावट में परिवर्तन दिखाया । इसके अलावा, ५० सीरम के नमूनों की स्क्रीनिंग डिसलिपिडेमिया के साथ विषयों में रैखिक आकार एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों की एक उच्च स्तर की उपस्थिति का पता चला (मतलब १८.३%) की तुलना में आयु-मिलान सामान्य (११.१%) नमूनों का मतलब. हम भी लिपिड के आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के नमूनों में गठन रैखिक कम करने पर दवा के प्रभाव में काफी बदलाव मनाया । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि लिपिड कम दवाओं, उनके सेल मध्यस्थता hypolipidemic प्रभाव के अलावा, सीधे कार्रवाई की एक गैर एंजाइमी तंत्र द्वारा कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान मिलाना हो सकता है. इन परिणामों के परिणामों के लिए atherosclerosis के निदान को सूचित करने की क्षमता है और इष्टतम लिपिड कम चिकित्सा की भविष्यवाणी ।
कई नैदानिक अध्ययन कम घनत्व लिपो के प्लाज्मा स्तर को कम करने में लिपिड कम दवाओं के लाभकारी प्रभाव का प्रदर्शन किया है (एलडीएल) कोलेस्ट्रॉल और उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन (एचडीएल) कोलेस्ट्रॉल, में वृद्धि के मध्यम स्तर को कम करने के लिए जो atherosclerosis-संबंधित प्रतिकूल हृदय घटनाओं1,2,3,4,5के प्राथमिक और माध्यमिक दोनों घटनाओं को रोकता है । Statins, HMG-CoA रिडक्टेस एंजाइम अवरोधकों के एक समूह, जिगर में ब्लॉक अंतर्जात कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण कि बारी नेतृत्व में रक्त6में एलडीएल कोलेस्ट्रॉल का स्तर कम घूम करने के लिए,7. इसी तरह, नियासिन के लिपिड कम प्रभाव hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, एक प्रमुख जिगर एंजाइम ट्राइग्लिसराइड संश्लेषण8में शामिल की अपनी प्रत्यक्ष और गैर प्रतिस्पर्धी निषेध द्वारा मध्यस्थता की है. तुलनात्मक रूप से, ezetimibe नीमन के लिए बाध्यकारी द्वारा exogenous कोलेस्ट्रॉल के अवशोषण को सीमित करके एलडीएल के प्लाज्मा स्तर को कम कर देता है-C1 की तरह 1 (NPC1L1) प्रोटीन छोटी आंत की उपकला कोशिकाओं में स्थित9. फेनोफ़िब्रते, एक और लिपिड कम करने की दवा, काफी ट्राइग्लिसराइड्स के प्लाज्मा सांद्रता कम कर देता है और यह भी मामूली peroxisome proliferator के माध्यम से एलडीएल कोलेस्ट्रॉल-सक्रिय रिसेप्टर्स मार्ग10घटाता है । इसके अलावा ओमेगा-3 फैटी एसिड की सूचना दी जाती है जो एंटी-atherosclerotic को एलडीएल11के प्लाज्मा लेवल को कम करने की अपनी क्षमता के कारण प्रभावित करती है ।
लिपिड कम दवाओं, एलडीएल कोलेस्ट्रॉल को कम करने पर अपने प्राथमिक प्रभाव के अलावा, एचडीएल स्तर को बढ़ाने, endothelial कार्यों में सुधार, सूजन को कम करने, और प्लेटलेट बाधा सहित लाभकारी pleiotropic प्रभाव की एक संख्या है समुच्चय12,13,14। हालांकि, एचडीएल कोलेस्ट्रॉल के कणों को बढ़ाने और उनकी संरचनात्मक सुविधाओं को संशोधित करने में इन दवाओं का अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आता । चूंकि इन दवाओं व्यापक रूप से atherosclerosis से संबंधित हृदय रोगों (सीवीडी) के इलाज के लिए निर्धारित कर रहे हैं, यह आगे रूपात्मक सुविधाओं और लिपिड कणों के वितरण का निर्धारण करने में उनकी संभव भूमिकाओं की जांच करने के लिए आवश्यक है । मानव प्लाज्मा lipidome लगभग ६०० अलग लिपिड और 22 विभिंन आकार, आकार, घनत्व, और रचनाओं में मौजूद है कि कोलेस्ट्रॉल के विभिंन आणविक प्रकार के होते है15,16,17 . ऐसे अल्ट्रा-केंद्रापसारक, एनएमआर, और ढाल जेल ट्रो के रूप में विश्लेषणात्मक तरीके एलडीएल और एचडीएल कणों और उनके उप अंश18,19की विशेषता के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, इन पद्धतियों के आवेदन के लिपिड कणों की आकृति विज्ञान और विधानसभा में दवाओं के प्रभाव का निर्धारण करने के उद्देश्य से अध्ययन करने के लिए सीमित है । प्रवाह cytometer आधारित पट्टिका सरणी एक कार्यात्मक जैव रासायनिक पता लगाने और सीरम व्युत्पंन लिपिड और amyloid पट्टिका कणों के दृश्य के लिए विकसित की परख है20। इस अध्ययन में वर्णित इन विट्रो इमेजिंग विधि के फायदे में परिवर्तन आकृति विज्ञान और बफर और सीरम नमूनों में कोलेस्ट्रॉल कणों के वितरण में लिपिड-नियमन दवा प्रभाव की पहचान सक्षम करें ।
1. फ्लोरोसेंट-लेबल कोलेस्ट्रॉल और लिपिड कम दवाओं की तैयारी
नोट: फ्लोरोसेंट-लेबल कोलेस्ट्रॉल समुच्चय और statins हमारे पिछले लेख में वर्णित के रूप में तैयार किया गया २१ . कृपया तालिका के विवरण के लिए, इमेजिंग प्रवाह cytometer, रसायन विज्ञान विश्लेषक, और इस अध्ययन में प्रयुक्त डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर देखें । Solubilize फ्लोरोसेंट-लेबल lyophilized कोलेस्ट्रॉल (1 mg, पूर्व/४९५ एनएम/507 एनएम) पाउडर में 1 मिलीलीटर १००% अल्कोहल. २,०४० x जी में 3 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक और घुलनशील प्रतिदीप्ति युक्त supernatants का उपयोग करें-पट्टिका सरणी परख में कोलेस्ट्रॉल समुच्चय लेबल । दवाओं की तैयारी के लिए , व्यक्तिगत रूप से solubilize पाउडर (2 मिलीग्राम) simvastatin, lovastatin, atorvastatin, ezetimibe, और ओमेगा-3 फैटी एसिड की 1 मिलीलीटर में १००% अल्कोहल । २,०४० एक्स जी में 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक के बाद , परख में दवाओं युक्त supernatants का उपयोग करें । इसी तरह, solubilize व्यक्तिगत पाउडर (2 मिलीग्राम) के fluvastatin, rosuvastatin, नियासिन, और fibrate में 1 मिलीलीटर पानी की एक स्टॉक समाधान करने के लिए 2 मिलीग्राम/mL. २,०४० x जी में 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक के बाद, पट्टिका सरणी परख में दवाओं युक्त supernatants का उपयोग करें ।
2. इन विट्रो में की जांच के लिए पट्टिका सरणी परख कोलेस्ट्रॉल कणों का गठन उपयोग रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 (सामग्री की तालिका देखें) को कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन के लिए पट्टिका सरणी परख स्थापित करने के लिए । एक गोल तल में परख प्रदर्शन, कम प्रोटीन बाध्यकारी ९६-अच्छी तरह से प्लेट 1 में तैयार एजेंट का उपयोग कर । २०० & #181 पर प्रत्येक कुआं में अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा बनाए रखें L और तपसिल. में सभी परख प्रदर्शन पहले, लोड १९४.५ & #181; प्रत्येक कुआं को फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के एल. हर कुआं को जोड़ने के लिए, २.५ & #181; L (5 & #181; g) प्रत्येक लिपिड कम करने वाली दवा समाधान के लिए और 30 एस के लिए यह रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर एक समान रूप से समाधान में दवा मिश्रण द्वारा प्लेट हिला । कोई दवा नकारात्मक नियंत्रण नमूने के लिए जोड़ा जाता है । तत, add 2 & #181; L (2 & #181; छ) फ्लोरोसेंट-लेबल कोलेस्ट्रॉल कुल प्रत्येक अच्छी तरह से हल करने के लिए और 30 एस के लिए प्लेट हिला रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर । ३७ & #176 पर 2 ज सेट के लिए एक प्रयोगशाला शेखर पर थाली मशीन, सी और २०० rpm. के बाद, इमेजिंग प्रवाह cytometry. द्वारा कणों की छवियों का अधिग्रहण
3. इमेजिंग प्रवाह का उपयोग कोलेस्ट्रॉल कणों की छवियों पर कब्जा Cytometry सही साधन सेटिंग्स लोड करने के लिए डेटा प्राप्ति टेम्पलेट खोलें । Click & #34; फाइल & #34;, तब select & #34; ओपन टेम्पलेट & #8230; & #34; और टेम्पलेट फ़ाइल का चयन करें. Click & #34; फ्लश, लॉक, लोड & #34; नमूना लोडिंग के लिए साधन तैयार करने के लिए । जब द & #34; लोड नमुना & #34; संवाद बॉक्स खुलता है, तो क्लिक करें & #34; ok & #34; लोड करने के लिए ५० & #181; L खंड 2 में तैयार किए गए प्रत्येक कुआं से नमूनों का इमेजिंग फ्लो cytometer. & #34; रन क | सेटअप & #34; वास्तविक समय में इमेजिंग क्षेत्र में कणों को देखने के लिए. जब इमेजिंग क्षेत्र में कण अच्छे फोकस में हों तो क्लिक करें & #34; रन | मोल & #34; प्रत्येक ऑब्जेक्ट की छवियों को एक साथ डार्क फील्ड (साइड स्कैटर/एसएससी), ब्राइट फील्ड (BF), ग्रीन प्रतिदीप्ति और येलो प्रतिदीप्ति के लिए एक उच्च-प्रवाह तरीके से प्राप्त करने के लिए । दोहराएँ चरण ३.२-३.५ प्रत्येक नमूना से ५,०००-१०,००० कणों को प्राप्त करने के लिए. वस्तु प्रतिदीप्ति तीव्रता और रूपात्मक रूपांतरों का निर्धारण करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग सभी कच्चे छवि फ़ाइलों का विश्लेषण । क्लिक करें & #34; tools & #34; बटन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के शीर्ष पर, फिर चुनें & #34; बैच डाटा फाइल & #34; ड्राप-डाउन मेन्यू से, जो खुलेगा & #34; बैचों & #34; window. & #34; बैचेस & #34; विंडो, क्लिक करें & #34; जोड़ें बैच & #34; बटन, जो खुलेगा & #34;D efine एक बैच & #34; window. & #34;D efine a बैच & #34; विंडो, क्लिक करें & #34; फ़ाइलें जोड़ें & #34; बटन और raw छवि फ़ाइलों का चयन करें, & #34; टेम्पलेट & #34; बटन और उपयुक्त डेटा विश्लेषण टेम्पलेट फ़ाइल चुनें, फिर चयन & #34; OK & #34; और & #34; Submit बैचेस & #34; प्रसंस्करण और रॉ छवि फ़ाइलों का विश्लेषण शुरू करने के लिए ।
4. पट्टिका सरणी परख लिपिड के मूल्यांकन के आधार पर शुद्ध कोलेस्ट्रॉल कणों पर प्रभाव कम है चरण २.१ में वर्णित के रूप में, कोलेस्ट्रॉल कणों का गठन शुद्ध VLDL, एलडीएल, और एचडीएल लिपो कणों का उपयोग परख प्रदर्शन/ एक ९६-अच्छी तरह से थाली में पट्टिका सरणी परख करते हैं । सबसे पहले, पंजाबियों के साथ सभी कुओं का भार; एक २०० & #181 का उपयोग करें; L एक अच्छी तरह के लिए अंतिम मात्रा. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, जोड़ें 4 & #181; जी VLDL, एलडीएल, या एचडीएल प्रोटीन/कणों व्यक्तिगत रूप से एक अच्छी तरह से दवाओं के बिना और 30 एस के लिए थाली हिला लिपिड कम दवा प्रभाव की जांच के लिए , जोड़ 4 & #181; जी VLDL, एलडीएल, या एचडीएल प्रोटीन/कणों को व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक अच्छी तरह से और 30 एस के लिए प्लेट हिला कुओं के लिए 4 & #181 के साथ जोड़ा गया; g VLDL, एलडीएल, या एचडीएल, add २.५ & #181; L (5 & #181; g) ezetimibe, lovastatin, simvastatin, या नियासिन समाधान और 30 एस के लिए प्लेट हिलाकर इसे केमिस्ट्री विश्लेषक-1 में रखकर शेक करें. तत, add 2 & #181; L (2 & #181; छ) प्रतिदीप्ति-लेबल कोलेस्ट्रॉल कुल सभी कुओं के लिए समाधान और 30 एस के लिए यह रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर प्लेट हिला । एक लैब शेखर में 2 ज के लिए थाली ३७ & #176 पर सेट; सी और २०० आरपीएम. चरण ३.१-३.५ के बाद इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग कर नमूने प्राप्त करें । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रॉ छवि फ़ाइलों का विश्लेषण के रूप में ३.७ कदम में वर्णित है । विश्लेषण टेम्पलेट में, कोलेस्ट्रॉल कण उपजनसंख्याों की पहचान के लिए निम्न गेटिंग योजना का उपयोग करें. ग्रीन चैनल के एक भूखंड पर संतृप्त पिक्सेल गिनती (x-अक्ष) और डार्क फील्ड चैनल संतृप्त पिक्सेल गिनती (y-अक्ष), या तो चैनल में एक या अधिक संतृप्त पिक्सल के साथ वस्तुओं को अस्वीकार. साजिश ग्रीन चैनल तीव्रता (x-अक्ष) और एसएससी तीव्रता (y-अक्ष) का उपयोग कर संतृप्त पिक्सल के बिना वस्तुओं के कण: वस्तुओं अपने ग्रीन चैनल और एसएससी के आधार पर तीन क्षेत्रों (VLDL, एलडीएल, एचडीएल) के एक में आते हैं । नोट: इन गेट्स नियंत्रण प्रयोगों से उत्पंन डेटा के आधार पर बनाया गया शुद्ध VLDL, एलडीएल, और एचडीएल कणों का उपयोग/ प्रत्येक नमूने के लिए लिपिड कम दवा प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, कुल लिपोप्रोटीन कणों सांद्रता की गणना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक उपजनसंख्या का प्रतिशत (VLDL, एलडीएल, एचडीएल) चरण ६.५ में वर्णित के रूप में. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कण सांद्रता (कणों/एमएल) की गणना: नोट: VLDL डॉट में गेटिंग, एलडीएल, और एचडीएल प्रतिदीप्ति क्षेत्रों-साजिश का पता लगाने ~ उनके संबंधित उपआबादी का ८०%, और शेष ~ कणों के 20% अंय गेटिंग क्षेत्रों के साथ ओवरलैप ।
5. सीरम नमूनों में लिपिड सांद्रता का मापन एलडीएल, एचडीएल, कोलेस्ट्रॉल, और ट्राइग्लिसराइड्स के रसायन विज्ञान विश्लेषक-2 के द्वारा निर्धारित करने के लिए, सीरम नमूनों का उपयोग करने के लिए आयु-मिलान सामान्य और डिसलिपिडेमिया विषयों से प्राप्त. एलडीएल, एचडीएल, कोलेस्ट्रॉल की असामान्य एकाग्रता को परिभाषित, और ट्राइग्लिसराइड्स सीरम नमूनों में ऊपरी और निचले संदर्भ मूल्यों से परे की पहचान की उनकी एकाग्रता के आधार पर. सामांय संदर्भ मान का पालन करें recommended रिएजेंट निर्माता द्वारा: कोलेस्ट्रॉल (4-200 मिलीग्राम/dl), एचडीएल (३.०-६५ mg/dl), एलडीएल (4-100 mg/dl), और ट्राइग्लिसराइड्स (9-200 mg/) सीरम नमूने है कि या तो कम संदर्भ मूल्य या कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड्स के लिए उच्च संदर्भ मूल्य से ऊपर के रूप में एक असामान्य मूल्य है की पहचान, और उपस्थिति और लिपिड कम दवाओं की अनुपस्थिति में स्क्रीनिंग के लिए उन्हें का उपयोग करें.
6. सीरम नमूनों में कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन पर दवाओं के प्रभाव का विश्लेषण सीरम नमूने में कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन के लिए पट्टिका सरणी परख स्थापित करने के लिए रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 का उपयोग करें । एक गोल तल में परख प्रदर्शन, कम प्रोटीन बाध्यकारी ९६-अच्छी तरह से थाली । २०० & #181 की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा का प्रयोग करें; L/ठीक है और तपसिल. में सभी परख प्रदर्शन एक stepwise तरीके से रिएजेंट लोड करके प्लेट तैयार करते हैं । कंट्रोल वेल्स तैयार करते हैं. लोड १९३ & #181; प्रत्येक वेल को पंजाबियों के एल. जोड़ें २.५% (v/v) रोगी सीरम (केवल एक सीरम नमूना प्रति अच्छी तरह से) और यह रसायन विज्ञान विश्लेषक प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर 30 एस के लिए थाली हिला । Add 2 & #181; L (2 & #181; g) के प्रतिदीप्ति-लेबल कोलेस्ट्रॉल समग्र समाधान में एक अच्छी तरह से और एक रसायन विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर 30 एस के लिए थाली हिला । औषधियों से कुएँ तैयार करते हैं. लोड १९१ & #181; प्रत्येक वेल को पंजाबियों का एल. जोड़ें २.५% (v/v) रोगी सीरम (केवल एक सीरम नमूना प्रति अच्छी तरह से) और एक रसायन विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर 30 एस के लिए थाली हिला । Add 2 & #181; L ezetimibe, lovastatin, simvastatin या नियासिन समाधान (4 & #181; g) सभी कुओं को छोड़कर नकारात्मक नियंत्रण कुओं. अच्छी तरह से प्रति केवल एक दवा जोड़ें और एक रसायन विश्लेषक-1 रिएक्शन प्लेट पर रखकर 30 एस के लिए थाली हिला । Add 2 & #181; प्रतिदीप्ति के एल-लेबल कोलेस्ट्रॉल कुल समाधान (2 & #181; g) में प्रत्येक अच्छी तरह से और 30 एस के लिए प्लेट हिला रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर । लोड दवाओं के बाद ही सभी कुओं (नियंत्रण और दवा का इलाज) उनके संबंधित सीरम के नमूनों के साथ लोड किया गया है, और इस कदम के अंत में प्रतिदीप्ति-लेबल कोलेस्ट्रॉल जोड़ें. एक प्रयोगशाला में ३७ & #176 पर सेट शेखर में 2 ज के लिए थाली मशीन, सी और २०० rpm । चरण ३.१-३.६ में वर्णित निम्न सेटिंग्स इमेजिंग प्रवाह cytometer द्वारा नमूने प्राप्त करें । चरण ३.७ में वर्णित के रूप में एक ही टेम्पलेट का उपयोग कर सभी छवि फ़ाइलें संसाधित बैच के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । चरण ४.५ और ४.६ में वर्णित के रूप में प्लॉट पर गेट्स आरेखण द्वारा डेटा विश्लेषण निष्पादित करें । लिपिड कम दवा प्रभाव का निर्धारण करने के लिए/प्रतिक्रिया (कम, मध्यम, और उच्च) प्रत्येक नमूने के लिए, कुल लिपोप्रोटीन कण एकाग्रता की गणना, साथ ही कुल कणों का प्रतिशत VLDL के शामिल, एलडीएल, और एचडीएल उपलोकसंख्या. प्लाट द VLDL, एलडीएल, और एक वस्तु के हिस्टोग्राम पर एचडीएल आबादी & #39; एस उज्ज्वल क्षेत्र छवि, लंबाई से घटाई चौड़ाई (लंबाई-चौड़ाई), और या तो गोलाकार या रैखिक क्षेत्रों में फाटक: (लंबाई चौड़ाई) के साथ वस्तुओं & #8804; 2 & #160; & #181; मीटर में गिरावट गोलाकार और रैखिक आकार का कणों का प्रतिशत की गणना के लिए गोलाकार क्षेत्र. गोलाकार और रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल प्रत्येक सीरम नमूना के साथ और प्रत्येक दवा के बिना के लिए पहचाने कणों का प्रतिशत की तुलना करें । प्रत्येक सीरम नमूने के लिए प्राप्त तपसिल मानों के बीच, गोलाकार और रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कणों कि एसडी & #177 के भीतर गिर का प्रतिशत स्वीकार करते हैं; दवा प्रभाव के निर्धारण के लिए 2 रेंज.
सामांय में, VLDL, एलडीएल, और रक्त परिसंचरण में एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के वितरण और कार्यात्मक गुण मुख्य रूप से चयापचय, आनुवंशिक, महामारी विज्ञान, सेलुलर, और प्लाज्मा कारकों द्वारा निर्धारित कर रहे हैं22,23. वर्तमान अध्ययन में, बफर में लिपिड संशोधित दवाओं के प्रभाव की जांच से पता चला कि अत्यधिक lipophilic दवाओं जैसे ezetimibe, lovastatin, simvastatin, और atorvastatin कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान पर एक उच्च स्तर की जटिलता प्रेरित उच्च हाइड्रोफिलिक rosuvastatin और fluvastatin दवाओं के साथ मनाया निचले स्तर प्रभाव की तुलना में । इन परिणामों को हमारे पिछले एक गैर एंजाइमी तंत्र का वर्णन के साथ अच्छे समझौते में है statins के आधारित प्रभाव मॉडुलन में एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों गठन बफर और सीरम नमूने में21. तदनुसार, वर्तमान अध्ययन से परिणाम ezetimibe, नियासिन, fibrate, और ओमेगा-3 फैटी एसिड दवाओं है कि कोलेस्ट्रॉल कण गठन नियमन में एक प्रत्यक्ष भूमिका निभा सकता है की कार्रवाई के एक गैर एंजाइमी तंत्र का पता चला । यह संभव है कि दवाओं और कोलेस्ट्रॉल समुच्चय के बीच बातचीत के बड़े आकार के विधानसभा कोलेस्ट्रॉल कणों की ओर जाता है कि 2-60µm2, प्रदर्शन गोलाकार और रैखिक कतरा morphologies हैं ।
इसके अलावा, शुद्ध लिपोप्रोटीन कणों का उपयोग कर प्राप्त परिणामों कोलेस्ट्रॉल समुच्चय और VLDL, एलडीएल सहित प्लाज्मा कारकों के बीच बातचीत का सुझाव है, और एचडीएल प्रोटीन कि रचनाओं और कोलेस्ट्रॉल के रूपात्मक गुणों को बदल सकता है कणों. दवा उपचार के परिणाम शुद्ध लिपोप्रोटीन कणों को शामिल एक उच्च स्तर पर दवा प्रभाव VLDL कणों गठन पर उनके प्रभाव की तुलना में संकेत दिया एलडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों गठन पर मनाया. lovastatin, simvastatin, और ezetimibe दवाओं समर्थक दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया और परख में उनकी खुराक शारीरिक सांद्रता से अधिक हो सकता है ।
दिलचस्प है, सीरम नमूनों की स्क्रीनिंग VLDL, एलडीएल, और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन, रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कणों के संरचनाओं पर विशेष रूप से उनके प्रभाव के प्रोफाइल बदलने पर दवा प्रभाव के रूपांतरों दिखाया । इन दवाओं में रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों गठन दोनों डिसलिपिडेमिया और उम्र में सामान्य सीरम नमूने मिलान में कमी प्रेरित किया । दवा प्रभाव रेखीय आकार के कणों के गठन को कम करने पर मनाया simvastatin, ezetimibe, lovastatin, और नियासिन में उच्च था । गोलाकार और रैखिक किनारा morphologies के साथ कोलेस्ट्रॉल कणों की पहचान सामान्य और डिसलिपिडेमिया सीरम नमूनों में पता चलता है कि समान morphologies के साथ कणों में vivo शर्तों में फार्म कर सकते हैं. पिछले अध्ययनों से मानव और ApoE के atherosclerotic सजीले टुकड़े में डिस्क और सुई की तरह कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल की उपस्थिति की पहचान की है-/ और LDLR-/ चूहों मॉडल24,25,26 ,27,28.
रक्त में घूम एचडीएल कणों एक विषम मिश्रण के रूप में मौजूद है और कार्यात्मक गतिविधि के साथ साथ छोटे और बड़े आकार एचडीएल कणों के स्तर पर रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन के माध्यम से अपने कार्डियो सुरक्षात्मक प्रभाव डालती करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं मार्ग२९,३०. हाल के अध्ययनों से कोलेस्ट्रॉल समाप्ति, विरोधी सूजन, विरोधी थ्रोम्बोटिक, और विरोधी oxidative के रूप में कई जैविक कार्यों में उनकी भूमिका elucidating के लिए एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कण उपभागों की पहचान के महत्व पर प्रकाश डाला है31 . इसके अलावा, अध्ययनों की एक संख्या प्लाज्मा1,5,21में एचडीएल के मध्यम स्तर को बढ़ाने में लिपिड कम चिकित्सा के प्रभाव की सूचना दी है । तदनुसार, इस अध्ययन से परिणाम कोलेस्ट्रॉल कणों की रूपात्मक सुविधाओं पर नए अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, डिसलिपिडेमिया विषयों के सीरम नमूनों में रैखिक आकार एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के एक उच्च स्तर का पता लगाने के लिए कि वे दोनों निदान और रोगियों में लिपिड को संशोधित करने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए विश्वसनीय मार्कर हो सकता है पता चलता है. हालांकि, आगे की जांच के लिए बड़ी नैदानिक नमूनों का उपयोग करने के लिए बेहतर अलग morphologies और सीवीडी के लिए उनके सहयोग के साथ कोलेस्ट्रॉल कणों को समझने की आवश्यकता है ।
कोलेस्ट्रॉल कणों की विधानसभा पर दवा प्रभाव की जांच के लिए पट्टिका सरणी परख में, हम प्रतिदीप्ति के 2 µ जी इस्तेमाल किया कोलेस्ट्रॉल समुच्चय और 5 µ गोफ प्रत्येक दवा क्योंकि: (1) दवाओं प्रतियोगी दोनों प्रतिदीप्ति लेबल कोलेस्ट्रॉल के लिए बाध्य और अंतर्जात लिपिड सीरम नमूनों में मौजूद; (2) प्रत्येक नमूने से, हम ५,००० करने के लिए १०,००० कोलेस्ट्रॉल कणों कि बड़े आकार और आकार से लेकर ~ 2-60µ2 में इकट्ठे कर रहे हैं हासिल कर लिया; (3) हम सीरम दवाओं के साथ मशीन के नमूनों के बीच दवा की प्रतिक्रिया की एक विस्तृत विविधताओं मनाया (खुराक ३०० 5 µ जी को एनजी) और उनमें से ~ 1-5% उच्च खुराक के साथ मशीन कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन के प्रोफ़ाइल में कोई जासूसी परिवर्तन दिखाया; और (4) कोलेस्ट्रॉल समुच्चय और लिपिड कम दवाओं के बीच बातचीत एक गैर एंजाइमी प्रक्रिया द्वारा मध्यस्थता है । इसलिए, परख में इस्तेमाल किया एजेंट की सांद्रता उनके शारीरिक स्तर से अधिक हो सकता है ।
अंत में, हम सफलतापूर्वक एक इन विट्रो इमेजिंग विधि के लाभ का प्रदर्शन किया है लिपिड के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस अध्ययन में वर्णित-आकृति विज्ञान और कोलेस्ट्रॉल की संरचना मॉडुलन पर-कम दवाओं कणों. visualizing और छवि विश्लेषण एल्गोरिदम का एक नक्षत्र को रोजगार के द्वारा लिपिड कणों की आकृति विज्ञान को बढ़ाता के दृष्टिकोण दोनों atherosclerosis के निदान में मदद कर सकते है और रोगियों में लिपिड कम चिकित्सा के परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक Plaxgen अनुसंधान द्वारा वित्त पोषित किया गया था एसएम (PLX-१००८) को संमानित किया अनुदान । आईआरबी की मंजूरी के तहत atherosclerosis विषयों से सीरम के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए हम पालो ऑल्टो मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन रिसर्च इंस्टीट्यूट को धन्यवाद देते हैं ।
TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
Human normal serum | Stanford Blood center | ||
LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
96-well microtitre plates | |||
Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |